专利名称：具有抗氧化活性的车前草多酚的制备方法
技术领域：
本发明属于中药、食品技术领域。
背景技术：
植物多酚是广泛分布于植物之中的一类复杂化合物，现代研究表明，很多疾病如组织器官老化等都与体内过剩的自由基有关，多酚通过清除自由基能对自由基诱发的生物大分子损伤起保护作用，因此，多酚类化合物在抗衰老、抗肿瘤、抗辐射、抑制高血压、降血脂等很多方面具有良好的生理活性。车前草是车前科植物车前(Plantago asiatica L.)的干燥全草,是一味传统中药，也是卫生部规定可以用于保健食品的植物之一，具有清热利尿、渗湿通淋、明目、祛痰之功效，还具有保肝、降压、抑菌、降低血清胆固醇等多种药理作用。具有很好的医疗保健价值。 近年来，国内外对多酚的应用研究在逐渐增多，枇杷多酚(申请号/专利号201010538005)、苹果多酚(申请号/专利号201010171146)、茶多酚(申请号/专利号200810181108)等已申请专利。而对车前草多酚的研究较少。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有抗氧化活性的车前草多酚的制备方法，它是从车前草植物中提取、纯化车前草多酚的方法。本发明的制备方法是
I、车前草多酚的提取，将车前草粉碎成20目-40目的粗粉，用乙醇溶液回流提取，车前草回流提取所用的乙醇溶液量按重量比为6-10倍，乙醇溶液浓度60-80%，回流提取时间为O. 5-2h，提取后回收乙醇，加水制成O. 5g车前草/mL的提取溶液，5000rpm/min离心30min，弃去沉淀，得到车前草多酚提取溶液。2、车前草多酚的纯化，车前草多酚提取溶液上到DlOl大孔树脂柱(上样量20-30mL/g树脂)上，上样速度2-4BV/h，吸附时间l_3h，洗脱溶剂10-90%乙醇溶液，洗脱速度2-6BV/h。经吸附，乙醇洗脱得到车前草多酚洗脱液，回收乙醇，冻干，得到车前草多酚。车前草多酚的提取过程中，车前草回流提取所用的乙醇溶液量按重量比优选为8倍；乙醇溶液浓度优选为70% ;回流提取时间为lh。车前草多酚的纯化过程中，车前草多酚提取液上样速度优选为3BV/h ;吸附时间优选为2 h ;洗脱溶剂乙醇溶液，优选为30% ;洗脱速度优选为4BV/h。本发明的有益效果是利用车前草为原料经乙醇溶液提取，采用大孔吸附树脂进行富集纯化，制备得到车前草多酚。大孔吸附树脂具有物理化学稳定性高、吸附容量大、选择性好、吸附速度快、再生处理方便、使用期长、节省费用等诸多优点。适合于工业生产。制备得到车前草多酚具有清除自由基、抗氧化的功能。在食品、医药、化妆品及功能食品方面具有很大开发潜力。
图I是本发明车前草多酚对D-半乳糖诱导氧化损伤小鼠肝组织MDA水平的影响； 图2是本发明车前草多酚对D-半乳糖诱导氧化损伤小鼠肝组织GSH-Px活力的影响； 图3是本发明车前草多酚对D-半乳糖诱导氧化损伤小鼠肝组织T-AOC活性的影响； 图4是本发明车前草多酚对D-半乳糖诱导氧化损伤小鼠肝组织SOD活性的影响；
图5是本发明车前草多酚对D-半乳糖诱导氧化损伤小鼠脑组织MAO活力的影响。
具体实施例方式实施例I
(I)车前草多酚的提取
车前草粗粉100g，加入800mL的70%乙醇溶液回流提取3次，每次I小时，过滤，合并滤 液，回收乙醇，加水制成200mL的提取液，5000rpm/min离心30min,弃去沉淀,得到车前草
多酚提取溶液。(2)车前草多酚的纯化
车前草多酚提取液以3BV/h的速度上到DlOl大孔树脂柱上(上样量20-30mL/g树脂)，吸附2小时后，先用蒸馏水洗脱至流出液无色，再用30%乙醇作为洗脱溶剂，以4BV/h速度洗脱至无色，收集洗脱液，回收乙醇、冻干，即得到车前草多酚3. Sg。实施例2
(I)车前草多酚提取
车前草粗粉200g，加入1600 mL的70%乙醇溶液回流提取3次，每次I小时，过滤，合并滤液，回收乙醇，加水制成400mL的提取液，5000rpm/min离心30min,弃去沉淀,得到车前草多酚提取溶液。(2)车前草多酚的纯化
车前草多酚提取液以3BV/h的速度上到DlOl大孔树脂柱上(上样量20-30mL/g树脂)，吸附2小时后，先用蒸馏水洗脱至流出液无色，再用30%乙醇作为洗脱溶剂，以4BV/h速度洗脱至无色，收集洗脱液，回收乙醇、冻干，即得到车前草总多酚Sg。实施例3
(I)车前草多酚提取
车前草粗粉300g，加入2400 mL的70%乙醇溶液回流提取3次，每次I小时，过滤，合并滤液，回收乙醇，加水制成600mL的提取液，5000rpm/min离心30min,弃去沉淀,得到车前草多酚提取溶液。(2)车前草多酚的纯化
车前草多酚提取液以3BV/h的速度上到DlOl大孔树脂柱上(上样量20-30mL/g树脂)，吸附2小时后，先用蒸馏水洗脱至流出液无色，再用30%乙醇作为洗脱溶剂，以4BV/h速度洗脱至无色，收集洗脱液，回收乙醇、冻干，即得到车前草多酚10g。实施例4
(I)车前草多酚提取
车前草粗粉500g，加入4000 mL的80%乙醇溶液回流提取3次，每次I小时，过滤，合并滤液，回收乙醇，加水制成IOOOmL的提取液，5000r/min离心30min,弃去沉淀,得到车前草
多酚提取溶液。(2)车前草多酚的纯化
车前草多酚提取液以3BV/h的速度上到DlOl大孔树脂柱上(上样量20-30mL/g树脂)，吸附2小时后，先用蒸馏水洗脱至流出液无色，再用30%乙醇作为洗脱溶剂，以4BV/h速度洗脱至无色，收集洗脱液，回收乙醇、冻干，即得到车前草多酚17. 2g。试验例I车前草多酚的体外抗氧化试验
(I)清除DPPH自由基能力的测定(DPPH法)
方法在试管中加入I. 95mL质量浓度为24mg/L的DPPH乙醇溶液和O. 05mL 95%的乙醇溶液,混匀后,用Icm比色皿在517nm波长处测吸光值(A)，记为A0。另取试管分别 加入I. 95mL质量浓度为24mg/L的DPPH乙醇溶液和O. 05mL不同浓度的提取物溶液，混匀后，记录加入提取物溶液后不同时间的吸光度值直到吸光度稳定。用稳定后的吸光值At计算提取物对DPPH自由基的清除能力SR%，绘制清除率曲线，计算IC5Q。 SR%= [ (A0-At) / A0] X 100%
式中Atl — DPPH乙醇溶液的吸光值。At—加入提取物溶液后的DPPH乙醇溶液的最终吸光度值。IC50=O. 2848 mg/mL。此结果可以看出车前草多酚对DPPH自由基有一定的清除作用。(2) OH ·自由基能力的测定
方法-M 7支具塞试管，分别加入O. 75mmoL · L-1邻二氮菲溶液lmL、PH=7. 4的PBS缓冲溶液3. 8mL，充分混匀后再加入O. 75 mmoL · T1FeSO4溶液I. 5mL，立即混匀。然后向其中5支试管分别加入一定量的车前草多酚溶液(每管加的体积不同)，混再分别加入O. 01%的H2O2溶液lmL，混匀，另取2支分别为损伤和未损伤管，不加车前草多酚溶液，在损伤管中加入O. 01% H2O2溶液ImL,未损伤管不加H2O2,最后用蒸懼水补至相同体积IOmL, 7支试管于37°保温Ih，测A536，计算OH ·清除率，绘制清除率曲线。OH ·清除率=(A2-A1) / (A0-A1)
式中=Atl—未损伤管的吸光度；A1—损伤管的吸光度；A2—加车前草多酚溶液的吸光度。IC50=O. 2469 mg/mL,车前草总多酹对H202/Fe2+体系通过Fenton反应所产生的OH ·具有清除作用。(3)光化学发光法(PCL)
PCL法分析原理是由光化学法生成自由基，并利用化学发光法检测自由基，抗氧化活性是用相当于抗坏血酸的纳摩尔数来计算。方法配制混合液为I. O mL反应缓冲液，包括O. I moL/L Sodium Carbonate和
O.lmmoL/LNa2-EDTA; I. 5 mLACff-diLuent (water) ; I mmoL/L Lu-minoL (25 μ L)，作为光敏剂激发反应分子，使其迅速产生自由基，同时又作为光致化学发光物质。样品和标准品均为10 μ L。每个样品平行测试2次。不同物质的量(0，0. 5，I, 2和3nmoL)的抗坏血酸)得到标准曲线，结果表明，车前草多酹清除作用相当于抗坏血酸2. 122575 nmoL/mgo试验例2车前草多酚对D-半乳糖诱导氧化损伤模型小鼠的保护作用
I、动物分组及模型建立
试验前小鼠自由摄食饮水，适应性饲养一周后，随机分为6组，每组10只，如表I所示。D-半乳糖亚急性氧化损伤模型小鼠的给药方式采用颈背部皮下注射。除正常对照组每日颈背部皮下注射生理盐水外，各实验组每日皮下注射5% (w/v)的D-半乳糖500mg/kg/d,建立模型，连续6周。造模同时，正常对照组和衰老模型组小鼠灌胃生理盐水；阳性对照组小鼠灌胃5mg/mL维生素E ;高剂量、中和低剂量组分别灌胃车前草多酚100、50和25mg/kg/d。2组织样品的制备
第六周末次灌胃和注射D-半乳糖24h后，乙醚麻醉动物，摘除眼球取血，37°C放置lh，4°C放置3h，离心(4000171^11，101^11，4°0分离血清后-201保存备用。采血后颈椎脱臼处死动物，摘取脑、肝、肾、脾和心脏，称重，与动物终体重的比值即为脏器指数。肝和脑分别制成10% (w/v)的组织勻衆,离心(4000r/min, IOmin)取上清液，-20°C保存。蛋白采用Lowry·的方法测定。3生化指标测定
肝组织的MDA含量、GSH-Px活性和T-AOC活性，血清的SOD活性，及脑组织的MAO活力采用比色法测定，按试剂盒说明书操作MDA测定采用硫代巴比妥酸法；GSH-Px)测定根据GSH-Px可以促进过氧化氢与还原型谷胱甘肽(GSH)反应，生成氧化型谷胱甘肽，通过在412nm处测定还原型谷胱甘肽消耗量，计算酶活；T_A0C活性根据机体中抗氧化物质能使Fe3+还原成Fe2+，后者与菲林类物质形成有色络合物，在520nm处测定吸光度值；S0D活力分析采用黄嘌呤氧化酶法；ΜΑ0测定以苄胺为底物，在MAO作用下，生成苄醛，在242nm下测定吸光度，计算酶活。4统计分析
采用SPSS12. O软件完成统计处理。计量资料以x±s表示；计量资料组间差异比较采用t检验。差异显著水平为P < O. 05,极显著水平为P < O. 01。(I)车前草多酚对小鼠肝组织MDA水平的影响
如图I所示，D-半乳糖诱导氧化损伤模型组小鼠肝组织中MDA浓度显著高于正常对照组。与氧化损伤模型组比较，车前草多酚各剂量组，特别是高剂量组小鼠肝组织MDA浓度显著降低(P < 0.05)。而车前草多酚降低小鼠肝组织MDA水平与阳性对照组(维生素E)相当，与正常对照组比较，差异不显著(P > O. 05)，说明车前草多酚对恢复D-半乳糖诱导衰老模型小鼠肝组织MDA水平具有一定的作用。(2)车前草多酚对小鼠肝组织GSH-Px活性的影响
GSH-Px是机体内一种重要的催化过氧化氢分解的酶，其特异的催化还原型谷胱甘肽(GSH)对过氧化氢的还原反应，可以保护细胞膜结构和功能完整的作用[12]。衰老模型组小鼠血清GSH-Px活性显著低于对照组，三个车前草多酚处理组小鼠血清GSH-Px活性均明显高于模型组。与模型组比较，车前草多酚能显著提高小鼠肝组织GSH-Px活性(P < O. 05)(图2)。说明车前草多酚对提高D-半乳糖诱导衰老小鼠肝组织GSH-Px活性具有良好的效果。但与正常对照组比较，差异不显著(P >0.05)。(3)车前草多酚对小鼠肝组织T-AOC能力的影响
总抗氧化能力(T-AOC)能有效反应机体非酶抗氧化系统的作用。从图3中可知，衰老模型组肝组织总抗氧化(T-AOC)能力最低，与正常对照组相比差异达极显著水平(P < O. 01)，说明D-半乳糖小鼠衰老模型造模成功；车前草多酚处理高、中和低剂量组及阳性对照组肝组织T-AOC活性高于模型组，但低于正常对照组。(4)车前草多酚对小鼠血清SOD活性的影响
车前草多酚对D-半乳糖诱导氧化损伤模型小鼠血清SOD活力分析结果如图4所示，车前草多酚处理高剂量组SOD活力明显高于模型组(P < O. 05)，但低剂量组与模型组差异不显著，说明车前草多酚能提高D-半乳糖诱导衰老小鼠血清SOD活力，且呈剂量依赖关系。车前草多酚处理高剂量组与阳性对照组SOD活力相当，与正常对照组差异不显著(P > O. 05)。(5)车前草多酚对小鼠脑组织MAO活性
脑组织单胺氧化酶(MAO)活性结果如图5所示，阳性对照组及低、中和高剂量组脑组织MAO活力降低，但与衰老组相比差异未达到显著水平(P > O. 05);氧化损伤模型组脑组织MAO活力显著高于正常对照组，差异达到显著性水平(P < O. 05);正常对照组、阳性对照组及车前草多酚各剂量组间脑组织MAO活力差异不显著(P > O. 05)。
权利要求
1.一种具有抗氧化活性的车前草多酚的制备方法，其制备方法是 a、车前草多酚的提取，将车前草粉碎成20目-40目的粗粉，用乙醇溶液回流提取，车前草回流提取所用的乙醇溶液量按重量比为6-10倍，乙醇溶液浓度60-80%，回流提取时间为O. 5-2h，提取后回收乙醇，加水制成O. 5g车前草/mL的提取溶液，5000rpm/min离心30min，弃去沉淀，得到车前草多酚提取溶液； b、车前草多酚的纯化，车前草多酚提取溶液上到DlOl大孔树脂柱上，上样速度2-4BV/h，吸附时间l_3h，洗脱溶剂10-90%乙醇溶液，洗脱速度2-6BV/h ;经吸附，乙醇洗脱得到车前草多酚洗脱液，回收乙醇，冻干，得到车前草多酚。
2.如权利要求I所述的一种具有抗氧化活性的车前草多酚的制备方法，其制备方法是 车前草多酚的提取过程中，车前草回流提取所用的乙醇溶液量优选为8倍；乙醇溶液浓度优选为70% ;回流提取时间为Ih ； 车前草多酚的纯化过程中，车前草多酚提取液上样速度优选为3BV/h ;吸附时间优选为2 h ;洗脱溶剂乙醇溶液，优选为30% ;洗脱速度优选为4BV/h。
全文摘要
一种具有抗氧化活性的车前草多酚的制备方法，属于中药、食品技术领域其制备方法是a、将车前草粉碎成粗粉，用乙醇溶液回流提取，回流提取时间为0.5-2h，提取后回收乙醇，加水制成提取溶液，弃去沉淀，得到车前草多酚提取溶液；b、车前草多酚提取溶液上到D101大孔树脂柱上，吸附时间1-3h，洗脱溶剂10-90%乙醇溶液，洗脱速度2-6BV/h；乙醇洗脱得到车前草多酚洗脱液，回收乙醇，冻干，得到车前草多酚。有益效果是大孔吸附树脂具有物理化学稳定性高、吸附容量大、选择性好、吸附速度快、再生处理方便、使用期长、节省费用等，适合于工业生产。制备得到车前草多酚具有清除自由基、抗氧化的功能。在食品、医药、化妆品及功能食品方面具有很大开发潜力。
文档编号A61P39/06GK102895321SQ20121045250
公开日2013年1月30日 申请日期2012年11月13日 优先权日2012年11月13日
发明者刘春明, 王强, 王晶, 马冰 申请人:长春师范学院