一种新型非酒精性脂肪肝病模型制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种新型非酒精性脂肪肝病模型制备方法，包括以下步骤：a.将饲养小鼠随机分两组，第一组：模型小组：第二组：对照小鼠；每天记录状态并取尿液、肝组织及血液作脂质分析；b.处理实验对象；c.建立模型；d.肝组织与血液采集；e.将鼠肝组织标本进行常规冰冻切片，取材、普通胶水包冰冻切片、染色后封片；e.对模型小鼠常规进行病理检查；f.对对照小鼠常规进行病理检查；将f）和g）步骤中得出的动态分析肝组织脂肪进行对比。本发明建立的新型非酒精性脂肪肝病模型，路线合理，易操作，且针对性强，是进一步研究非酒精性脂肪肝的有效工具。
【专利说明】一种新型非酒精性脂肪肝病模型制备方法【技术领域】
[0001]本项发明涉及一种人类非酒精性脂肪肝病(NAFLD)模型制备方法。具体可用于人类NAFLD发生机制解析、诊断方法评价、药物筛选和防治，属于医学领域。
【背景技术】
[0002]非酒精性脂肪肝病(NAFLD)分原发性和继发性两大类，前者与胰岛素抵抗和遗传易感性有关，而后者则由某些特殊原因所致。营养过剩所致体重增长过快和体重过重，肥胖、糖尿病、高脂血症等代谢综合征相关脂肪肝，以及隐源性脂肪肝均属于原发性非酒精性脂肪性肝病范畴；而营养不良、全胃肠外营养、减肥手术后体重急剧下降、药物、环境和工业毒物中毒等所致脂肪肝则属于继发性非酒精性脂肪性肝病范畴。
[0003]根据脂肪肝发病机理的不同，已建立了非酒精性及其他脂肪性肝病等模型，分为自发或诱导遗传突变引起和后天获得性脂肪肝模型两大类，后者通常由食物或药理学处理造模，建模方法分为改良的CMDD饲料动物模型，高脂饮食动物模型，高糖饮食脂肪肝模型及其他如芳香酶基因Cyp9敲除、毒物(四氯化碳)和药物(高脂+四环素注射)模型等。优点是针对人类NAFLD发病某一因素探讨机制；不足的是高糖、高脂或基因敲除，与人类NAFLD发生、发展差异较大，且难以调控。目前还没有文献显示建非基因敲除、非高脂肪、非高糖的NAFLD代谢调控模型，而该模型的建立对探讨脂肪代谢异常机制，推动NAFLD的防治更为有益。
【发明内容】
[0004]本发明的主要任务在于提供一种在正常饮食状态下，利用外源性肉毒碱类似物拮抗体内肉毒碱，使脂肪在肝线粒体中代谢发生障碍，建立一种新型非酒精性脂肪肝病模型的制备方法。
[0005]为了解决以上技术问题，本发明的方案如下:
一种新型非酒精性脂肪肝病模型制备方法，包括以下步骤:
模型制备:采用雄性4~6周龄野生型(打/打)野鼠，在洁净环境中饲养；随机分两组，第一组:模型小组:第二组:对照小鼠；
a、以正常喂饲对照小鼠，体内肉毒碱浓度是脂肪氧化所必须(正常饮食与机体合成的量已满足代谢要求);
b、对模型小鼠采用经腹腔拮抗体内运送长链脂肪酸进入线粒氧化的载体(肉毒碱)，致肝组织脂肪持续积累，逐步形成NAFLD，建立非基因敲除、非高糖/高脂肪与NAFLD发病相似的模型；
C、肝组织和血液的采集:分别将两组小鼠放在密封容器内，加入乙醚溶液，在小鼠不活动时，将其四肢及头固定在平板上，酒精消毒腹部，迅速剖腹，从鼠心采血后，取出肝组织，切成大小为1.5 cm X1.5 cm X0.3 cm的组织块,分别放在AAF混合固定液(乙醇、乙酸、中性甲醛，V/V/V，参见许平等(河南医科大学学报，1999，34 (4): 75)介绍的方法固定;
d、将鼠肝组织采用Leica-CM1900型恒冷切片机和Feather —次性刀片对肝组织标本进行常规冰冻切片，取材、普通胶水包埋(冰冻)、切片、染色后封片。
[0006]e、对模型小鼠常规进行病理检查(H&E染色)；鼠肝组织以油红O法进行脂肪染色，动态分析肝组织脂肪堆积；
f、对对照小鼠常规进行病理检查(H&E染色)，鼠肝组织以油红O法进行脂肪染色，动态分析肝组织脂肪；
g、将f)和g)步骤中得出的动态分析肝组织脂肪进行对比，得出脂肪酸及总脂肪酸动态变化模型建立过程中肝组织脂肪积累，肝组织长链脂肪酸、短链脂肪酸及总脂肪酸、外周血中、长链脂肪酸、短链脂肪酸及总脂肪酸水平改变。
[0007]在以上基础上，所述c)步骤中肉毒碱拮抗物为[3-(2，2，2-trimethylhydrazinium) propionate dihydrate, ΤΗΡ],腹腔经拮抗技术的使用方法为:每天按照小鼠的实际体重，按0.05% (W/W)计算THP用量，以0.85%NaCl溶解，经腹腔注射一次/天，注射2~4周，长链脂肪酸因缺少载体不能进入线粒体氧化，肝组织脂肪积累。
[0008]在上述基础上，所述两组野生型(wt/wt)小鼠均置于湿度55%，温度为22 土 2V，12小时昼/夜交替的恒温环境饲养，每天记录体重、活动状态、留取尿液、留取肝组织作病理学检查和脂质分析，留取血液作脂质分析。
[0009]在上述基础上，所述对照小鼠以等量0.85%NaCl (W/V)溶液，以与THP注射法相同
方法，经腹腔注射与饲养。
[0010]在上述基础上，所 述f)步骤中鼠肝组织以油红O法进行脂肪染色，动态分析肝组织和血液中脂肪酸堆积。具体步骤如下:
1、小鼠肝组织以10%福尔马林液(V/V)固定，冰冻切片，厚IOym;
2、配制油红O染色液(称取0.5g油红O,以I, 2-丙二醇(Sigma，Cat#P4347) 100 ml溶解，置磨口瓶内保存备用；
3、切片干燥后入50%乙醇(V/V)稍洗；
4、油红O染液作用8分钟；
5>50%乙醇(V/V)分化，自来水终止分化；
6、常规苏木素复染核，蒸馏水返蓝，甘油明胶封片；
7、肝细胞内的脂肪滴呈红色，细胞核呈蓝色。
[0011]8、肝组织和血液脂肪酸分析方法,参见Ccederblad等(Clin Chim Acta, 1972;37: 235-243)介绍的方法。
[0012]本发明的优点:
1、如图1所示，生物体内脂肪，经活化生成酰基CoA，需血中肉毒碱运载进入肝细胞线粒体，肉毒碱则穿过线粒体再重复转运工作。外膜CPT-1将脂酰和肉毒碱转变为脂酰肉毒碱，内膜CPT-1I将其转化为脂酰CoA后进行β -氧化，体内长链脂肪酸需肉毒碱转运通过线粒体进入基质氧化，生成ATP供能。在整个机理代谢过程中，肉毒碱作为人体内的一个运输工具，起着承上启下的作用，从该机理中也可以看出，肉毒碱的数量或工作量在一定程度上，影响着脂肪肝的发病率。
[0013]具体如下:在机体发生疾病的状态下或因某些因素如病毒感染后，多种内源性代谢物与肉毒碱竞争结合，出现肉毒碱缺乏、酰基CoA和脂肪酸积聚；或高热致CPT-1I活性低下，肉毒碱转运障碍；或摄取脂肪过多超过肉毒碱处理能力等形成NAFLD。
[0014]根据上述原理，针对该代谢过程，设计采用肉毒碱类似物[3-(2，2，2- trimethylhydrazinium) propionate dihydrate, THP,图2]拮抗体内肉毒碱,使脂肪代谢障碍,建立NAFLD模型，如图3所示。
[0015]本发明建立的新型非酒精性脂肪肝病模型，路线合理，易操作，且针对性强，是进一步研究非酒精性脂肪肝的有效工具。
[0016]2、本发明的应用前景:
NAFLD是除酒精和其他明确的损肝因素外，所致的以弥漫性肝细胞大泡性脂肪变性为主、肝脏脂质蓄积过多的临床病理综合征，包括单纯性脂肪肝及演变的脂肪性肝炎和肝硬化，按肝脂肪超过肝重程度分为轻度(5%)、中度(10%)和重度(25%)脂肪肝。NAFLD患者血游离脂肪酸(FFA)增加，肝脏合成三酰甘油(TG)增加，同时肝细胞合成脂蛋白脂酶功能和清除TG能力均减低；血FFA增加反向抑制胰岛素信号传递，促进NAFLD发生、发展。
[0017]近年，随着经济发展人们生活水平及生活方式改变，NAFLD发病率明显上升(15~31%),已是欧、美、日等国慢性肝病及肝功能异常的首要病因，已成为我国基础医学和临床医学的新挑战。NAFLD发生机制尚未完全阐明，目前理想的NAFLD体内研究模型是急需解决的重要问题。拮抗体内运送 长链脂肪酸进入线粒体氧化的肉毒碱，使肝脂肪代谢受阻形成肝脂肪积聚，创建非高糖或非高脂饮食、非基因敲除且与人类NAFLD接近，易调控与评价的新模型。新模型有助于人类NAFLD发生机制解析、诊断方法评价、药物筛选和防治。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1肉毒碱运载脂肪进入肝细胞线粒体氧化示意图 图2肉毒碱拮抗物THP分子结构图
图3小鼠NAFLD模型图
图4肝组织出现大量脂肪积聚后的组织脂肪染色的比较分析。
[0019]左图:低倍观察；右图:高倍观察 上图:对照鼠:下图:模型鼠
图5小鼠肝组织脂肪积累的动态模型制作对比图 A:模型鼠肝脏脂肪积聚图，B:对照组鼠肝脏图 图6小鼠THP拮抗后肝组织增重与其他的比较图。
【具体实施方式】
[0020]采用C57BJ/6 j野生型(wt/wt)小鼠做模型鼠和对照鼠两组，均4周龄，在洁净环境中正常饲养；饲养环境:恒温(22 土 2V )，温度为55%，12小时昼/夜交替；每天记录体重、活动状态、留取尿液、留取肝组织作病理学检查和脂质分析，留取血液作脂质分析。
[0021]模型鼠经THP腹腔注射拮抗肉毒碱(按小鼠实际体重计算0.05% (ff/ff) THP用量，以0.85%NaCl (W/V)溶解，经腹腔注射一次/天，注射2周。
[0022]对照鼠以等量0.85%NaCl (W/V)溶液，以与THP注射法相同方法，经腹腔注射与饲养。
[0023]将上述两组小鼠进行肝组织和血液的采集:分别将两组小鼠放在密封容器内，加入乙醚溶液(市售，优级纯)，在小鼠不活动时，将其四肢及头固定在平板上，酒精消毒腹部，迅速剖腹处死。
[0024]实施例1
对2周后处死模型鼠和对照鼠进行肝脏对比，其肝脏大小形状如图5所示:脂肪肝动物模型见大量肝脂肪积累(图5A)。对照组鼠肝未见改变(图5B)。用目测，肝脏大小有明显的区别。
[0025]实施例2
将两组小鼠处理后，分别从鼠心采血后5ml，及时分离血清于-20°C保存；取出小鼠肝脏，将肝组织分成大小为1.5 cm X1.5 cm X0.3 cm,分别放在AAF混合固定液(乙醇、乙酸、中性甲醛，V/V/V，参见许平等(河南医科大学学报，1999，34 (4): 75)介绍的方法固定。
[0026]将两组鼠肝组织采用Leica_CM1900型恒冷切片机和Feather —次性刀片对肝组织标本分别进行常规冰冻切片，取材、普通胶水包埋(冰冻)、切片、染色后封片。
[0027]对两组小鼠常规进行病理检查(H&E染色);鼠肝组织以油红O法进行脂肪染色，动态分析肝组织脂肪堆积。
[0028]具体步骤如下:以模型小鼠为例。
[0029]模型鼠小鼠肝组织 以10%福尔马林液(V/V)常规固定，冰冻切片，厚ΙΟμπι;
配制油红O染色液(称取0.5g油红O,以I, 2-丙二醇(Sigma, Cat#P4347)100 ml溶解，
置磨口瓶内保存备用；
切片干燥(在室温，22 土 2°C自然干燥)后入浓度为50%乙醇(V/V)稍洗5秒；
油红O染液作用8分钟；
50%乙醇(V/V)分化，自来水终止分化；
常规苏木素复染核，蒸馏水返蓝，甘油明胶封片；
对照小鼠的过程与模型小鼠等同，在此不再累述。
[0030]肝细胞内的脂肪滴呈红色，细胞核呈蓝色，如图4所示。
[0031]肝组织和血液脂肪酸分析方法,参见Cederblad等(Clin Chim Acta, 1972; 37:235-243)介绍的方法。
[0032]实施例3
动态分析肝组织脂肪。将染色后的两组鼠肝进行动态分析，得出的动态分析肝组织脂
肪进行对比，得出脂肪酸及总脂肪酸动态变化模型建立过程中肝组织脂肪积累，肝组织长
链脂肪酸、短链脂肪酸及总脂肪酸水平(附表)；外周血中、长链脂肪酸、短链脂肪酸及总脂
肪酸水平改变。如小鼠肝组织中脂肪酸浓度的变化如下:
【权利要求】
1.一种新型非酒精性脂肪肝病模型制备方法，其特征在于:包括以下步骤: 饲养小鼠分组用雄性4~6周龄野生型(小鼠，在洁净环境中饲养；随机分两组，第一组:模型小组:第二组:对照小鼠；每天记录体重、活动状态、留取尿液、留取肝组织作病理学检查和脂质分析，留取血液作脂质分析 处理实验对象:以正常两组小鼠； 建立模型:对模型小鼠采用腹腔经拮抗体内运送长链脂肪酸进入线粒氧化的载体-------肉毒碱； 肝组织与血液采集:分别将两组小鼠放在密封容器内，加入乙醚溶液，在小鼠不活动时，将其四肢及头固定在平板上，酒精消毒腹部，迅速剖腹，从鼠心采血后，取出肝组织，切成大小为1.5 cm X1.5 cm X0.3 cm组织块,分别放在AAF混合固定液中固定； 将鼠肝组织标本进行常规冰冻切片，取材、普通胶水包冰冻切片、染色后封片； 对模型小鼠常规进行病理检查------H&E染色鼠肝组织以油红O法进行脂肪染色，动态分析肝组织脂肪堆积； 对对照小鼠常规进行病理检查-------H&E染色鼠肝组织以油红O法进行脂肪染色，动态分析肝组织脂肪； 将f)和g)步骤中得出的动态分析肝组织脂肪进行对比，得出脂肪酸及总脂肪酸动态变化，模型建立过程中肝组织脂肪积累，肝组织长链脂肪酸、短链脂肪酸及总脂肪酸、外周血中、长链脂肪酸、短链脂肪酸及总脂肪酸水平改变。
2.根据权利要求1所述的一种新型非酒精性脂肪肝病模型制备方法，其特征在于:所述肉毒喊拮抗物，为 3-(2，2，2-trimethyl hydrazinium) propionate dihydrate,即THP ;每天按照小鼠的实际体重，按重量为0.05%计算THP用量，以0.85%NaCl溶解，经腹腔注射一次/天，注射2~4周。
3.根据权利要求1所述的一种新型非酒精性脂肪肝病模型制备方法，其特征在于:小鼠暂养条件:所述两组野生型小鼠均置于湿度55%，温度为22 土 2°C，12小时昼/夜交替的恒温环境饲养。
4.根据权利要求1所述的一种新型非酒精性脂肪肝病模型制备方法，其特征在于:所述对照小鼠以等量0.85%NaCl溶液，经腹腔注射。
5.根据权利要求1所述的一种新型非酒精性脂肪肝病模型制备方法，其特征在于:所述油红O配置染液的方法如下:称取0.5g油红0，以1，2-丙二醇(Sigma，Cat#P4347) 100ml溶解，置磨口瓶内保存备用。
6.根据权利要求1所述的一种新型非酒精性脂肪肝病模型制备方法，其特征在于:所述f )步骤中鼠肝组织以油红O法进行脂肪染色:方法如下:b2切片干燥后入50%乙醇稍洗；c3、常温(22 土 2V )浸置油红O染液8分钟；50%乙醇分化，自来水终止分化；常规苏木素复染核，蒸馏水返蓝，甘油明胶封片；肝细胞内的脂肪滴呈红色，细胞核呈蓝色。
【文档编号】A61K31/205GK103462948SQ201310312133
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年7月24日 优先权日:2013年7月24日
【发明者】姚登福 申请人:南通大学附属医院