专利名称：抑制恶性肿瘤细胞的侵袭和转移及血管生成的重组蛋白质分子的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于抑制恶性肿瘤细胞的侵袭和转移及血管生成的重组蛋白质分子和编码这种重组蛋白质分子的核酸。
背景技术：
恶性肿瘤细胞最显著的特征是侵袭和转移，胞外基质降解是肿瘤细胞侵袭和转移之关键。胞外基质降解是由参与肿瘤细胞侵袭的不同细胞类型所分泌的蛋白酶发起，每种已知的蛋白酶的表达和活性的增加都与恶性生长及肿瘤的侵袭有联系。过去的10年所进行的研究揭示，基质金属蛋白酶(MMPs)在肿瘤侵袭中起着关键的作用，肿瘤部位高水平的MMPs是与肿瘤的恶性程度密切相关的。
MMP-2(明胶酶A，72kDa)由一系列正常的和转化的细胞表达。MMP-9(明胶酶B，92kDa)在角质细胞、单核细胞、腺泡巨噬细胞、多型核白细胞及各种恶性生长细胞中表达。MMP-2和MMP-9能降解I、IV、V、VII、X、XI和XIV型胶原、明胶、弹力蛋白、蛋白聚糖、髓鞘碱性蛋白、纤连蛋白、原纤蛋白-1，还作用于胞外基质中许多活性成分；MMP-2并通过蛋白酶解来激活MMP-9和MMP-13。
MMP-2是最早一个被鉴定出与基底膜降解和肿瘤转移相关的基质金属蛋白酶。在乳腺癌和前列腺癌症中，从细胞发育异常到原位癌再到侵袭过程中，MMP-2水平是增加的；有淋巴结扩散的高级别乳腺癌MMP-2激活率是非同寻常的高。在支气管鳞状癌变病灶发展进程中，从基底细胞增生、组织变形、异常发育、原位癌到侵袭性癌，MMP-9的免疫反应性是增加的，说明了MMP-9在基底膜重塑和癌发生中的重要性；在非小细胞肺癌，MMP-9表达是与不良预后相关的。
目前已经开发了很多针对MMPs的金属蛋白酶抑制剂，最新方法是采用噬菌体展现技术筛选与MMP-2和MMP-9特异结合的抑制剂。1999年，美国加州Bernham研究所Ruoslahei实验室筛选出一个环十肽(CTTHWGFTLC)，它集三种功能于一身a，选择性地有效抑制MMP-2和MMP-9；b，抑制肿瘤细胞和内皮细胞的转移；c，靶向正在生成的血管。在动物模型上，该肽能防止肿瘤生长和浸润并延长荷瘤小鼠的生存(Koivunen E.，et al.，Tumor targeting with a selective geletinase inhibitor.NatBiotech 1999，17768-774)。
血管生成是从预先存在的血管形成新毛细血管的过程，除了在生理性的胚胎发育、子宫内膜生长、骨形成等过程中起作用外，它还牵涉到病理性的肿瘤发生、糖尿病视网膜病变、风湿性关节炎等病症。研究证明肿瘤的生长及转移均仰赖于血管生成，它一方面借助新生血管获得充分的营养供给，另一方面通过血管进行转移和扩散。因此抗血管生成是一种行之有效的抗癌治疗方略。
血管生成的调节是由促进血管生成的因子和抑制血管生成的因子之间的平衡决定的。肿瘤细胞通过分泌成纤维生长因子(FGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、血管生成素(angiopoietin)等多种因子促进血管生成；而机体同时还产生内源性的抑制血管生成因子，如血小板反应素(thromspondin)、内皮抑素、血管抑素、血管内皮生长抑制因子(VEGI)等。肿瘤组织产生的促血管生成因子超过负性的抑制因子的作用时，致使肿瘤血管持续新生；若增加抑制因子的量，抑制因子水平足够高时，正性因子信号被压倒，血管生成受阻。目前已经开发了一批化学合成或生物工程方法生产的血管生成抑制剂，美国NCI有几十项I、II、III期临床试验在进行当中。
血管内皮生长抑制因子(VEGI)基因是1997报道的，1999年发现VEGI是由内皮细胞产生的有效的负性调控因子(Yue TL，et al.TL1，a novel tumornecrosis factor-like cytokine，induces apoptosis in endothelial cells.J.Biol.Chem.1999，2741479-1486)。VEGI由174个氨基酸组成，与肿瘤坏死因子TNFα和β具有20％-30％的同源性，因此归于TNF超家族，属于II型跨膜蛋白。N端前25个氨基酸为高度疏水性的胞内区和跨膜区，C端26-174氨基酸为胞外区。Zhai等证明大肠杆菌表达的胞外区具有抑制内皮细胞增殖的作用，表达分泌型VEGI的小鼠结肠癌细胞的成瘤率显著降低(Zhai YF.，et al.VEGI，a novel cytokine of the tumor necrosis factorfamily，is an angiogenesis inhibitor that suprpresses the growth of coloncarcinomas in vivo.FASEB J.1999，13181-189)。
目前常见的血管生成抑制剂只具备单一功能，如内皮抑素和血管抑素影响内皮细胞功能，金属蛋白酶抑制剂抑制内皮细胞与胞外基质的相互作用。
发明内容
为了开发更加高效的血管生成抑制剂，本发明的一个目的是提供一种用于抑制恶性肿瘤细胞的侵袭和转移及血管生成的重组蛋白质分子。
本发明的另一个目的是提供一种编码本发明的重组蛋白质分子的核酸。
本发明的再一个目的是提供一种生产本发明的用于抑制恶性肿瘤细胞的侵袭和转移及血管生成的重组蛋白质分子的方法。
本发明的又一个目的是提供用于抑制恶性肿瘤细胞的侵袭和转移及血管生成的重组蛋白质分子的应用。
本发明提供了一种用于抑制恶性肿瘤细胞的侵袭和转移及血管生成的重组蛋白质分子，该重组蛋白质分子是抑制金属蛋白酶的环十肽CTTHWGFTLC与血管内皮生长抑制因子VEGI相连而构成嵌合分子。
在本发明的上述嵌合分子中，对抑制金属蛋白酶的环十肽CTTHWGFTLC与血管内皮生长抑制因子VEGI之间的连接方式没有特别限定，可以是直接连接，也可以是通过一个间隔序列连接。最好是通过一个间隔序列连接。这一间隔序列最好是不影响环十肽和VEGI的空间结构的间隔序列。例如GGGG，QMPP等。最好是通过间隔序列QMPP相连的在本发明的上述嵌合分子中，其中的血管内皮生长抑制因子VEGI可以是完整分子，也可以是截除了N末端的膜结合区域的截短形式的VEGI。最好是截除了N端22-35个氨基酸的截短形式。
本发明的优选的嵌合分子具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
本发明还提供了一种编码用于抑制恶性肿瘤细胞的侵袭和转移及血管生成的重组蛋白质分子的核酸分子，所述的重组蛋白质分子是抑制金属蛋白酶的环十肽CTTHWGFTLC与血管内皮生长抑制因子VEGI相连而构成嵌合分子。
在本发明的核酸分子编码的用于抑制恶性肿瘤细胞的侵袭和转移及血管生成的重组蛋白质分子中，抑制金属蛋白酶的环十肽CTTHWGFTLC与血管内皮生长抑制因子之间最好是通过间隔序列QMPP相连的。
在本发明的核酸分子编码的用于抑制恶性肿瘤细胞的侵袭和转移及血管生成的重组蛋白质分子中，血管内皮生长抑制因子最好是截除了N端22-35个氨基酸的截短形式。
在本发明的核酸分子编码的用于抑制恶性肿瘤细胞的侵袭和转移及血管生成的重组蛋白质分子最好具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
在本发明的核酸分子最好具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
本发明还提供了一种用于生产抑制恶性肿瘤细胞的侵袭和转移及血管生成的重组蛋白质分子的方法，包括用权利要求5所述的核酸分子构建表达载体，并将该表达载体在适当的宿主细胞中进行表达的步骤。
在本发明的方法中，所述的核酸分子编码的用于抑制恶性肿瘤细胞的侵袭和转移及血管生成的重组蛋白质分子中，抑制金属蛋白酶的环十肽CTTHWGFTLC与血管内皮生长抑制因子之间最好是通过间隔序列QMPP相连的。
在本发明的方法中，所述的核酸分子编码的用于抑制恶性肿瘤细胞的侵袭和转移及血管生成的重组蛋白质分子中，血管内皮生长抑制因子最好是截除了N端22-35个氨基酸的截短形式。
在本发明的方法中，所述的核酸分子编码的用于抑制恶性肿瘤细胞的侵袭和转移及血管生成的重组蛋白质分子最好具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
在本发明的方法中，所述的核酸分子最好具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
本发明还提供了所述的抑制恶性肿瘤细胞的侵袭和转移及血管生成的重组蛋白质分子在制备治疗恶性肿瘤的药物中的应用。
在本发明的一个优选实施方案中，首先采用PCR方法将CTTHWGFTLC相应的核苷酸与VEGI的功能区密码相连接，构成一个嵌合的DNA分子，命名为V+。将V基因克隆于原核表达载体上，在大肠杆菌中进行表达和纯化；另外还将V+克隆于真核表达载体，在真核细胞中进行表达及纯化。最后用纯化的蛋白进行生物学活性和功能分析。
附图简要说明
图1是PCR扩增得到的V+片断，其中，MλDNA/EcoRI+HindIII分子量标准1PCR扩增的500bp V+；图2是原核表达载体pHTV+的结构简图；图3是原核表达载体pHTV+的酶切鉴定图MλDNA/EcoR I+HindIII分子量标准 1HTV+BamHI+EcoRI双酶切；图4是V+的碱基序列和氨基酸序列。根据测序结果得到V+核苷酸顺序和推断的氨基酸顺序如图所示。图中M是为下一步表达蛋白而加上的甲硫氨酸，阴影部分是人工设计的金属蛋白酶抑制剂和伸展肽部分，其余是VEGI Pro23至终止密码处，与NCBI公布的序列没有差异；图5是大肠杆菌表达的V+纯化过程中的SDS-PAG电泳检测。M蛋白质低分子量标准(14，20，31，45，66，97kD)1上柱前的HTV+超声裂解液2穿柱液30mmol/L咪唑洗杂蛋白420mmol/L咪唑洗杂蛋白560mmol/L咪唑洗杂蛋白6200mmol/L咪唑洗脱得到纯化的V+；图6是真核表达载体pc4V-和pc4V+的结构简图；图7是真核细胞表达纯化的V-、V+检测结果1纯化的20kD V-2纯化的22kD V+；图8表示纯化的V-、V+对猪内皮细胞增殖的抑制作用；图9是纯化的V-、V+对肿瘤细胞和内皮细胞转移的抑制率；图10是纯化的V-、V+对金属蛋白酶MMP-2活性的抑制1PBS对照2V-不影响MMP-2活性3V+抑制MMP-2活性；图11表示原核表达的V+对Lewis肺癌生长的影响；A不同剂量HTV+对Lewis肺癌肿瘤生长的影响；B不同组别Lewis肺癌肿瘤的重量统计；图12 Lewis肺癌肿瘤组织病理切片(HE染色，200×)；A 10mg/L组Lewis肺癌组织；B对照组Lewis肺癌组织，箭头示血管；实施例(1)PCR方法获得V+DNA分子按照VEGI的N端23位氨基酸以后序列和C末端氨基酸序列设计引物，上游引物为5’-GCGGGATCCATGTGTACAACTCACTGGGGTTTCACACTTTGCCAAATGGCTCCAGTTGTGAGACAAACT-3’，含有3个保护碱基，BamHI位点(下划线)、起始密码、10个突变氨基酸CTTHWGLTLC相对应密码、间隔序列QMPP相应的密码和VEGI的23位以后氨基酸编码序列。下游引物为5’-CGCGAATTCGATATTTGCTCTCCTCTATAG-3’，是与VEGI的C端编码序列互补序列，并引入EcoRI位点(下划线)。以人基因组DNA作模板进行PCR扩增，PCR反应条件为98℃变性5分钟，94℃40秒，60℃60秒，72℃60秒，共30个循环，72℃保温10分钟。PCR扩增后经电泳检查可见到500bp V+条带(图1)。
(2)原核表达载体pHTV+的构建扩增后片断克隆到Promega公司的pGEM-T载体上，得到pT-V+。用BamHI和EcoRI双酶切，回收V+片断，与预先经BamHI和EcoRI双酶切的表达载体pPRoEXTMHTb(购自Gibcol BRL公司)相连接，得到大肠杆菌表达质粒pHTV+(图2)，经BamHI和EcoRI酶切鉴定能切出500bp插入片断(图3)。测序表明V+基因正确无误(图4)。
(3)V+在大肠杆菌中的表达和纯化将pHTV+转化至大肠杆菌BL21(DE3)(购自华美公司)，挑取单菌落在含氨苄青霉素的LB培养基中于37℃培养至OD600＝0.5～0.6时，加入终浓度为1mmol/L的IPTG诱导表达3小时后，离心收集菌体，重悬于含0.5％Triton X-100的缓冲液A(50mmol/L Tris-Cl，pH7.9，150mmol/L NaCl，10％甘油)中超声破碎洗涤包涵体2次。将包涵体溶解于含6mol/L盐酸胍的缓冲液A中，经Ni2+柱进行亲和层析，分别用含0、20、60mmol/L咪唑的缓冲液A洗去杂蛋白，最后用含200mmol/L咪唑的缓冲液A洗脱目的蛋白V+(图5)。洗脱的蛋白在50mmol/L Tris-Cl，pH7.9，150mmol/NaCl，10％甘油，1mmol/L GSH，0.1mmol/L GSSG中复性，对PBS透析。在复性处理过程中，随着变性剂浓度的降低，V+蛋白质以不溶状态逐渐沉淀下来，蛋白质重折叠效率极低。
(4)真核表达载体的构建真核表达载体构建方法与原核表达载体构建方法相同，将V+插入Invitrogen公司的载体pcDNA4/HisMax后得到表达载体命名为pc4V+。为了对比改进后的嵌合蛋白与未改进的VEGI(简称V-)，将VEGI23-174基因克隆到pcDNA4/HisMax，得到的载体命名为pc4V-(图6)。
(5)真核表达融合蛋白并纯化按Invitrogen公司转染试剂Lipofectamine 2000产品说明书将pc4V-和pc4V+质粒分别转染1×107COS细胞(购自中国医学科学院细胞中心)，48小时后收获细胞，加入800μl含46mmol/L辛基葡糖苷的缓冲液A，室温下裂解细胞20分钟，离心后将上清透析后过Ni2+柱进行亲和层析，方法同上。通过Western方法可以检测到纯化的V-和V+。
(6)V+的生物学活性V+抑制体外血管内皮细胞增殖采用真核细胞表达的纯化的V-和V+研究其对内皮细胞增殖的影响，方法是将猪内皮细胞以6×103/孔接种于96孔板中，在含20％FBS的M199培养液中培养24小时，然后换为含有待测药物的M199培养液，再培养24小时。将Promega公司的96孔细胞增殖单一检测液(目录号G3582)室温下融化，吸取20μl加入待测样品中，于37培养箱孵育1-4小时。在酶标仪上读取490nm光吸收值。结果1nM的V-对内皮细胞抑制率达87％，V+是70％；2nM的V-和V+同样达到98％的抑制率(t检验，P＜0.05)(图8)。可见，V+低浓度时作用迟缓，稍高浓度时到达高效抑制作用。因此，经过改进的V+与V-一样具备抑制内皮细胞增值的功能。
抑制肿瘤细胞和内皮细胞转移Transwell小室是检测细胞随机转移的常规方法，将细胞放入含有培养液的Transwell小室中，加入V-、V+及PBS对照，再放入24孔培养板中于37培养箱孵育4小时。通过统计穿过滤膜的细胞数可以在体外观察药物对肿瘤转移能力的影响。以6nmol/L的量处理肿瘤细胞OS-732(本实验室保存)，V-对其转移的抑制率是41％，V+对转移的抑制率是51％；同样处理猪内皮细胞，抑制率分别是25％和30％(图9)。可见V+比V-具备更强的抑制肿瘤细胞和内皮细胞转移的功能。
V+蛋白抑制金属蛋白酶MMP-2采用明胶酶谱法检测金属蛋白酶的活性，将明胶参入到SDS-聚丙烯酰胺凝胶中，电泳后在适宜的反应条件下，金属蛋白酶能降解其周围的明胶，蛋白降解区不能被考马斯亮蓝染色，所以在明胶酶的活性区域出现明亮的负染带(参见韩锐，抗癌药物研究与实验技术，北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社，1997，359-361)。真核细胞表达并纯化的V-和V+蛋白以10nM作用于MMP-2后，可以观察到V-对负染条带影响甚微，V+则观察不到负染条带，说明V+抑制了MMP-2降解明胶的活性，V-无此功能(图10)。可见嵌合蛋白V+具备了V-所不具备抑制金属蛋白酶的功能。
V+蛋白的抑瘤效果实验用鼠为4-6周龄18-20g的C57B1/6雄性小鼠，随机分为四组，每组5只。Lewis肺癌荷瘤小鼠引颈致死，无菌条件下剥取肿瘤组织，按1∶4比例加入PBS后移入玻璃匀浆器匀浆，瘤细胞悬液与V+蛋白混合后给每只小鼠腋下接种0.2ml。给药方式为隔天皮下环瘤给药，给药体积为100μl，剂量分别为每组5mg/kg、10mg/kg、25mg/kg，载体作为对照。16日后处死小鼠，计量体积及重量。
由于真核细胞表达的V+蛋白质量很少，我们便将大肠杆菌表达的V+以悬浊液形式皮下给药，经过16天治疗，Lewis肺癌肿瘤生长受到明显抑制。与对照组相比，5mg/kg组肿瘤生长99.7％受抑，10mg/kg组肿瘤生长96％受抑，25mg/kg组肿瘤生长83％受抑(图11)(经过t检验，P＜0.05)。病理切片表明给药组血管密度较对照组降低(图12)，意味着V+可能通过抑制血管生成抑制肿瘤生成。
结论突变型蛋白V+通过抑制内皮细胞增殖，抑制肿瘤细胞和内皮细胞转移和抑制金属蛋白酶活性等机制达到抑制肿瘤的功效。
序列表<110>中国科学院遗传与发育生物学研究所<120>抑制恶性肿瘤细胞的侵袭和转移及血管生成的重组蛋白质分子和编码这种重组蛋白质分子的核酸<130>I030015<160>4<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>507<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>(7)..(507)<223>
<400>1ggatcc atg tgt aca act cac tgg ggt ttc aca ctt tgc caa atg cct 48Met Cys Thr Thr His Trp Gly Phe Thr Leu Cys Gln Met Pro1 5 10cca gtt gtg aga caa act ccc aca cag cac ttt aaa aat cag ttc cca 96Pro Val Val Arg Gln Thr Pro Thr Gln His Phe Lys Asn Gln Phe Pro15 20 25 30gct ctg cac tgg gaa cat gaa cta ggc ctg gcc ttc acc aag aac cga144Ala Leu His Trp Glu His Glu Leu Gly Leu Ala Phe Thr Lys Asn Arg35 40 45atg aac tat acc aac aaa ttc ctg ctg atc cca gag tcg gga gac tac192Met Asn Tyr Thr Asn Lys Phe Leu Leu Ile Pro Glu Ser Gly Asp Tyr50 55 60ttc att tac tcc cag gtc aca ttc cgt ggg atg acc tct gag tgc agt240Phe Ile Tyr Ser Gln Val Thr Phe Arg Gly Met Thr Ser Glu Cys Ser65 70 75gaa atc aga caa gca ggc cga cca aac aag cca gac tcc atc act gtg288Glu Ile Arg Gln Ala Gly Arg Pro Asn Lys Pro Asp Ser Ile Thr Val80 85 90gtc atc acc aag gta aca gac agc tac cct gag cca acc cag ctc ctc336
Val Ile Thr Lys Val Thr Asp Ser Tyr Pro Glu Pro Thr Gln Ieu Leu95 100 105 110atg ggg acc aag tct gta tgc gaa gta ggt agc aac tgg ttc cag ccc384Met Gly Thr Lys Ser Val Cys Glu Val Gly Ser Asn Trp Phe Gln Pro115 120 125atc tac ctc gga gcc atg ttc tcc ttg caa gaa ggg gac aag cta atg432Ile Tyr Leu Gly Ala Met Phe Ser Leu Gln Glu Gly Asp Lys Leu Met130 135 140gtg aac gtc agt gac atc tct ttg gtg gat tac aca aaa gaa gat aaa480Val Asn Val Ser Asp Ile Ser Leu Val Asp Tyr Thr Lys Glu Asp Lys145 150 155acc ttc ttt gga gcc ttc tta cta tag507Thr Phe Phe Gly Ala Phe Leu Leu160 165<210>2<211>166<212>PRT<213>人工序列<400>2Met Cys Thr Thr His Trp Gly Phe Thr Leu Cys Gln Met Pro Pro Val1 5 10 15Val Arg Gln Thr Pro Thr Gln His Phe Lys Asn Gln Phe Pro Ala Leu20 25 30His Trp Glu His Glu Leu Gly Leu Ala Phe Thr Lys Asn Arg Met Asn35 40 45Tyr Thr Asn Lys Phe Leu Leu Ile Pro Glu Ser Gly Asp Tyr Phe Ile50 55 60Tyr Ser Gln Val Thr Phe Arg Gly Met Thr Ser Glu Cys Ser Glu Ile65 70 75 80Arg Gln Ala Gly Arg Pro Asn Lys Pro Asp Ser Ile Thr Val Val Ile85 90 95
Thr Lys Val Thr Asp Ser Tyr Pro Glu Pro Thr Gln Leu Leu Met Gly100 105 110Thr Lys Ser Val Cys Glu Val Gly Ser Asn Trp Phe Gln Pro Ile Tyr115 120 125Leu Gly Ala Met Phe Ser Leu Gln Glu Gly Asp Lys Leu Met Val Asn130 135 140Val Ser Asp Ile Ser Leu Val Asp Tyr Thr Lys Glu Asp Lys Thr Phe145 150 155 160Phe Gly Ala Phe Leu Leu165<210>3<211>69<212>DNA<213>人工序列<400>3gcgggatcca tgtgtacaac tcactggggt ttcacacttt gccaaatggc tccagttgtg60agacaaact 69<210>4<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>4cgcgaattcg atatttgctc tcctctatag 30
权利要求
1.一种用于抑制恶性肿瘤细胞的侵袭和转移及血管生成的重组蛋白质分子，该重组蛋白质分子是抑制金属蛋白酶的环十肽CTTHWGFTLC与血管内皮生长抑制因子相连而构成嵌合分子。
2.按照权利要求1所述的用于抑制恶性肿瘤细胞的侵袭和转移及血管生成的重组蛋白质分子，其中，抑制金属蛋白酶的环十肽CTTHWGFTLC与血管内皮生长抑制因子之间是通过间隔序列QMPP相连的。
3.按照权利要求1所述的用于抑制恶性肿瘤细胞的侵袭和转移及血管生成的重组蛋白质分子，其中，血管内皮生长抑制因子是截除了N端22-35个氨基酸的截短形式。
4.按照权利要求1所述的用于抑制恶性肿瘤细胞的侵袭和转移及血管生成的重组蛋白质分子，它具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
5.一种编码权利要求1所述的用于抑制恶性肿瘤细胞的侵袭和转移及血管生成的重组蛋白质分子的核酸分子。
6.按照权利要求5所述的核酸分子，其中，该核酸分子编码的用于抑制恶性肿瘤细胞的侵袭和转移及血管生成的重组蛋白质分子中，抑制金属蛋白酶的环十肽CTTHWGFTLC与血管内皮生长抑制因子之间是通过间隔序列QMPP相连的。
7.按照权利要求5所述的核酸分子，其中，该核酸分子编码的用于抑制恶性肿瘤细胞的侵袭和转移及血管生成的重组蛋白质分子中，血管内皮生长抑制因子是截除了N端22-35个氨基酸的截短形式。
8.按照权利要求5所述的核酸分子，其中，该核酸分子编码的用于抑制恶性肿瘤细胞的侵袭和转移及血管生成的重组蛋白质分子具有SEQID NO2所示的氨基酸序列。
9.按照权利要求5所述的核酸分子，它具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
10.一种用于生产抑制恶性肿瘤细胞的侵袭和转移及血管生成的重组蛋白质分子的方法，包括用权利要求5所述的核酸分子构建表达载体，并将该表达载体在适当的宿主细胞中进行表达的步骤。
11.按照权利要求10所述的方法，其中，所述的核酸分子编码的用于抑制恶性肿瘤细胞的侵袭和转移及血管生成的重组蛋白质分子中，抑制金属蛋白酶的环十肽CTTHWGFTLC与血管内皮生长抑制因子之间是通过间隔序列QMPP相连的。
12.按照权利要求10所述的方法，其中，所述的核酸分子编码的用于抑制恶性肿瘤细胞的侵袭和转移及血管生成的重组蛋白质分子中，血管内皮生长抑制因子是截除了N端22-35个氨基酸的截短形式。
13.按照权利要求10所述的方法，其中，所述的核酸分子编码的用于抑制恶性肿瘤细胞的侵袭和转移及血管生成的重组蛋白质分子具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
14.按照权利要求10所述的方法，其中，所述的核酸分子具有SEQ IDNO1所示的核苷酸序列。
15.权利要求1至4中任何一项所述的抑制恶性肿瘤细胞的侵袭和转移及血管生成的重组蛋白质分子及其在制备治疗恶性肿瘤的药物中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种用于抑制恶性肿瘤细胞的侵袭和转移及血管生成的重组蛋白质分子，该重组蛋白质分子是抑制金属蛋白酶的环十肽CTTHWGFTLC与血管内皮生长抑制因子VEGI相连而构成嵌合分子。本发明还提供了编码该嵌合分子的核酸，生产所述重组蛋白质的方法和所述的重组蛋白质的应用。
文档编号C12N15/63GK1521191SQ0310425
公开日2004年8月18日 申请日期2003年1月31日 优先权日2003年1月31日
发明者劳为德, 高虹 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所