专利名称：一种穿透型tat-talen蛋白及内源性基因被敲除的细胞的制备方法和应用的制作方法
技术领域：
: 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种穿透型TAT-TALEN蛋白及内源性基因敲除的细胞的制备方法和应用。
背景技术：
:艾滋病(AIDS)是由艾滋病病毒(HIV)感染引起的一种严重威胁人类健康的传染性疾病。研究表明CCR5是HIV入侵细胞最重要的共受体，世界上有一小部分人群的CCR5基因天然存在着32个碱基的缺失(CCR5 Δ 32)，他们不易被HIV感染且能够正常的生活。一位同时感染了 HIV的白血病人接受CCR5 Λ 32/Λ 32的供体造血干细胞(HSCs)骨髓移植，停止HAART治疗20个月后，没有出现病毒的反弹，随后观察到该病人免疫系统成功重建，病毒储存库随着时间的推移也在减小。这是世界首例通过干细胞移植获得治愈的艾滋病患者。但这种治疗手段并不能广泛应用，因为CCR5 Δ 32纯合子的人只有极少的一部分，难以找到同配型的CCR5 Δ 32供体进行骨髓造血干细胞移植。以转录激活因子样效应因子核酸酶(TALEN)为代表的基因打靶技术可以实现指定基因的靶向性敲除。利用这种技术即可以人为的将野生型的CCR5突变为失活型的CCR5。艾滋病的干细胞治疗策略即变成了利用类似于TALEN这种核酸酶工具敲除艾滋病病人体内造血干细胞内的CCR5基因再进行自体造血干细胞移植。近期的研究表明，多能诱导干细胞(iPSCs)因为来源广泛，易于在体外长期培养，且敲除了 CCR5基因的iPSCs能够定向分化成具有全能型的造血干细胞，可作为获取CCR5缺失型造血干细胞的一种替代选择，很有应用前景。但不管是直接敲除HSCs内的CCR5基因，还是先敲除人的iPSCs内的CCR5基因再间接获得CCR5缺失型的造血干细胞，都需要将TALEN输送到细胞中进行基因敲除。而现有的以病毒或者质粒为载体输送TALEN的方法有可能引起细胞内基因的插入型突变，对于临床上的使用并不安全
发明内容
:本发明的第一目的是提供一种能够敲除细胞内源性基因的穿透型TAT-TALEN蛋白。本发明能够敲除细胞内源性基因的穿透型TAT-TALEN蛋白，其特征在于，其是在TALEN蛋白的L链和R链的N端还具有细胞穿透多肽TAT，所述的细胞穿透多肽TAT的氨基酸序列为:N 端-TyrGlyArgLysLysArgArgGlnArgArgArg-C 端。上述穿透型TAT-TALEN蛋白在敲除细胞内源性基因中的应用。编码上述能够敲除细胞内源性基因的穿透型TAT-TALEN蛋白的L链和R链的核苷酸序列。为了针对内源性CCR5基因，本发明的能够敲除细胞内源性CCR5基因的穿透型TAT-TALEN蛋白的L链是由SEQ ID N0.1所示序列的碱基编码的，穿透型TAT-TALEN蛋白的R链是由SEQ ID N0.2所示序列的碱基编码的。该穿透型TAT-TALEN蛋白能敲除细胞内源性CCR5基因而在制备艾滋病基因治疗药物中应用。一种内源性CCR5基因被敲除的细胞的制备方法，其特征在于，将编码上述能够敲除细胞内源性CCR5基因的穿透型TAT-TALEN蛋白的L链和R链的核苷酸序列分别插入原核表达载体中，然后原核表达出能够敲除细胞内源性CCR5基因的穿透型TAT-TALEN蛋白的L链和R链，将穿透型TAT-TALEN蛋白的L链和R链与含有内源性CCR5基因的细胞孵育以敲除CCR5基因，从而得到内源性CCR5基因被敲除的细胞。所述的孵育优选为将穿透型TAT-TALEN蛋白的L链和R链与含有CCR5基因的细胞在37°C孵育I小时，用细胞完全培养基更换细胞培养液以去除穿透型TAT-TALEN蛋白，再在30°C常规培养24小时，再与穿透型TAT-TALEN蛋白的L链和R链混合37°C孵育I小时，再用细胞完全培养基更换细胞培养液以去除穿透型TAT-TALEN蛋白，再在30°C常规培养24小时,如此再重复一次。本发明所述的TALEN蛋白是指转录激活因子样效应因子核酸酶，其包括TALEN L链和R链。本发明的穿透型TAT-TALEN蛋白能够敲除细胞内源性基因，尤其可以敲除细胞内源性CCR5基因，因此可将其应用于临床上艾滋病基因治疗中的CCR5基因敲除。应用本发明在对CCR5基因进行敲除的同时没有引入任何的外源基因，不存在随机插入到细胞的基因组中引起插入型突变的风险，并且TAT-TALEN蛋白进入细胞发挥作用后会逐渐被细胞降解不会一直存在于细胞内。由此可见本发明可以简单安全的敲除细胞内源性CCR5基因，可以作为艾滋病治疗的药物，用于艾滋病的基因治疗中。
图1是构建的 TAT-TALEN蛋白结构示意图；其中:standard TALEN L/R:未经改造的标准转录激活子样效应因子核酸酶；TAT-TALEN L/R:TAT修饰的转录激活子样效应因子核酸酶；His:6组氨酸纯化标签；TAT:细胞穿透肽TAT短肽；NLS:核定位序列；transcription activator-like domain:转录激活子样结构域；FokI:FokI 核酸酶结构域。图2是最终纯化获得的TALEN蛋白SDS-PAGE检测图；其中:TALEN L:TALEN蛋白的 L 链；TALEN R: TALEN 蛋白的 R 链；TAT-TALEN L: TAT-TALEN 蛋白的 L 链;TAT_TALENR:TAT-TALEN 的 R 链。图3是所纯化的TALEN蛋白体外活性检测:其中，standard TALENs =TALEN L与TALEN R 构成的一对 TALEN ;TAT_TALENs:TAT-TALEN L 与 TAT-TALEN R 构成的一对 TALEN ；substrate:PCR扩增的包含TALEN识别位点的CCR5片段；products =TALEN特异性酶切CCR5片段得到的产物。图4是对所纯化的TALEN蛋白穿透细胞的Western blot检测:其中:pre-transduction lysate:在与蛋白进行孵育前的细胞样品；post_transductionlysate:在与蛋白进行孵育后的细胞样品；TALEN L:与TALEN L孵育后的细胞样品；TALENR:与TALEN R孵育后的细胞样品；TAT-TALEN L:与TAT-TALEN L孵育后的细胞样品；TAT-TALEN R:与TAT-TALEN R孵育后的细胞样品；GAPDH:内参甘油醛-3-磷酸脱氢酶。
图5是TALEN或TAT-TALEN蛋白与Hela细胞和hiPSCs细胞孵育后对细胞内源性CCR5基因被敲除情况的Surveyor酶切检测结果。图6是TAT-TALEN蛋白处理后的HeLa细胞基因组CCR5的测序结果比对:其中:WT:野生型的CCR5序列deletions:TAT-TALEN切割靶序列后细胞进行DNA修复引入的核苷酸缺失insertions:TAT-TALEN切割靶序列后细胞进行DNA修复引入的核苷酸插入。
具体实施例方式为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例1:利用穿透型TAT-TALEN蛋白敲除HeLa细胞及hiPSCs细胞内源性CCR5基因。 标准型TALEN和TAT-TALEN原核表达载体的构建(图1):1、CCR5特异性TALEN原核表达载体的构建。本实施例的TALEN序列的L链(TALEN L)的编码序列如SEQ ID N0.1的第37-3021位碱基所示，TALEN序列的R链(TALEN R)的编码序列如SEQ ID N0.2的第37-3021位碱基所示。本实施例的TAT-TALEN序列的L链(TAT-TALEN L)的编码序列如SEQ ID N0.1所示，TAT-TALEN序列的R链(TAT-TALEN R)的编码序列如SEQ ID N0.2所示，其是在TALEN序列的5’端添加了细胞穿透多肽TAT的编码序列，其序列如SEQ ID N0.1或2的第4_36位碱基所示。本实施例用到的靶向CCR5的TALEN L和TALEN R均含有17个重复单元，分别能够特异性识别CCR5基因中的17个核苷酸(TALEN L识别TCATTACACCTGCAGCT ；TALEN R识别 CTTCCAGAATTGATACT)，其中 HD 识别 C，NI 识别 A, NG 识别 T, NN 识别 G。参照:如SEQ ID N0.1的第37-3021位碱基所示的TALEN序列的L链(TALEN L)的编码序列，和如SEQ ID N0.2的第37-3021位碱基所示的TALEN序列的R链(TALEN R)的编码序列，采用GoldenGate质粒组装法构建TALEN (TALEN L或TALEN R)真核载体。a)第1-10个重复单元的每一个模式载体(各150ng) +pFUS_A载体(150ng)或第
11-16个重复单元的每一个模式载体(各150ng) +pFUS_B载体(150ng)b) Bsal 酶(I μ I)c ) T-4DNA 连接酶(I μ I)(0 10父了40嫩连接酶缓冲液(2“1)e)补充水至20 μ I反应条件:10X(37°C /5min+16°C /lOmin) +50°C /5min+80°C /5min0加入a) IOmM ATP ；b) Plasmid-Safe 核酸酶(I μ I)
37°C条件下孵育I小时。将产物转化到TOP-1O感受态菌株中，在含10mg/L四环素，50mg/L壮观霉素，50mg/L氨节青霉素，40mg/L X-gal, 24mg/L的IPTG的LB平板中挑选出白色单克隆，扩大培养后提取质粒，分别获得含有1-10重复单元的pFUS_A质粒(载体A)和11-16重复单元的pFUS_B质粒(载体B)。a)载体A和载体B (各150ng)b)pLR载体( 150ng)，包含第17个重复单元c)骨架载体 pTAL (75ng)
(1#8卩31酶(14 1)e ) T-4DNA 连接酶(I μ I)€)10父了40嫩连接酶缓冲液(2“1)g)补充水至20 μ I反应条件:10X(37°C /5min+16°C /lOmin) +37°C /15min+80°C /5min将产物转化到TOP-1O感受态菌株中，在含50mg/L氨苄青霉素，40mg/L X-gal和24mg/LIPTG的LB平板中挑选白色单克隆菌落，扩大培养后提取含有全长TALEN的pTAL质粒，即为最终获得的TALEN L和TALEN R真核表达载体。利用PCR扩增的方法从上述TALEN (TALEN L或TALEN R)真核表达载体中扩增出TALEN (以TALEN L真核表达载体为模板则扩增出TALEN L链，以TALEN R真核表达载体为模板则扩增出 TALEN R 链)(引物:GGAATTCCATATGGCTCCAAAGAAGAAGCG 和 CCCAAGCTITTAAAAGTTTATCTCGCCGTTAT)和TAT-TALEN (以TALEN L真核表达载体为模板则扩增出TAT-TALENL链，以TALEN R真核表达载体为模板则扩增出TAT-TALEN R链)(引物:GGAATTCCATATGTACGGTCGTAAAAAACGTCGTCAGCGTCGTCGTATGGCTCCAAAGAAGAAGCG 和 CCCAAGCTTTTAAAAGTTTATCTCGCCGTTAT)，用NedI和BamHI双酶切克隆到pET28a原核表达载体上。最终获得TAT-TALENL及TAT-TALENR的原核表达载体pET28a-TAT-TALEN L(经测序验证如SEQ ID N0.1所示的序列插入了 pET28a原核表达载体中)和pET28a-TAT-TALEN R (经测序验证如SEQ ID N0.2所示的序列插入了 pET28a原核表达载体中)(图1)。作为对照，标准型TAELN L及TALENR原核表达载体pET28a-TALEN L (经测序验证如SEQ ID N0.1所示的序列的第37-3021位碱基插入了 pET28a原核表达载体中)和pET28a-TALEN R (经测序验证如SEQ ID N0.2所示的序列的第37-3021位碱基插入了 pET28a原核表达载体中)也一同构建，然后再转化进入大肠杆菌 Escherichia coli BL21 (DE3)中。TALEN L和TALEN R真核表达载体也可以使`用按照文献Miller JC, etal.2011.A TALE nuclease architecture for efficient genome editing.NatBiotechnol29:143-148 构建的 TALEN L 和 TALEN R 真核表达载体。或者人工合成如SEQ ID N0.1所示的序列，可通过在其前后分别加入Ned I和BamHI酶切位点的方式，将其插入pET28a原核表达载体中，而得到原核表达载体pET28a-TAT-TALEN L ;以及人工合成如SEQ ID N0.2所示的序列，可通过在其前后分别加入Ned I和BamHI酶切位点的方式，将其插入pET28a原核表达载体中，而得到原核表达载体pET28a-TAT-TALEN R。同理，人工合成如SEQ ID N0.1所示序列的第37-3021位碱基，可通过在其前后分别加入Ned I和BamHI酶切位点的方式，再插入pET28a原核表达载体中，而得到原核表达载体pET28a-TALEN L ;以及人工合成如SEQ ID N0.2所示序列的第37-3021位碱基，可通过在其前后分别加入Ned I和BamHI酶切位点的方式，再插入pET28a原核表达载体中，而得到原核表达载体pET28a-TALEN R02、TAT-TALEN 蛋白的纯化转化有重组表达质粒(pET28a-TAT-TALENL 或 pET28a_TAT_TALEN R)的Escherichia coliBL21 (DE3)经 IPTG16 °C 过夜诱导，收集所得到的表达 TAT-TALEN L 和TAT-TALEN R蛋白的菌体。经过高压破碎后离心后获得可溶性的上清，进行Ni柱亲和层析。待目的蛋白与Ni柱结合之后，先用漂洗缓冲液(20mM Tris-HCl, 500mM NaCl，5% (v/v)甘油，60mM 咪唑，pH8.0)洗涤，之后用洗脱缓冲液(20mM Tris-HCl, 500mM NaCl，5% (v/v)甘油，500mM咪唑，pH8.0)洗脱。利用TO-10脱盐柱将洗脱组分中的高盐缓冲液置换成含有20%甘油的PBS溶液，之后进行SDS-PAGE的检测(图2)。标准型TALEN作为对照，也进行了相同条件下的纯化。由此得到纯化的TAT-TALEN L、tat-talen R、TALEN L和TALEN R蛋白。3、对所纯化的蛋白的体外酶活验证用引物(TCTATTTTATAGGCTTCTTCTCTGG和 CAACCTGTTAGAGCTACTGCAA )从人的基因组PCR扩增出跨TALEN识别位点的CCR5片段。用不同浓度的标准型TALENs (TALEN L和TALEN R蛋白物质的量之比为1:1的混合物)和TAT-TALENs (TAT-TALENL和TAT-TALEN R蛋白物质的量之比为1:1的混合物)在NEBuf fer4的酶切缓冲液中处理扩增的CCR5片段，37°C酶切I小时后进行核酸电泳PAGE。结果如图3所示，由图3可以看出，CCR5片段能够被特异性的切割成两条带，说明标准型TALENs和TAT-TALENs都具有活性。4、TAT-TALEN蛋白细胞穿透能力的检测分别将1.5 μ M TALEN 蛋白(TALEN L 或 TALEN R 蛋白)和 TAT-TALEN 蛋白(TAT-TALENL或TAT-TALEN R蛋白)，与HeLa细胞37°C孵育I小时，之后用lmg/ml肝素溶液洗涤细胞并收集细胞样品进行Western blot检测。结果如图4所示，图4说明只有TAT-TALEN蛋白具有细胞穿透性质。5、TAT-TALEN蛋白对细胞内源性CCR5基因的敲除用无FBS 的 DMEM 培养基对 TAT-TALEN 蛋白(TAT-TALEN L 和 TAT-TALEN R 蛋白物质的量之比为1:1的混合物)进行稀释，使其终浓度分别为1μ Μ，2μΜ，3μΜ，再分别与HeLa细胞37°C孵育I小时候后，用含10%FBS的DMEM完全培养基更换细胞培养液以去除TAT-TALEN蛋白，再分·别进行37°C或者30°C的后续培养24小时，以此作为第一轮的蛋白处理，处理完毕后再进行第二轮蛋白处理，具体为后续培养24小时后的HeLa细胞再与不同浓度(14河，24] ，34]\0 的 TAT-TALEN 蛋白(TAT-TALEN L 和 TAT-TALEN R蛋白物质的量之比为1:1的混合物)37°C孵育I小时后，用含10%FBS的DMEM完全培养基更换细胞培养液以去除TAT-TALEN蛋白，再分别进行37°C或者30°C的后续培养24小时。经过三轮处理后，提取细胞的基因组，利用巢式PCR扩增跨TALEN识别位点的CCR5片段(外侧引物对:AGTGTCAAGTCCAACCTATGAC 和 GGATCGGGTGTAAACTGAAC ;内侧引物对:ACAATGTGTCAACTCTTGACAG 和 CAACCTGTTAGAGCTACTGCAA)。Surveyor 酶切检测说明，只有TAT-TALEN能够敲除HeLa细胞内的CCR5基因，且30°C低温处理能够显著提高敲除效率(图5)。被处理的HeLa细胞基因组CCR5基因确实产生了突变(图6)。采用类似的方法(具体步骤同HeLa细胞，只是稀释TAT-TALEN蛋白的培养基是F12/DMEM培养基，用mTeSR培养基更换细胞培养液是不同的，其他处理步骤相同)也成功敲除了 hiPSCs内源性CCR5基因(图5)。
权利要求
1.一种能够敲除细胞内源性基因的穿透型TAT-TALEN蛋白，其特征在于，其是在TALEN蛋白的L链和R链的N端还具有细胞穿透多肽TAT，所述的细胞穿透多肽TAT的氨基酸序列为N 端-TyrGlyArgLysLysArgArgGlnArgArgArg-C 端。
2.根据权利要求I所述的穿透型TAT-TALEN蛋白，其特征在于，所述的细胞内源性基因为内源性CCR5基因，所述的穿透型TAT-TALEN蛋白的L链是由SEQ ID NO. I所示序列的碱基编码的，穿透型TAT-TALEN蛋白的R链是由SEQ ID NO. 2所示序列的碱基编码的。
3.权利要求2所述的穿透型TAT-TALEN蛋白敲除细胞内源性CCR5基因在制备艾滋病基因治疗药物中的应用。
4.权利要求I所述的穿透型TAT-TALEN蛋白在敲除细胞内源性基因中的应用。
5.编码权利要求I所述的能够敲除细胞内源性基因的穿透型TAT-TALEN蛋白的L链和R链的核苷酸序列。
6.一种内源性CCR5基因被敲除的细胞的制备方法，其特征在于，将编码能够敲除细胞内源性CCR5基因的穿透型TAT-TALEN蛋白的L链的核苷酸序列，其核苷酸序列如SEQIDNO. I所示，和R链的核苷酸序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示，分别插入原核表达载体中，然后原核表达出能够敲除细胞内源性CCR5基因的穿透型TAT-TALEN蛋白的L链和R链，将穿透型TAT-TALEN蛋白的L链和R链与含有内源性CCR5基因的细胞孵育以敲除CCR5基因，从而得到内源性CCR5基因被敲除的细胞。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述的孵育为将穿透型TAT-TALEN蛋白的L链和R链与含有CCR5基因的细胞在37°C孵育I小时，用细胞完全培养基更换细胞培养液以去除穿透型TAT-TALEN蛋白，再在30°C常规培养24小时，再与穿透型TAT-TALEN蛋白的L链和R链混合37°C孵育I小时，再用细胞完全培养基更换细胞培养液以去除穿透型TAT-TALEN蛋白，再在30°C常规培养24小时，如此再重复一次。
全文摘要
本发明公开了一种穿透型TAT-TALEN蛋白及内源性基因被敲除的细胞的制备方法和应用。穿透型TAT-TALEN蛋白是在TALEN蛋白的L链和R链的N端还具有细胞穿透多肽TAT，所述的细胞穿透多肽TAT的氨基酸序列为N端-TyrGlyArgLysLysArgArgGlnArgArgArg-C端。本发明的穿透型TAT-TALEN蛋白能够敲除细胞内源性基因，尤其可以敲除细胞内源性CCR5基因，因此可将其应用于临床上艾滋病基因治疗中的CCR5基因敲除。应用本发明在对CCR5基因进行敲除的同时没有引入任何的外源基因，不存在随机插入到细胞的基因组中引起插入型突变的风险，并且TAT-TALEN蛋白进入细胞发挥作用后会逐渐被细胞降解不会一直存在于细胞内。
文档编号A61P31/18GK103255115SQ20131012419
公开日2013年8月21日 申请日期2013年4月10日 优先权日2013年4月10日
发明者陈小平, 姚永超, 汝任礼, 余松林, 秦莉, 谭学方, 赵思婷 申请人:中国科学院广州生物医药与健康研究院