专利名称：一种橄榄酚类天然抗氧化剂的制备方法
技术领域：
本发明提供了一种橄榄酚类天然抗氧化剂的制备方法，属于添加剂加工制造技术领域。
背景技术：
橄榄(Canarium album Raeusch.)为我国南方特有的亚热带常绿果树，与原产欧洲地中海地区的油橄榄(Oleaeuropaea L.)实为不同科属的植物。橄榄果实又名青果，是我国传统的药食两用资源，具有很高的药用保健价值。据古代医书记载，橄榄性味甘、酸、涩、 平，入肺、胃两经，有清热解毒、利咽化痰、生津止渴、健胃消食和除烦解酒等功能，对癌症也有一定的疗效。橄榄果实中含有大量的酚类化合物，现代药学分析表明酚类化合物是橄榄主要的药效成分。酚类化合物由于其分子结构中含有多个酚性羟基，具有较强的抗氧化作用和清除自由基的能力，对预防疾病和促进人体健康具有非常积极的作用，引起人们开发利用天然酚类化合物的极大兴趣。从上世纪80年代末以来，在崇尚“追求自然”的消费观念下，以酚类化合物为主的天然产物的开发利用开始兴起，人们将酚类成分从天然资源中安全有效地提取出来并广泛应用于制药、食品、生化、日化、精细化工、营养、植保、功能高分子材料等多个领域。目前，有关橄榄酚类产品的工业化开发研究刚起步，主要还是集中在橄榄酚类成分的提取实验研究上。常用的橄榄酚类提取方法有热水浸提法、碱(石灰水)提取酸(盐酸) 沉淀法、709Γ95%乙醇浸提法、甲醇常温浸提法，超声波辅助乙醇溶液提取法、微波辅助乙醇溶液提取法，常温溶剂提取法一般提取时间在广4 h，提取效率不高，而超声波辅助提取在 0. 5^1 h左右，微波辅助提取法一般广10 min，提取时间短，效率相对较高，相比于传统的溶剂浸提法具有明显的优势。但是，经溶剂提取得到的仅为酚类粗提物，酚类含量一般在 40%以下，杂质较多，达不到抗氧化剂使用的实际要求。目前，也有相关研究者对橄榄酚类粗提物进行纯化研究，如颜贻谦等人(CN 1333203A)通过往橄榄酚类乙醇粗提液中加入适量 AlCl3并调节pH值，使酚类络合沉淀，然后加入HCl溶液溶解沉淀，再用乙酸乙酯多次萃取， 萃取液浓缩去除乙酸乙酯，并经真空干燥制得橄榄酚类产品，产品酚类含量达76%;傅遍红在橄榄黄酮的提取制备工艺中，采用阳离子交换树脂分离除去橄榄黄酮粗提液中的杂质， 制得橄榄黄酮产品，产品纯度可达70% ；陈岗等人采用AB-8大孔树脂对微波辅助提取的橄榄酚类提取液进行分离纯化，以除去粗提液中的杂质。综合而言，现有的橄榄酚类产品提取制备工艺还是存在提取效率不高、产品酚类得率及纯度有待进一步提高的问题。因此，寻求更高效的提取方法及更适用于橄榄酚类吸附及解吸分离的专一性强的柱层析材料是制备高纯度橄榄酚类抗氧化剂产品的关键。超声波-微波协同萃取是近些年出现的一种新的提取技术，它在提取过程中，同时利用了超声波振动的空化作用、机械搅拌作用和微波的高能作用，大大加快了提取进程， 弥补了单独用超声波或微波提取带来的某些不足，具有高效、快速、能耗小等优点。聚酰胺树脂是由酰胺键聚合形成的高分子化合物，其酰胺基可与羟基酚类、酸类、醌类、硝基等化合物以氢键形成结合而被吸附，其脂肪长链可作为分配层析的载体。聚酰胺层析树脂特别适用于多元酚类化合物如黄酮、醌类、酚酸、含羰基化合物、羧基化合物的分离。而有关超声波_微波协同萃取技术和聚酰胺树脂层析方法应用于橄榄酚类化合物的研究尚未见文献报道。
发明内容
本发明的目的提出一种橄榄酚类天然抗氧化剂的制备方法。以新鲜橄榄果实为原料，采用超声-微波协同萃取技术提取橄榄中的酚类化合物，得到橄榄酚类粗提物，再通过聚酰胺树脂层析柱对提取物进行分离纯化，制备得到高纯度的橄榄酚类抗氧化剂产品。本发明的技术方案一种橄榄酚类天然抗氧化剂的制备方法，以新鲜橄榄果实为原料，经选果、清洗、热烫、去核、打浆、真空干燥、超声_微波协同提取、真空浓缩、聚酰胺树脂层析柱分离纯化、真空浓缩、冷冻干燥等步骤制得橄榄酚类抗氧化剂产品。本发明方法具体包括以下步骤
1、选果、清洗选用我国橄榄科植物橄榄&albumRaeusch.的果实为原料，要求选用无霉变、无腐烂的新鲜橄榄果实，用清水清洗除去果实表面的泥沙和异物；
2、热烫、去核将清洗干净的橄榄鲜果放入沸水中热烫;Γ5min，取出置于清水中冷却， 然后破碎去核；
3、打浆破碎去核后的橄榄果肉立即加水进行打浆，果肉与水的质量比为1 0.5 1， 打浆后果浆颗粒粒径控制在广3 mm ；
4、真空干燥、粉碎将橄榄果浆置于真空干燥箱进行干燥，干燥后样品粉碎，过2(Γ60 目筛得橄榄果肉粉；
5、超声-微波协同提取橄榄酚类物质往橄榄果肉粉中加入质量浓度609Γ80%的食用级酒精溶液，橄榄果肉粉与酒精溶液的质量体积比(W/V)以g/mL计为1 1(Γ15，用超声-微波协同萃取仪进行提取，超声波频率为40 KHz，功率为50 W，微波频率为2450 MHz, 功率为10(Γ600 W，提取时间为0. 5^3 min，得橄榄酚类提取液；
6、真空浓缩橄榄酚类提取液经真空浓缩除去酒精得到酚类浓缩液，为橄榄酚类粗提取物；
7、聚酰胺树脂层析柱分离纯化用去离子水先将橄榄酚类浓缩液调整为酚类浓度广2 g/100mL的橄榄酚类提取液，再上聚酰胺树脂层析柱进行吸附，层析柱吸附饱和后，先用 2、倍于树脂柱床体积的去离子水洗脱除去样品中的糖、蛋白质等杂质，再用1.5 3倍于树脂柱床体积、浓度为80、0%的食用级酒精溶液作为洗脱剂将酚类物质洗脱下来，收集橄榄酚类洗脱液；
8、真空浓缩、冷冻干燥橄榄酚类洗脱液经真空浓缩除去酒精溶液，并经冷冻干燥制备得到粉末状橄榄酚类抗氧化剂产品，产品酚类含量高达88%以上，酚类得率70%以上。所述的真空干燥处理是50 60 ！的真空干燥，真空浓缩处理是45飞0°C的真空浓缩，所述的冷冻干燥处理是在-50 _55°C温度下的冷冻干燥。本发明中橄榄酚类抗氧化剂产品的ABTS自由基清除能力测定按以下方法进行 (1)工作液制备用超纯水将ABTS和高硫酸钾分别溶解并混合，使其最终浓度分别为7
4mmol/L和2.45 mmol/L，在室温、避光条件下放置16 h，形成ABTS自由基储备液，使用前用 0.2 mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7. 4)稀释，使其在734 nm处吸光值为0. 700 士0. 020。(2) ABTS自由基清除能力测定将橄榄酚类抗氧化剂产品分别稀释成不同酚类浓度的样品溶液(0. 01、0. 02、0. 03、0. 05 和 0. 1 mg/mL)。将 0. 1 mL 样品液与 3. 9 mL ABTSX 作液充分混合，30°C反应10 min后，于734 nm波长处测定吸光值Al，以超纯水作空白测得吸光值AO。ABTS 自由基清除率=[(AO - Al) / AO] X 100%
本发明中橄榄酚类抗氧化剂产品的DPPH自由基清除能力测定按以下方法进行 (1)试剂配制配制1 mmol/L的DPPH无水乙醇溶液，冷藏放置。使用前用无水乙醇稀释10倍。(2) DPPH自由基清除能力测定将橄榄酚类抗氧化剂产品分别稀释成不同酚类浓度的样品溶液(0. 001、0. 005、0. 01、0. 02和0. 1 mg/mL)。将2 mL超纯水及2 mL样品液分别加入等体积的0.1 mmol/L DPPH溶液，震荡混合，30°C条件下反应30 min后在517 nm测定吸光值，得到AO和Al。2 mL样品液加入等体积无水乙醇同等条件下反应，测得吸光值A2。DPPH 自由基清除率=[1 — (Al — A2) / AO] X 100%
本发明中橄榄酚类抗氧化剂产品的OH自由基清除能力测定按以下方法进行 将橄榄酚类抗氧化剂产品分别稀释成不同酚类浓度的样品溶液(0. 01,0. 02,0. 05,0. 1 和0.2 mg/mL)。取5 mmol/L邻二氮菲1.0 mL加入试管，再加入0. 2 mol/L、pH 7. 4的磷酸盐缓冲液2.0 mL和样品溶液1.0 mL，充分混勻。再加入7. 5 mmol/L的FeSO4溶液1. 0 mL，并立即混勻。再加入0.1% H2O2 1.0 mL，混勻后37°C保温1 h，于536 nm处测其吸光值 Al，以超纯水作空白测得吸光值A0。OH 自由基清除率=[(AO - Al)/AO] X 100%
本发明中橄榄酚类抗氧化剂产品的总还原力测定按以下方法进行 (1)试剂配制10 mmol/L的Fe3+-三吡啶三吖嗪(TPTZ)储备液(用40 mmol/L的盐酸溶解)，20 mmol/L的FeCl3溶液和0. 3 mol/L的醋酸缓冲液(pH3. 6)以体积比1 1 10 混合，并在37°C下静置1 h得FRAP工作液。(2)总还原力测定将橄榄酚类抗氧化剂产品分别稀释成不同酚类浓度的样品溶液(0. 01、0· 02、0· 05、0. 1 和 0. 2 mg/mL)。将 100 μ L 样品液，300 μ L 超纯水和 3 mL FRAP 工作液充分混合，在37°C反应30 min后，于593 nm处测定吸光值，以超纯水作为空白对照。 以0-600 μ mol/L的6-羟基-2，5，7，8-四甲基苯并二氢吡喃_2_羧酸(Trolox)标准溶液绘制标准曲线。样品的还原能力以TEAC值(μ mol/L Trolox)表示。本发明的有益效果本发明提供了一种橄榄酚类天然抗氧化剂的制备方法。通过超声波_微波协同萃取技术及聚酰胺树脂层析柱分离纯化，制备获得高纯度高得率的橄榄酚类抗氧化剂产品。本发明所得产品安全性高，具有比Vc和BHA更强的自由基清除能力及抗氧化活性，制备方法操作简单，适合工业化生产，对于橄榄酚类资源的深度开发和橄榄加工业的发展具有极大的促进作用。
图1橄榄酚类抗氧化剂产品的ABTS自由基清除能力图1显示，酚类浓度在0. 0Γ0. 1 mg/mL时，橄榄酚类抗氧化剂产品具有比常规抗氧化剂Vc和BHA更强的ABTS自由基清除能力，在0. 1 mg/mL时，橄榄酚类抗氧化剂产品ABTS 自由基清除率达99%以上，分别是Vc和BHA (丁基羟基茴香醚)的2. 3倍和1. 3倍。图2橄榄酚类抗氧化剂产品的DPPH自由基清除能力
图2显示，酚类浓度在0. 00Γ0. 1 mg/mL时，橄榄酚类抗氧化剂产品DPPH自由基清除能力要强于常规抗氧化剂Vc和BHA，在0. 005 mg/mL时，橄榄酚类抗氧化剂产品DPPH自由基清除率即可达90%，0. 1 mg/mL时，DPPH自由基清除率达可达98%以上。图3橄榄酚类抗氧化剂产品的OH自由基清除能力。
图3显示，酚类浓度在0.0广0.2 mg/mL时，橄榄酚类抗氧化剂产品具有一定的OH自由基清除能力，清除率最高可达52%以上，分别是Vc和BHA的9倍和1. 2倍。图4橄榄酚类抗氧化剂产品的总还原力
图4显示，酚类浓度在0. 0Γ0. 2 mg/mL时，橄榄酚类抗氧化剂产品的总还原力要强于常规抗氧化剂Vc和BHA，在0. 2 mg/mL,橄榄酚类抗氧化剂产品总还原力TEAC值达1721. 5 μ mol/L Trolox,分别是Vc和BHA的2. 5倍和1. 3倍，说明其具有很好的抗氧化活性。
具体实施例方式实施例1
以新鲜橄榄果实为原料，去除其中霉变、腐烂的坏果，用清水清洗除去果实表面的泥沙和异物，放入沸水中热烫;Γ5 min，冷却后破碎去核。去核后的橄榄果肉按果肉与水的质量比为1 0.5加水进行打浆，果浆颗粒粒径控制在广3 mm。将橄榄果浆进行真空干燥， 粉碎，过2(Γ60目筛得橄榄果肉粉。按果粉与酒精溶液的质量体积比(W/V)为1 10加入609Γ80%的食用级酒精溶液，用超声-微波协同萃取仪进行酚类提取，超声波频率为40 KHz，功率为50 W，微波频率为2450 MHz，功率为100 W，提取时间为3 min。橄榄酚类提取液经真空浓缩除去酒精得到橄榄酚类粗提取物，用去离子水将橄榄酚类粗提液酚类浓度调整为1 g/100mL，上聚酰胺树脂层析柱进行吸附，吸附饱和后，先用2倍于树脂柱床体积的去离子水洗脱除去样品中的糖、蛋白等杂质，再用1. 5倍于树脂柱床体积、浓度为809Γ90% 的食用级酒精溶液将柱中吸附的酚类物质洗脱下来，收集橄榄酚类洗脱液。洗脱液经真空浓缩除去酒精溶液，并经冷冻干燥制备得到粉末状橄榄酚类抗氧化剂产品，产品酚类含量为88%，酚类得率为70%。实施例2
以新鲜橄榄果实为原料，去除其中霉变、腐烂的坏果，用清水清洗除去果实表面的泥沙和异物，放入沸水中热烫;Γ5 min，冷却后破碎去核。去核后的橄榄果肉按果肉与水的质量比为1 0.8加水进行打浆，果浆颗粒粒径控制在广3 mm。将橄榄果浆进行真空干燥， 粉碎，过2(Γ60目筛得橄榄果肉粉。按果粉与酒精溶液的质量体积比(W/V)为1 12加入609Γ80%的食用级酒精，用超声-微波协同萃取仪进行酚类提取，超声波频率为40 KHz, 功率为50 W，微波频率为2450 MHz，功率为300 W，提取时间为2 min。橄榄酚类提取液经真空浓缩除去酒精得到橄榄酚类粗提取物，用去离子水将橄榄酚类粗提液酚类浓度调整为 1. 5 g/100mL，上聚酰胺树脂层析柱进行吸附，吸附饱和后，先用3倍于树脂柱床体积的去离子水洗脱除去样品中的糖、蛋白等杂质，再用2倍于树脂柱床体积、浓度为809Γ90%的食用级酒精溶液将柱中吸附的酚类物质洗脱下来，收集橄榄酚类洗脱液。洗脱液经真空浓缩除去酒精溶液，并经冷冻干燥制备得到粉末状橄榄酚类抗氧化剂产品，产品酚类含量为89%， 酚类得率为71%。实施例3
以新鲜橄榄果实为原料，去除其中霉变、腐烂的坏果，用清水清洗除去果实表面的泥沙和异物，放入沸水中热烫;Γ5 min，冷却后破碎去核。去核后的橄榄果肉按果肉与水的质量比为1 1加水进行打浆，果浆颗粒粒径控制在广3 mm。将橄榄果浆进行真空干燥，粉碎，过 20^60目筛得橄榄果肉粉。按果粉与酒精溶液的质量体积比(W/V)为1 15加入609Γ80% 的食用级酒精，用超声-微波协同萃取仪进行酚类提取，超声波频率为40 KHz，功率为50 W，微波频率为2450 MHz，功率为450 W，提取时间为1 min。橄榄酚类提取液经真空浓缩除去酒精得到橄榄酚类粗提取物，用去离子水将橄榄酚类粗提液酚类浓度调整为2 g/100mL, 上聚酰胺树脂层析柱进行吸附，吸附饱和后，先用4倍于树脂柱床体积的去离子水洗脱除去样品中的糖、蛋白等杂质，再用3倍于树脂柱床体积、浓度为809Γ90%的食用级酒精溶液将柱中吸附的酚类物质洗脱下来，收集橄榄酚类洗脱液。洗脱液经真空浓缩除去酒精溶液， 并经冷冻干燥制备得到粉末状橄榄酚类抗氧化剂产品，产品酚类含量为91%，酚类得率为 73%。实施例4
以新鲜橄榄果实为原料，去除其中霉变、腐烂的坏果，用清水清洗除去果实表面的泥沙和异物，放入沸水中热烫;Γ5 min，冷却后破碎去核。去核后的橄榄果肉按果肉与水的质量比为1 :1加水进行打浆，果浆颗粒粒径控制在广3 mm。将橄榄果浆进行真空干燥，粉碎，过 2(Γ60目筛得橄榄果肉粉。按果粉与酒精溶液的质量体积比(W/V)为1 12加入609Γ80%的食用级酒精，用超声-微波协同萃取仪进行酚类提取，超声波频率为40 KHz，功率为50 W, 微波频率为2450 MHz，功率为600 W，提取时间为0.5 min。橄榄酚类提取液经真空浓缩除去酒精得到橄榄酚类粗提取物，用去离子水将橄榄酚类粗提液酚类浓度调整为1.5 g/100mL, 上聚酰胺树脂层析柱进行吸附，吸附饱和后，先用4倍于树脂柱床体积的去离子水洗脱除去样品中的糖、蛋白等杂质，再用2. 5倍于树脂柱床体积、浓度为809Γ90%的食用级酒精溶液将柱中吸附的酚类物质洗脱下来，收集橄榄酚类洗脱液。洗脱液经真空浓缩除去酒精溶液，并经冷冻干燥制备得到粉末状橄榄酚类抗氧化剂产品，产品酚类含量为90%，酚类得率为 72%。
权利要求
1.一种橄榄酚类天然抗氧化剂的制备方法，其特征是以新鲜橄榄果实为原料，经选果、 清洗、热烫、去核、打浆、真空干燥、粉碎，超声-微波协同提取、真空浓缩、聚酰胺树脂层析柱分离纯化、真空浓缩、冷冻干燥步骤制成橄榄酚类抗氧化剂产品，所述方法包括如下步骤(1)选果、清洗选用我国橄榄科植物橄榄C^ari album Raeusch.的果实为原料， 要求选用无霉变、无腐烂的新鲜橄榄果实，用清水清洗除去果实表面的泥沙和异物；(2)热烫、去核将清洗干净的橄榄鲜果放入沸水中热烫;Γ5min，取出置于清水中冷却，然后破碎去核；(3)打浆破碎去核后的橄榄果肉立即加水进行打浆，果肉与水的质量比为1 0.5 1， 打浆后果浆颗粒粒径控制在广3 mm ；(4)真空干燥、粉碎将橄榄果浆置于真空干燥箱进行干燥，干燥后样品粉碎，过2(Γ60 目筛得橄榄果肉粉；(5)超声-微波协同提取橄榄酚类物质往橄榄果肉粉中加入质量浓度609Γ80%的食用级酒精溶液，橄榄果肉粉与酒精溶液的质量体积比以g/mL计为1 1(Γ15，用超声-微波协同萃取仪进行提取，超声波频率为40 KHz，功率为50 W，微波频率为M50 MHz，功率为 100^600 W，提取时间为0. 5 3 min，得橄榄酚类提取液；(6)真空浓缩橄榄酚类提取液经真空浓缩除去酒精得到酚类浓缩液，为橄榄酚类粗提取物；(7)聚酰胺树脂层析柱分离纯化用去离子水先将橄榄酚类浓缩液调整为酚类浓度 Γ2 g/100mL的橄榄酚类提取液，再上聚酰胺树脂层析柱进行吸附，层析柱吸附饱和后，先用2、倍于树脂柱床体积的去离子水洗脱除去样品中的糖、蛋白质杂质，再用1. 5 3倍于树脂柱床体积、浓度为809Γ90%的食用级酒精溶液作为洗脱剂将酚类物质洗脱下来，收集橄榄酚类洗脱液；(8)真空浓缩、冷冻干燥橄榄酚类洗脱液经真空浓缩除去酒精溶液，并经冷冻干燥制备得到粉末状橄榄酚类抗氧化剂产品，产品酚类含量高达88%以上，酚类得率70%以上。
2.根据权利要求1所述的橄榄酚类天然抗氧化剂的制备方法，其特征是步骤(4)所述的真空干燥处理是5(T60°C的真空干燥，步骤(6)和步骤(8)的真空浓缩处理是45飞0°C的真空浓缩，步骤(8)所述的冷冻干燥处理是在-50 _55°C温度下的冷冻干燥。
全文摘要
一种橄榄酚类天然抗氧化剂的制备方法，属于添加剂加工制造技术领域。本发明以新鲜橄榄果实为原料，经选果、清洗、热烫、去核、打浆、真空干燥、粉碎，然后用超声-微波协同提取技术提取橄榄果肉浆中的酚类化合物，得到橄榄酚类粗提物，再通过聚酰胺树脂层析柱对提取物进行分离纯化，酚类洗脱液经真空浓缩、冷冻干燥，制备得到酚类含量在88%以上的橄榄酚类抗氧化剂产品。本发明方法制得的酚类抗氧化剂产品天然、无毒，具有比Vc和BHA更强的自由基清除能力及抗氧化活性，可广泛应用于食品、保健品、药品、化妆品及日用品领域。
文档编号B01D15/42GK102504823SQ20111034981
公开日2012年6月20日 申请日期2011年11月8日 优先权日2011年11月8日
发明者何志勇, 冯英委, 曾茂茂, 王林祥, 秦昉, 陈洁, 陶冠军 申请人:江南大学