一种关节软骨移植物及其制备方法

一种关节软骨移植物及其制备方法
【专利摘要】一种关节软骨移植物及其制备方法，本发明制备的关节软骨移植物从外至内由浅层、中层和深层三层构成，每层的厚度、形状、大小均与软骨损伤部位相匹配，无需术前塑形，植入后与周围正常软骨各层分布相对应，有利于细胞间的信号传递、转导及调控，能够与周围正常软骨组织更好的整合；具有和天然软骨一致的结构特征，从浅层到深层Ⅱ型胶原含量逐渐降低，GAG含量逐渐升高，抗压性和耐磨性好；软骨移植物中的软骨细胞被细胞外基质包裹，免疫原性低，避免植入后发生免疫排斥，能够长期存活并发挥功能，提高软骨修复长期疗效。
【专利说明】一种关节软骨移植物及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于组织工程学医用生物材料【技术领域】，具体涉及一种关节软骨移植物及其制备方法。
【背景技术】
[0002]关节软骨是透明软骨，由软骨细胞、软骨纤维和软骨基质构成。软骨组织具有层状分布不均一的特点，从上至下分为浅层(10~20%)、中层(40~60%)和深层(20~30%)三层区域。近年来研究发现，软骨每一区域结构不同、蛋白成分不同，并执行不同的功能，从不同区域获得的软骨细胞基因表达和生长率均不相同。浅层、中层和深层软骨细胞密度依次降低，其中浅层软骨细胞呈水平方向紧密排列，分泌较多的浅层带蛋白，有助于润滑软骨表面，降低摩擦系数，提高软骨耐磨性；中层软骨细胞呈分散状态，分泌的胶原纤维相互交织，使中层软骨具有抗拉伸和剪切力的性能；深层软骨细胞成串排列，分泌最多的蛋白聚糖，使关节软骨富有弹性，深层的胶原纤维最粗，自下而上呈放射状排列，垂直于软骨表面，因此具有良好的抗压性能。
[0003]关节软骨再生能力有限，由于创伤、炎症、肿瘤、退变等原因导致的软骨损伤、缺失极为常见，且常继发骨关节炎，严重影响关节的功能。传统的治疗方法如关节灌洗术、关节清理术、微骨折手术、骨膜移植、自体或异体软骨移植等只能缓解症状，不能有效恢复受损组织功能。近年出现的软骨细胞移植技术，只能一定程度恢复软骨组织的结构功能，但需要二次手术，并且会对供区造成损伤。
[0004]组织工程方法再造软骨给临床上软骨的修复带来了希望。自体软骨细胞是构建组织工程关节软骨的首选种子细胞，但属于一种以损伤治疗损伤的修复办法，并且会受到患者自身软骨细胞状态限制，加上自体组织取材量少，有些甚至不能成功分离培养。这些因素都制约了其临床应用；哺乳动物源性软骨细胞因取材方便，无需损伤自身健康组织，且易培养获得足够优质种子细胞而倍受欢迎。软骨细胞的细胞膜上带有的组织相容性抗原是弱抗原，被软骨基质包埋形成保护性屏障，当软骨面完整时，由于没有软骨细胞的暴露，而软骨基质为低抗原，故排斥反应不明显。但是，哺乳动物源性软骨细胞的免疫原性仍不能轻视，已有文献报道异体软骨细胞移植引起机体免疫排斥，影响软骨损伤修复效果甚至造成修复失败。哺乳动物源性软骨移植的免疫反应与软骨基质的形态和数量有关，当软骨陷窝基本形成后，免疫排斥反应趋于稳定并减轻。但是该免疫反应以细胞免疫为主的慢性排斥反应，因此，降低哺乳动物源性软骨细胞的免疫原性仍是构建组织工程软骨不可忽略的问题。
[0005] 组织工程方法再造软骨所用的支架载体材料可以分为人工合成材料和天然生物可降解材料。人工合成材料主要分固体和液体两种，固体以聚羟基乙酸(PGA)、聚乳酸(PLA)及两者的共聚物(PLGA)为代表，其主要优点为可塑形，有一定的强度，但在生物相容性、理化性能、降解速率的控制等方面尚有许多问题有待解决，如PGA具有良好的生物相容性，但降解较快，易出现崩裂，使PGA整体塌陷，而且由于PGA降解过快，降解产物羟基酸在局部聚集，会造成pH值下降，使软骨细胞中毒甚至死亡；液体材料以氧化己丙烯为代表，它可在体内形成软骨，但该凝胶在常温下可溶于水，因而不能用于体外细胞构建支架的三维培养，且其体内降解产物对机体是否存在不良影响尚不清楚。天然生物可降解材料是与体内细胞外基质同源成分，例如，胶原、透明质酸、硫酸软骨素以及壳聚糖等均为软骨细胞外基质成分及其类似物，广泛存在于自然界中，天然生物可降解材料以其良好的生物相容性在组织工程研究中具有很高的应用价值。
[0006]经检索，中国专利02136560.1,03147950.2,200310109203.6 公开了构建异体细
胞来源组织工程软骨的方法，但均没有根据正常软骨的结构和功能进行分区域构建，可能导致制备的组织工程软骨与周围正常软骨及软骨下骨整合情况欠佳，且不能获得与天然软骨相一致的耐磨、抗压能力，专利中亦未采取有效手段降低异体细胞免疫排斥的风险，不能保证细胞在受体内存活并发挥功能。中国专利200610026862.7、200810102842.2分别采用脂肪间充质干细胞以及脐带间充质干细胞诱导分化成软骨细胞作为种子细胞，虽然间充质干细胞来源广泛，但向软骨方向诱导的间充质干细胞可能在基因表达、细胞外基质分泌、细胞信号传导等方面不能与正常软骨细胞完全一样，且无法确定向软骨细胞方向诱导的间充质干细胞能否长期稳定保持透明软骨特性。另外，在构建组织工程软骨时，采用人工合成的支架材料生物相容性较差，降解产物可能对机体产生不良影响。不采用支架材料无法为软骨细胞生长提供三维空间，无法解决培养过程中软骨细胞老化、纤维化等问题。中国专利200710078264.9构建了一种具有软骨层、钙化层和软骨下骨层的仿生功能界面骨软骨复合组织一体化工程支架，但未根据正常软骨的厚度设定所构建各层的相应厚度，容易导致所构建的支架在临床应用时与周围正常组织各层厚度不一致，植入后引起构建的支架各层与周围正常软骨各层错配，影响整合效果。按现有技术分层构建的组织工程软骨均存在这一问题。另外，由于软骨细胞被大量的细胞外基质包裹起来，细胞迁移困难，单纯的支架材料用于软骨组织修复仅能获得纤维软骨修复，长期效果欠佳。

【发明内容】

[0007]针对现有技术存在的问题，本发明的目的是提供一种关节软骨移植物及其制备方法，所制备关节软骨移植物的厚度、形状、大小与软骨损伤部位相匹配，无需术前塑形，关节软骨移植物具有浅层、中层和深层结构、与软骨损伤部位的周围正常软骨各层相匹配，免疫原性低,整合性好。
[0008]本发明所提出的关节软骨移植物的特征为，从外至内由浅层、中层和深层三层构成，每层的厚度、形状、大小均与软骨损伤部位相匹配，其中关节软骨移植物浅层由浅层软骨细胞及交联的II型胶原、转化生长因子-β (TGF-β )组成，中层由中层软骨细胞及交联的II型胶原、糖胺聚糖(GAG)、TGF-β、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)组成，深层由深层软骨细胞及交联的II型胶原、GAG、骨形态发生蛋白(BMP)、TGF-13组成；各层之间通过交联的II型胶原复合而成；所述浅层软骨细胞、中层软骨细胞和深层软骨细胞分别来源于哺乳动物源性正常软骨组织的浅层、中层和深层；所述交联的II型胶原是指II型胶原经过紫外线或京尼平交联。
[0009]本发明所提出的关节软骨移植物的制备方法，其特征在于，从哺乳动物正常软骨组织的浅层、中层和深层分别获得各层的软骨细胞，将浅层软骨细胞与交联的II型胶原溶胶混合，添加TGF-β后得到浅层细胞溶胶，将中层软骨细胞与交联的II型胶原溶胶混合，添加GAG、TGF-β、bFGF后得到中层细胞溶胶，将深层软骨细胞与交联的II型胶原溶胶混合，添加GAG、BMP、TGF-β后得到深层细胞溶胶；采用三维打印技术，将浅层、中层和深层细胞溶胶按照软骨缺损部位的大小、形状和厚度，从浅层至深层的顺序分层打印，再经体外培养得到关节软骨移植物；各层之间通过交联的II型胶原溶胶自然凝固复合而成。具体步骤包括:
步骤一、软骨细胞获取:将哺乳动物源性0.5~3mm3大小的正常浅层软骨组织先用
0.05~0.2%透明质酸酶溶液消化15分钟~I小时，每15分钟振荡一次，消化结束后用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗2次；再用0.15~0.25%的II型胶原酶溶液消化I~10小时，待组织解散，细胞间疏松时用PBS终止消化，200目筛网过滤后用PBS洗涤2遍，分离出原代浅层软骨细胞，按细胞密度I X IO4~5 X IO5个/cm2接种，加入培养液A，37°C、5%C02条件下进行原代培养；培养3~7天，浅层软骨细胞达到80~90%融合时传代，用0.1~0.5%胰酶溶液消化2~10分钟，用PBS终止消化并洗涤2遍，按细胞密度I X IO4~5X IO5个/cm2接种，加入培养液A，每3~7天传代一次，每3天换液一次；
将哺乳动物源性0.5~3mm3大小的正常中层软骨组织采用0.1~0.2% II型胶原酶溶液消化I~15小时，待组织解散，细胞间疏松时用PBS终止消化，200目筛网过滤后用PBS洗涤2遍，获得中层软骨细胞，按细胞密度I X IO4~2 X IO5个/cm2接种，加入培养液A，37°C、5%C02条件下进行原代培养；培养3~7天，中层软骨细胞达到80~90%融合时传代，用
0.1~0.5%胰酶溶液消化2~10分钟，用PBS终止消化并洗涤2遍，按细胞密度I X IO4~2 X IO5个/cm2接种，加入培养液A，每3~7天传代一次，每3天换液一次；
将哺乳动物0.5~3_3大 小的正常深层软骨组织先用0.05~0.15% X型胶原酶溶液消化0.5~2小时，消化结束后用PBS冲洗2次，再用0.05~0.15% II型胶原酶溶液消化I~10小时，待组织解散，细胞间疏松时PBS终止消化，200目筛网过滤后PBS洗涤2遍，获得深层软骨细胞，按细胞密度5 X IO4~5 X IO5个/cm2接种，加入培养液A，37°C、5%C02条件下进行原代培养；培养3~7天，深层软骨细胞达到80~90%融合时传代，用0.1~0.5%胰酶溶液消化2~10分钟，用PBS终止消化并洗涤2遍，按细胞密度5 X IO4~5 X IO5个/cm2接种，加入培养液A，每3~7天可传代一次，每3天换液一次；
上述消化分离原代细胞过程中所用消化酶溶液浓度均为质量体积比(某组分质量体积浓度1%是指IOOmL溶剂中含有Ig该组分,下同),使用体积约为软骨组织体积的10倍，上述原代及传代培养消化过程均在37°C、5%C02条件下进行；所述培养液A的组成为:在商用低糖型DMEM培养液中含有，胎牛血清(FBS)IOOmL/ L、L_谷氨酰胺10~500 μ g/mL和维生素 C (Vc) 50 ~100 μ g/mL ο
[0010]本步骤根据天然软骨组织具有层状分布不均一、各层区域细胞生长率和基因表达不同、细胞外基质成分也不尽相同的特点，分别采用不同的消化方法获得各层软骨细胞作为种子细胞，使所构建的关节软骨移植物各层与植入处的周围正常软骨组织各层相吻合，二者的细胞生长率、基因表达、细胞外基质成分一致，相互间能够更好地进行信号传递、转导，促进整合。
[0011]步骤二、软骨细胞溶胶制备:用体积浓度为5%。的醋酸溶液溶解II型胶原，4°C搅拌过夜后经紫外线或京尼平交联，制备15~30mg/mL、10~20mg/mL和6~15mg/mL交联的II型胶原溶胶；所述紫外线或京尼平交联是指在0°C条件下紫外线照射0.5~5小时或在O~40°C条件下加入1/5~1/10体积的质量体积浓度为0.01~2%的京尼平水溶液，交联时间为0.5~3小时；
分别将步骤一获得的第2飞代各层软骨细胞分别离心，弃去上清；用培养液A调整浅层软骨细胞悬液浓度为2 X IO6~6 X IO7个/mL，加入1/40体积的3mol/L的4-羟乙基哌嗪乙磺酸溶液(HEPES溶液)后，按体积比1:1与15~30mg/mL交联的II型胶原溶胶混合，添加终浓度为5~10ng/mL的TGF-β，制备成浅层细胞溶胶；用培养液A调整中层软骨细胞悬液浓度为5 X IO5~2 X IO7个/mL，加入1/40体积的3mol/L的HEPES溶液后，按体积比1:1与10~20mg/mL交联的II型胶原溶胶混合，添加终浓度为I~10mg/mL的GAG、I~5ng/mL的TGF-β和I~50ng/mL的bFGF，制备成中层细胞溶胶；用培养液A调整深层软骨细胞悬液浓度为5 X IO4~5 X IO5个/mL，加入1/40体积的3mol/L的HEPES溶液后，按体积比1:1与6~15mg/mL交联的II型胶原溶胶混合，添加终浓度为5~30mg/mL的GAG、5~IOOng/mL的BMP和I~20ng/mL的TGF- β，制备得到深层细胞溶胶；
步骤三、关节软骨移植物的构建:将三维打印快速成型机的打印系统进行消毒，设置进料仓温度维持4°C，打印平台温度37°C，三轴运动控制平台参数设置为:X轴和y轴间隔均为0.05~5μπι，ζ轴间隔为0.1~2.5 μ m，注射器控制模块参数设定为:注射喷头内径为110~260 μ m，线性打印速度为I~IOmm/秒，注射器喷头线性速度为I~50 μ m/秒；将步骤二制备的浅层、中层 和深层细胞溶胶分别置于进料仓，关节软骨移植物的浅层打印厚度为0.02~0.5mm,中层打印厚度为0.1~1.4mm，深层打印厚度为软骨损伤部位的总厚度与已构建的浅层、中层关节软骨移植物的差值；三维打印快速成型机可根据软骨损伤部位的三维数据，从浅层至深层逐层打印关节软骨移植物，每层打印完成后，在37°C条件下固化10~30分钟，构建完成关节软骨移植物；
步骤三采用三维打印技术进行关节软骨移植物的构建，这种打印技术能通过将原材料先逐行铺开后逐层垂直铺展的方式来打印。将软骨损伤部位的损伤形状和大小、软骨各层的厚度转化为三维数据发送给三维打印快速成型机，三维打印快速成型机据此计算出需要打印多少层细胞来修复软骨损伤，通过对三维打印快速成型机三轴运动控制平台和注射控制模块多参数的设定，实现三维打印关节软骨移植物。
[0012]步骤四、关节软骨移植物的培养:将步骤三获得的关节软骨移植物置于培养液B中，超过关节软骨移植物高度2~3mm，37°C、5%C02条件下培养3~10天，每3天换液I次，制备得到关节软骨移植物；所述培养液B的组成为:在商用低糖型DMEM培养液中含有，胎牛血清100mL/L、L_谷氨酰胺146~585 μ g/mL、Vc为50~100 μ g/mL、转化生长因子-β !(TGF-^1)为5~10ng/mL、碱性成纤维细胞生长因子-2 (bFGF-2)为5~25ng/mL。
[0013]将步骤三构建的关节软骨移植物在体外培养时，培养液B中的TGF- β I及bFGF-2能够促进软骨细胞增殖和基质合成代谢，使软骨细胞被自身分泌细胞外基质所包裹，为软骨细胞提供生物力学支撑，而且细胞外基质所形成的三维空间结构有助于维持软骨细胞的形态和功能。同时，交联的II型胶原溶胶凝固后能够避免软骨细胞流失，使软骨细胞能够在损伤部位发挥修复作用，而且能有效隔离参与机体免疫应答或与免疫应答相关的细胞即免疫细胞，避免宿主致敏、降低免疫反应的作用。
[0014]与现有产品相比，本发明制备的关节软骨移植物优点体现在:(1)具有和天然软骨一致的浅层、中层和深层三层结构，构建各层的细胞来源于正常软骨相对应各层细胞，因此关节软骨移植物每一层的厚度、大小、形状、细胞组成等方面与软骨损伤区域相匹配；植入损伤部位后与周围正常软骨各层分布相对应，有利于细胞间的信号传递、转导及调控，能够与周围正常软骨组织更好的整合。(2)具有和天然软骨一致的结构特征，即从浅层到深层II型胶原含量逐渐降低，GAG含量逐渐升高，因此制备的关节软骨移植物具有良好的抗压性和耐磨性；软骨移植物中的软骨细胞被细胞外基质包裹，避免软骨移植物植入后发生免疫排斥，使其能够长期存活并发挥功能，提高软骨修复长期疗效。
[0015]与现有技术相比，本发明制备方法的优点体现在:(I)采用三维打印技术，按照软骨损伤部位的三维数据由浅层至深层逐层打印关节软骨移植物，植入损伤部位后能够与周围正常软骨各层分布相对应，有利于细胞间的信号传递、转导及调控，能够与周围正常软骨组织更好的整合。(2)通过添加TGF-β、bFGF、BMP和步骤四的体外培养过程，促进软骨细胞的增殖和细胞外基质的分泌，从而使关节软骨移植物各层细胞外基质中的胶原纤维在含量、结构和空间分布特点与正常软骨一致；通过添加不同浓度的II型胶原和GAG，使所制备的关节软骨移植物具备天然软骨的结构特征，即从浅层到深层II型胶原含量逐渐降低，GAG含量逐渐升高，因此制备的关节软骨移植物具有良好的抗压性和耐磨性。(3)本发明采用的紫外线或京尼平的交联方法细胞毒性低，通过增加II型胶原的交联强度可提高其机械强度，从而显著增加关节软骨移植物的抗压性，使其能够承受关节运动时产生的复杂的作用力。
【专利附图】

【附图说明】
[0016]图1为本发明制备的关节软骨移植物示意图，图中所示1，2，3分别为三维打印技术打印的关节软骨移植物深层、中层和浅层。
[0017]图2为本发明制备的关节软骨移植物外观照片及组织学切片甲苯胺蓝染色结果，切片结果可见细胞周围基质呈现明显的紫色，形成类似软骨陷窝将细胞包裹在内，与天然透明软骨细胞的染色结果和存在状态一致。
[0018]图3为本发明制备的兔关节软骨移植物在同种异体兔背部皮下植入6周取材外观照片及组织学切片结果图片。结果显示，植入的关节软骨移植物已形成明显的异位软骨(图3A)，并且甲苯胺蓝(图3B)和番红_0(图3C)切片染色结果显示形成的异位软骨具有典型的透明软骨细胞异染性，并且有大量软骨陷窝形成，与天然透明软骨的结构高度一致，并且取材时并未见明显的炎症 反应，说明本发明制备的关节软骨移植物具有免疫原性低的特点。
[0019]图4为本发明制备的兔关节软骨移植物修复兔关节软骨损伤8周后取材结果外观照片及组织学切片结果图片。取材时未见关节腔内有炎症反应，图4A外观照结果显示修复部位光滑平整，色泽、亮度与周围正常软骨组织接近，与周围正常软骨组织分界不明显，图4B甲苯胺蓝及图4C番红-O切片染色结果显示损伤部位的新生软骨为透明软骨，具有与天然软骨一致的浅层、中层、深层的三层结构，说明本发明采用三维打印技术构建的关节软骨移植物不仅在厚度、大小、形状、细胞组成等方面与软骨损伤区域相匹配，而且能够实现浅层、中层、深层与正常软骨结构一致。
[0020]图5为采用本发明制备的关节软骨移植物修复猪关节软骨损伤6月后取材结果外观照片及组织学切片结果图片。图5A外观照及图5B番红-O染色组织学切片结果显示损伤部位的软骨获得良好修复，表面光滑平整，与周围正常软骨整合情况良好，未见有任何磨损或压塌的迹象。说明本发明制备的关节软骨移植物具有良好的抗压耐磨性能，能够应用于负重部位及大面积的软骨损伤修复。
【具体实施方式】
[0021]以下结合实例对本发明技术方案作进一步的详细说明。实例I中所采用的正常兔各层软骨组织来源于第四军医大学动物实验中心提供健康成年兔关节软骨；实例2中所采用的正常猪各层软骨组织取自屠宰场新鲜屠杀的健康猪关节，清除肌肉、滑膜和血溃等；实例中浅层、中层及深层三层软骨组织的获取采用Vibratome公司的半自动震动切片机Vibratomel500，先测量软骨组织总厚度，按照浅层厚度占10~20%、中层厚度占40~60%和深层厚度占20~30%计算各层的厚度，输入切片机中完成各层的分离；实例I中使用的三维打印快速成型机为Z Corporation生产的Z510 ;实例2中使用的三维打印快速成型机为北京上拓科技有限公司生产的Pro jet? CP CPX 3500 3D打印机；实例I中使用的64层螺旋CT及核磁共振(MRI)为德国西门子生产；实例2中使用的三维扫描仪是北京上拓科技有限公司的非接触式Rexcan III三维扫描仪。
[0022]实施例1、
步骤一、软骨细胞获取:将兔浅层软骨组织剪成0.5~3mm3大小，先用10倍体积的
0.l%(w/v)透明质酸酶溶液消化30分钟，每15分钟振荡一次，消化结束后用PBS冲洗2次；再加入10倍体积0.2% (w/v)的II型胶原酶溶液消化4小时，用PBS终止消化并充分吹打细胞，200目筛网过滤后用PBS洗涤2遍，分离出原代浅层软骨细胞，按细胞密度I X IO5个/cm2接种于培养瓶，加入培养液A，37°C、5%C02培养箱培养3天后，浅层软骨细胞达到80%以上融合时传代，加入10倍体积0.25% (w/v)胰酶溶液消化3分钟，PBS终止并洗涤2遍，按细胞密度I X IO4个/cm2接种，加入培养液A，每3天传代一次；
将兔中层软骨组织剪成0.5~3_3大小，采用10倍体积的0.15% (w/v) II型胶原酶溶液消化5小时，PBS终止消化并充分吹打，200目筛网过筛，PBS洗涤2遍后获得中层软骨细胞，按细胞密度5 X IO4个/cm2接种，加入培养液A，37°C、5%C02培养箱培养3天后，细胞达到80%以上融合时传代，用10倍体积的0.25% (w/v)胰酶溶液消化4分钟，PBS终止并洗涤2遍，按细胞密度2 X IO4个/cm2接种，加入培养液A，每3天传代一次；
将兔深层软骨组织剪成0.5~3_3大小，先用10倍体积的0.1% (w/v) X型胶原酶溶液消化45分钟，消化结束后用PBS冲洗2次，再用10倍体积的0.1% (w/v) II型胶原酶溶液消化3小时，用PBS终止消化，并充分吹打，200目筛网过筛，PBS洗涤2遍后获得深层软骨细胞，按细胞密度I X IO5个/cm2接种，加入培养液A，37°C、5%C02培养3天后，细胞达到80%以上融合时传代，加入10倍体积0.25% (w/v)胰酶溶液消化4分钟，PBS终止并洗涤2遍，按细胞密度5 X IO4个/cm2接种，加入培养液A，每3天传代一次；
上述原代及传代培养消化过程均在37°C、5%C02条件下进行；所述培养液A的组成为:在商用低糖型DMEM培养液中含有，胎牛血清100mL/L、L-谷氨酰胺100 μ g/mL和Vc 50 μ g/mL。
[0023]步骤二、软骨细胞溶胶制备:用5%。(v/v)的醋酸溶液溶解II型胶原，4°C搅拌过夜，放置冰浴中紫外照射2小时后,制备16mg/mL、10mg/mL、8mg/mL 3个浓度的交联的II型胶原溶胶；分别将步骤一获得的第5代各层软骨细胞离心，弃去上清；用培养液A调整浅层软骨细胞悬液浓度2 X IO6个/mL，加入1/40体积的3mol/L的HEPES后，取0.5mL与0.5mL的16mg/mL交联的II型胶原溶胶混合，添加终浓度为5ng/mL的TGF-β，制备成浅层细胞溶胶；用培养液A调整中层软骨细胞悬液浓度为I X IO6个/mL，加入1/40体积的3mol/L的HEPES后，取2mL与2mL的10mg/mL交联的II型胶原溶胶混合，添加终浓度为2mg/mL的GAG、Ing/mL的TGF- β和20ng/mL的bFGF，制备成中层细胞溶胶；用培养液A调整深层软骨细胞悬液浓度为I X IO5个/mL,加入1/40体积的3mol/L的HEPES后，取1.5mL与1.5mL的8mg/mL交联的II型胶原溶胶混合，添加终浓度为10mg/mL的GAG、10ng/mL的BMP和5ng/mL的TGF- β，得到深层细胞溶胶；
步骤三、关节软骨移植物的构建:采用64层螺旋CT及MRI对兔软骨损伤部位进行检测，从而得知软骨损伤部位的总厚度、损伤的形状和大小，用计算机辅助设计(CAD)软件将所获得的检测结果转化为立体光刻(STL)文件，传输给三维打印快速成型机。[0024]将三维打印快速成型机的打印系统消毒，设置进料仓维持4°C，打印平台维持37°C，三轴运动控制平台参数设置为:x轴和y轴间隔均为0.1 μ m，z轴间隔为0.15μπι，注射器控制模块参数设定为:注射喷头内径为110 μ m，线性打印速度为5_/秒，注射器喷头线性速度为20 μ m/秒。
[0025]根据扫描得到的兔关节软骨损伤部位总深度为0.5mm以及文献报道兔软骨各层的比例(浅层比例14%，中层56%)计算得到浅层厚度为0.07 mm、中层厚度为0.28mm和深层厚度为0.15 mm (0.5-0.07-0.28=0.15 mm)，按照计算结果设置浅层、中层和深层的关节软骨移植物打印厚度(兔软骨各层比例参考文献=Bairati A, De Biasi S，Cheli F，etal.The head cartilage of cephalopods.1.Architecture and ultrastructure ofthe extracellular matrix[J].Tissue Cell.1987;19 (5):673-685.)。
[0026]将步骤三得到的浅层、中层、深层细胞溶胶分别放置于打印机的三个进料仓，三维打印快速成型机从浅层至深层开始逐层打印关节软骨移植物，各层的打印形状、大小按照打印指令要求进行，每层打印完成后在打印平台静置10分钟使其自然凝固，将三维打印快速成型机进料口连接至装有下一层细胞溶胶的进料仓进行下一层打印；
步骤四、关节软骨移植物的培养:将步骤三获得的关节软骨移植物置于培养液B中，没过关节软骨移植物高度2mm，37°C、5%C02条件下培养7天，每3天换液I次，制备完成关节软骨移植物；所述培养液B是指在商用低糖型DMEM培养液中含有，胎牛血清100mL/L，L-谷氨酰胺 146 μ g/mL、Vc 为 50 μ g/mL、TGF- β ι 为 5ng/mL、bFGF-2 为 5ng/mL。
[0027]本实例中制备各层细胞溶胶时使用的浅层、中层和深层细胞浓度相对较低，避免接种细胞过多导致新生软骨部位局部的软骨细胞量过大而与周围正常软骨组织形成明显分界，所用II型胶原及GAG浓度相对较低，更适用于软骨损伤面积较小或非负重部位的软骨修复。将制备得到的关节软骨移植物植入同种异体兔关节软骨的非负重损伤部位，其形状、大小与损伤部位相匹配，术前无需塑形，8周后取材，取材结果外观照(图4A)及组织学切片(图4B、图4C)结果显示损伤部位新生软骨表面光滑平整，与周围正常软骨分界不明显，损伤部位新生软骨具有与周围正常软骨一致的浅层、中层、深层的分层结构，并且与周围正常软骨各层相对应。
[0028]实施例2、步骤一、软骨细胞获取:将猪浅层软骨组织剪成0.5~3mm3大小，先用10倍体积的
0.15% (w/v)透明质酸酶溶液消化45分钟，每15分钟振荡一次，消化结束后用PBS冲洗2次；再加入10倍体积的0.25% (w/v) II型胶原酶溶液消化8小时，PBS终止消化并充分吹打，200目筛网过滤后用PBS洗涤2遍，分离出原代浅层软骨细胞，按细胞密度5父105个/cm2接种于培养瓶，加入培养液A，37°C、5%C02培养箱培养7天后，软骨细胞达到90%以上融合时传代，用10倍体积的0.5% (w/v)胰酶溶液消化8分钟，PBS终止并洗涤2次，按细胞密度I X IO5个/cm2接种，加入培养液A，每7天传代一次，每3天换液一次；
将猪中层软骨组织剪成0.5~3mm3大小，采用10倍体积的0.2% (w/v) II型胶原酶溶液消化14小时，PBS终止消化并充分吹打，200目筛网过筛，PBS洗涤2遍后获得中层软骨细胞，按细胞密度1\105个八1112接种，加入培养液4，371:、5%0)2培养箱培养7天后，细胞达到90%以上融合时传代，用10倍体积的0.5% (w/v)胰酶溶液消化8分钟，PBS终止并洗涤2次，按细胞密度I X IO5个/cm2接种，加入培养液A，每7天传代一次，每3天换液一次；将猪深层软骨组织剪成0.5~3mm3大小，先用10倍体积的0.15% X型胶原酶溶液消化I小时，消化结束后PBS冲洗2次，再用10倍体积的0.15% (w/v) II型胶原酶溶液消化10小时，用PBS终止消化，并充分吹打，200目筛网过筛，PBS洗涤2遍后获得深层软骨细胞，按细胞密度5 X IO5个/cm2接种，加入培养液A，37°C、5%C02培养7天后，细胞达到90%以上融合时传代，用10倍体积的0.5% (w/v)胰酶溶液消化8分钟，PBS终止并洗涤2次，按细胞密度I X IO5个/cm2接种，加入培养液A，每7天传代一次，每3天换液一次；
上述原代及传代培养消化过程均在37°C、5%C02条件下进行；所述培养液A的组成为:在商用低糖型DMEM培养液中含有，胎牛血清100mL/L、L-谷氨酰胺500 μ g/mL和Vc 75 μ g/mL。
[0029]步骤二、软骨细胞溶胶制备:用5%。(v/v)的醋酸溶液溶解II型胶原，4°C搅拌过夜得到II型胶原溶液；用纯化水将京尼平配成0.03% (w/v)的溶液，4°C下按体积比1:5与II型胶原溶液混合，充分搅拌，交联I小时，制备24mg/mL、18mg/mL、12mg/mL 3个浓度的交联的II型胶原溶胶；
分别将步骤一获得的第2代各层软骨细胞离心，弃去上清；用培养液A调整浅层软骨细胞悬液浓度5 X IO7个/mL，加入1/40体积的3mol/L的HEPES后，取ImL与ImL的25mg/mL交联的II型胶原溶胶混合，添加终浓度为8ng/mL的TGF-β，制备成浅层细胞溶胶；用培养液A调整中层软骨细胞悬液浓度为I X IO7个/mL，加入1/40体积的3mol/L的HEPES后，取3mL与3mL的18mg/mL交联的II型胶原溶胶混合，添加终浓度为8mg/mL的GAG、5ng/mL的TGF-β和30ng/mL的bFGF，制备成中层细胞溶胶；用培养液调整深层软骨细胞悬液浓度为5X IO5个/mL,加入1/40体积的3mol/L的HEPES后,取3mL与3mL的14mg/mL交联的II型胶原溶胶混合，添加终浓度为25mg/mL的GAG、80ng/mL的BMP和15ng/mL的TGF- β，得到深层细胞溶胶；
步骤三、关节软骨移植物的构建:通过Rexcan III三维扫描仪扫描猪软骨损伤部位，将3D影像传送至与三维打印快速成型机相连的计算机上，然后根据程序形成打印指令，即软骨损伤部位的总厚度、损伤的形状和大小。
[0030]将三维打印快速成型机的打印系统消毒，设置进料仓维持4°C，打印平台维持370C，三轴运动控制平台参数设置为:x轴和y轴间隔均为4 μ m，z轴间隔为2 μ m,注射器控制模块参数设定为:注射喷头内径为240 μ m,线性打印速度为8_/秒，注射器喷头线性速度为45 μ m/秒。
[0031]根据检测得到的猪关节软骨损伤部位总深度为1.8mm以及文献报道猪软骨各层的比例(浅层比例15%，中层55%)计算得到浅层厚度为0.24 mm、中层厚度为0.88mm和深层厚度为0.68 mm (1.8-0.24-0.88=0.68 mm)，按照计算结果设置浅层、中层和深层的关节软骨移植物打印厚度(猪软骨各层比例参考文献=Redler I, Zimny ML.Scanning electronmicroscopy of normal and abnormal articular cartilage and synovium [J].J BoneJoint Surg Am，1970，52(7):1395-1404.)。
[0032]将步骤三得到的浅层细胞溶胶置于打印机的进料仓，三维打印快速成型机按照STL文件完成浅层打印后，在37°C条件下静置20分钟使其自然凝固，同上操作进行中层、深层打印，最后构建完成关节软骨移植物。
[0033]步骤四、关节软骨移植物的培养:将步骤三获得的关节软骨移植物置于培养液B中，没过关节软骨移植物高度3mm，37°C、5%C02条件下培养10天，每3天换液I次，得到体外制备的关节软骨移植物。所述培养液B是指在商用低糖型DMEM培养液中含有，胎牛血清100mL/L, L-谷氨酰胺 585 μ g/mL、Vc 为 100 μ g/mL、TGF-β 丨为 10ng/mL、bFGF-2 为 IOng/mL。 [0034]本实例中采用的各层细胞浓度比实例I中高，使制备的关节软骨移植物中的软骨细胞能够更快的与周围软骨细胞建立细胞间联系，有利于更快的修复损伤部位，并与周围正常软骨组织更好的整合，可用于大面积或康复期较长的陈旧性软骨损伤修复；采用的II型胶原和GAG浓度比实例I中高，使制备的关节软骨移植物具有更好的机械强度，可用于负重部位软骨损伤修复。本实例使用的京尼平交联剂比紫外的交联强度高，交联后能够进一步提高胶原强度并延长关节软骨移植物体内降解时间，使关节软骨移植物体内降解时间与软骨再生时间相匹配，有助于获得较好的修复效果。将制备的关节软骨移植物植入同种异体猪关节软骨负重部位的大面积损伤部位，6月后取材，取材外观照(图5A)及番红-O组织学切片染色(图5B)结果均显示，损伤部位软骨已经获得良好修复，损伤部位新生软骨与周围正常软骨整合良好。
【权利要求】
1.本发明所提出的关节软骨移植物的特征为，从外至内由浅层、中层和深层三层构成，每层的厚度、形状、大小与软骨损伤部位的相匹配，其中关节软骨移植物浅层由浅层软骨细胞及交联的II型胶原、转化生长因子-β组成，中层由中层软骨细胞及交联的II型胶原、糖胺聚糖、转化生长因子-β、碱性成纤维细胞生长因子组成，深层由深层软骨细胞及交联的II型胶原、糖胺聚糖、骨形态发生蛋白、转化生长因子-β组成；各层之间通过交联的II型胶原复合而成；所述浅层软骨细胞、中层软骨细胞和深层软骨细胞分别来源于哺乳动物源性正常软骨组织的浅层、中层和深层；所述交联的II型胶原是指II型胶原经过紫外线或京尼平交联。
2.根据权利要求1中所述关节软骨移植物，其特征在于紫外线或京尼平交联是指在.0.C条件下紫外线照射0.5~5小时或在O~40°C条件下加入1/5~1/10体积的质量体积浓度为0.01~2%的京尼平水溶液，交联时间为0.5~3小时。
3.制备权利要求1所述的关节软骨移植物的方法，其特征在于，从哺乳动物正常软骨组织的浅层、中层和深层分别获得各层的软骨细胞，将浅层软骨细胞与交联的II型胶原溶胶混合，添加转化生长因子-β后得到浅层细胞溶胶，将中层软骨细胞与交联的II型胶原溶胶混合，添加糖胺聚糖、转化生长因子-β、碱性成纤维细胞生长因子后得到中层细胞溶胶，将深层软骨细胞与交联的II型胶原溶胶混合，添加糖胺聚糖、骨形态发生蛋白、转化生长因子-β后得到深层细胞溶胶；采用三维打印技术，将浅层、中层和深层细胞溶胶按照软骨缺损部位的大小、形状和厚度，从浅层至深层的顺序分层打印，再经体外培养得到关节软骨移植物；各层之间通过交联的II型胶原溶胶自然凝固复合而成；所述浅层软骨细胞、中层软骨细胞和深层软骨细胞分别来源于哺乳动物源性正常软骨组织的浅层、中层和深层；所述交联的II型胶原溶胶是指将II型胶原配制成溶液，在(TC条件下紫外线照射0.5~5小时或在O~40°C条件下加入1/5~1/10体积的质量体积浓度为0.01~2%的京尼平水溶液，交联时间为0.5~3小时，再调节pH至中性。
4.根据权利要求3中所述关节软骨移植物的制备方法，其特征在于，具体步骤包括: 步骤一、软骨细胞获取:将哺乳动物源性0.5~3mm3大小的正常浅层软骨组织先用.0.05~0.2%透明质酸酶溶液消化15分钟~I小时，每15分钟振荡一次，消化结束后用磷酸盐缓冲液冲洗2次；再用0.15~0.25%的II型胶原酶溶液消化I~10小时，待组织解散，细胞间疏松时用磷酸盐缓冲液终止消化，200目筛网过滤后用磷酸盐缓冲液洗涤2遍，分离出原代浅层软骨细胞，按细胞密度I X 104~5 X 105个/cm2接种，加入培养液A，37°C、.5%C02条件下进行原代培养；培养3~7天，浅层软骨细胞达到80~90%融合时传代，用.0.1~0.5%胰酶溶液消化2~10分钟，用磷酸盐缓冲液终止消化并洗涤2遍，按细胞密度.I X 104~5 X 105个/cm2接种，加入培养液A，每3~7天传代一次，每3天换液一次； 将哺乳动物源性0.5~3mm3大小的正常中层软骨组织采用0.1~0.2% II型胶原酶溶液消化I~15小时，待组织解散，细胞间疏松时用磷酸盐缓冲液终止消化，200目筛网过滤后用磷酸盐缓冲液洗涤2遍，获得中层软骨细胞，按细胞密度I X 104~2 X 105个/cm2接种，加入培养液A，37°C、5%C02条件下进行原代培养；培养3~7天，中层软骨细胞达到80~90%融合时传代，用0.1~0.5%胰酶溶液消化2~10分钟，用磷酸盐缓冲液终止消化并洗涤2遍，按细胞密度I X 104~2 X 105个/cm2接种，加入培养液A，每3~7天传代一次，每3天换液一次；将哺乳动物源性0.5~3mm3大小的正常深层软骨组织先用0.05~0.15% X型胶原酶溶液消化0.5~2小时，消化结束后用磷酸盐缓冲液冲洗2次，再用0.05~0.15% II型胶原酶溶液消化I~10小时，待组织解散，细胞间疏松时磷酸盐缓冲液终止消化，200目筛网过滤后磷酸盐缓冲液洗涤2遍，获得深层软骨细胞，按细胞密度5 X IO4~5 X IO5个/cm2接种，加入培养液A，37°C、5%C02条件下进行原代培养；培养3~7天，深层软骨细胞达到80~.90%融合时传代，用0.1~0.5%胰酶溶液消化2~10分钟，用磷酸盐缓冲液终止消化并洗涤2遍，按细胞密度5 X IO4~5 X 1O5个/cm2接种，加入培养液A，每3~7天可传代一次，每3天换液一次； 上述消化分离原代细胞过程中所用消化酶溶液浓度均为质量体积比，使用体积约为软骨组织体积的10倍，上述原代及传代培养消化过程均在37°C、5%C02条件下进行；所述培养液A的组成为:在商用低糖型DMEM培养液中含有，胎牛血清100mL/L、L-谷氨酰胺10~.500 μ g/mL 和维生素 C 50 ~100 μ g/mL ； 步骤二、软骨细胞溶胶制备:用体积浓度为5%。的醋酸溶液溶解II型胶原，4°C搅拌过夜后经紫外线或京尼平交联，制备15~30mg/mL、10~20mg/mL和6~15mg/mL交联的II型胶原溶胶；所述紫外线或京尼平交联是指在(TC条件下紫外线照射0.5~5小时或在O~.40°C条件下加入1/5~1/10体积的质量体积浓度为0.01~2%的京尼平水溶液，交联时间为0.5~3小时； 分别将步骤一获得的第2飞代各层软骨细胞分别离心，弃去上清；用培养液A调整浅层软骨细胞悬液浓度为2 X IO6~6 X IO7个/mL，加入1/40体积的3mol/L的4-羟乙基哌嗪乙磺酸溶液后，按体积比1:1与15~30mg/mL交联的II型胶原溶胶混合，添加终浓度为5~10ng/mL的转化生长因子 -β，制备成浅层细胞溶胶；用培养液A调整中层软骨细胞悬液浓度为5Χ1O5~2Χ 1O7个/mL，加入1/40体积的3mol/L的4-羟乙基哌嗪乙磺酸溶液后，按体积比1:1与10~20mg/mL交联的II型胶原溶胶混合，添加终浓度为I~10mg/mL的糖胺聚糖、1~5ng/mL的转化生长因子-β和I~50ng/mL的碱性成纤维细胞生长因子,制备成中层细胞溶胶；用培养液A调整深层软骨细胞悬液浓度为5 X 1O4~5 X IO5个/mL，加入.1/40体积的3mol/L的4-轻乙基哌嗪乙磺酸溶液后,按体积比1:1与6~15mg/mL交联的II型胶原溶胶混合，添加终浓度为5~30mg/mL的糖胺聚糖、5~100ng/mL的骨形态发生蛋白和1~20ng/mL的转化生长因子-β，制备得到深层细胞溶胶； 步骤三、关节软骨移植物的构建:采用步骤二制备的浅层、中层和深层细胞溶胶，使用三维打印快速成型机从浅层至深层逐层打印关节软骨移植物，关节软骨移植物的浅层打印厚度为0.02~0.5mm,中层打印厚度为0.1~1.4mm，深层打印厚度为软骨损伤部位的总厚度与已构建的浅层、中层关节软骨移植物的差值；每层打印完成后，在37°C条件下固化.10~30分钟，构建完成关节软骨移植物； 步骤四、关节软骨移植物的培养:将步骤三获得的关节软骨移植物置于培养液B中，超过关节软骨移植物高度2~3mm，37°C、5%C02条件下培养3~10天，每3天换液I次，制备得到关节软骨移植物；所述培养液B的组成为:在商用低糖型DMEM培养液中含有，胎牛血清100mL/L、L_谷氨酰胺146~585 μ g/mL、维生素C为50~100 μ g/mL、转化生长因子-β ι为5~10ng/mL、碱性成纤维细胞生长因子-2为5~25ng/mL。
5.根据权利要求1中所述关节软骨移植物，其特征在于，所述关节软骨移植物在软骨`损伤修复中的应用。
【文档编号】A61F2/30GK103920190SQ201310012363
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2013年1月14日 优先权日:2013年1月14日
【发明者】丛丽媛, 刘影 申请人:陕西博鸿生物科技有限公司