一种对非酒精性脂肪肝病细胞模型具有修复作用的文蛤酶解寡肽及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种对非酒精性脂肪肝病细胞模型具有修复作用的文蛤酶解寡肽，其特征在于包含如下氨基酸序列：Gln Leu Asn Trp Asp，本发明还涉及一种对非酒精性脂肪肝病细胞模型具有修复作用的文蛤酶解寡肽的制备方法，与现有技术相比，本发明的优点在于：应用软脂酸诱导建立NAFLD细胞模型，充分模拟体内受损的肝细胞，结果发现经15μg/mL的软脂酸诱导48h后，建立的NAFLD体外细胞模型其TG含量较正常肝细胞显著升高，油红O染色发现模型组细胞内脂滴数量比正常组细胞增多，且细胞死亡率低、重复性好，显示该造模方法简便易行，同时，本发明以文蛤中分离得到对NAFLD细胞模型具有明显修复作用的文蛤酶解寡肽。
【专利说明】一种对非酒精性脂肪肝病细胞模型具有修复作用的文蛤酶 解寡肽及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种自动物体中得到的提取物及其制备方法，特别是涉及一种对非酒 精性脂肪肝病细胞模型具有修复作用的文蛤提取物及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 文蛤（MeretrixmeretrixL.)属于软体动物门、帘蛤科、文蛤属，其贝壳坚厚，两 壳大小相等，喜欢生长在有淡水注入的内湾及河口附近的细沙质海滩，是我国四大养殖贝 类之一。文蛤肉质鲜美含有人体所必须的蛋白质、脂肪、微量元素等。我国利用文蛤治疗疾 病的历史悠久，《本草纲目》里有记载它能治"疮、疖肿毒，消积块，解酒毒"等疾病。
[0003] 最近的研究表明，文蛤提取物具有抗肿瘤、抗氧化、降糖、降血脂及降血压等作用， 是有待开发的保健食品。其中，非酒精性脂肪肝病（nonalcoholicfattyliverdisease, NAFLD)是以肝细胞脂肪变性和脂肪堆积为主要特征的病理综合征，脂肪代谢受雌激素、生 长激素、皮质醇、胰高血糖素、胰岛素等激素调节的影响，这些激素可以短时间内迅速使许 多蛋白质和糖类等其他物质经新陈代谢转变成脂类物质堆积在人体，而肝脏无法完全排除 这些多余的脂肪，进而导致脂肪肝的形成。目前治疗的方法主要采取减肥治疗、降脂治疗和 血管紧张素转换酶抑制剂等保守治疗，但保守治疗目前尚缺乏特效方法，效果欠佳。近年 来，我国的研究学者对从海洋软体动物中提取生物活性物质对肝损伤进行保护作用作了大 量的研究。如张蓓等人从海星和海参中提取到脑苷脂，以研究其对脂肪肝大鼠肝脏脂质代 谢的影响，结果表明脑苷脂可降低肝脏脂质蓄积。
[0004] 但流行病学资料显示，NAFLD不单纯是肝脏疾病，而是肥胖，高脂血症，胰岛素抵抗 等代谢综合征相关组分在肝脏的集中体现，其中胰岛素抵抗和遗传易感性与其发病密切相 关，近年来，随着生活水平的提高及饮食结构的改变，NAFLD在我国己成为仅次于病毒性肝 炎的第二大慢性肝病，但其发病机制尚未完全阐明，治疗上也缺乏有效措施，因此，建立稳 定可靠的便于进行药物干预实验的NAFLD模型成为亟待解决的问题，而有关文蛤提取物对 NAFLD细胞模型的作用尚未见报道。本试验通过蛋白酶对文蛤进行酶解获得寡肽，作用于经 软脂酸诱导正常肝Changliver细胞即"人张氏肝细胞"建立的NAFLD体外细胞模型，以探 讨文蛤酶解寡肽对NAFLD细胞模型的修复作用，以期为开发文蛤功能食品提供实验依据。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的一个技术问题是针对现有技术的现状提供一种对非酒精性脂 肪肝病细胞模型修复性高的文蛤酶解寡肽。
[0006] 本发明所要解决的另一个技术问题是针对现有技术的现状提供一种对非酒精性 脂肪肝病细胞模型修复性高的文蛤酶解寡肽的制备方法。
[0007] 本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：该对非酒精性脂肪肝病细胞模型 具有修复作用的文蛤酶解寡肽，其特征在于包含如下氨基酸序列：GlnLeuAsnTrpAsp。
[0008] 本发明还提供一种对非酒精性脂肪肝病细胞模型具有修复作用的文蛤酶解寡肽 的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
[0009] ①建立非酒精性脂肪肝病细胞模型，将正常肝细胞置于DMEM培养液、37°C、5%C02 的培养箱中培养，待细胞贴壁达到80%后弃培养液，0. 25%的胰蛋白酶消化，传代培养，选 择生长状态良好的细胞，用15iig/mL的软脂酸对正常肝细胞进行诱导，处理12h、24h、48h、 72h后收集细胞并测定甘油三脂（TG)含量，选择使正常肝细胞TG含量明显增加且细胞生长 良好的诱导时间，以建立体外非酒精性脂肪肝病细胞模型；
[0010] ②将文蛤去壳取内脏后放入蒸馏水中轻轻搅拌，洗去杂质后匀浆，存放于-20°C 或-80°C备用；
[0011] ③将步骤②制得的文蛤匀浆液进行酶解，经过超滤膜，分别截取5KDa分子量以 下、5KDa?8KDa以及8KDa分子量以上的3个不同分子段酶解液，用G-25葡聚糖凝胶层析， 对所得的各个峰进行收集，获得的产物分别作用于步骤①的非酒精性脂肪肝病细胞模型细 胞，以筛选使得非酒精性脂肪肝病细胞模型细胞TG含量减低率最大的酶解液进行收集，然 后将收集的最大峰酶解液于280nm下过ZorbaxSB-C18色谱柱，得到两个洗脱峰，收集大 的洗脱峰高效液相检测其纯度显示为单一组分，并测定其氨基酸序列，确认为GinLeuAsn TrpAsp。
[0012] 进一步地，所述步骤①中软脂酸为15y g/mL，对正常肝细胞进行诱导。
[0013] 进一步地，所述步骤③中使得非酒精性脂肪肝病细胞模型细胞TG含量减低率最 大的为5KDa分子量以下分子段的酶解液，其TG含量降低率达54. 2%。
[0014] 进一步地，所述步骤③中对文蛤匀浆液分别用5种蛋白酶进行酶解，该5种蛋白酶 分别为中性蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶。
[0015] 进一步地，步骤③中使得非酒精性脂肪肝病细胞模型细胞TG含量减低率最大的 酶为碱性蛋白酶，酶解条件为40°C、pH为9. 5、料液比为1:2、酶解时间为8h且加酶量为 1000U/g。
[0016] 与现有技术相比，本发明的优点在于：应用软脂酸诱导建立NAFLD细胞模型，充分 模拟体内受损的肝细胞，结果发现经15yg/mL的软脂酸诱导48h后，建立的NAFLD体外细 胞模型其TG含量较正常肝细胞显著升高，油红0染色发现模型组细胞内脂滴数量比正常组 细胞增多，且细胞死亡率低、重复性好，显示该造模方法简便易行，同时，本发明以文蛤中分 离得到对NAFLD细胞模型具有明显修复作用的文蛤酶解寡肽，具体表现为细胞内的脂质过 氧化程度得到缓解，细胞清除氧自由基的能力增强、以及能有效降低细胞的受损程度，对进 一步探讨文蛤酶解寡肽对NAFLD细胞模型修复作用的机制，并进行动物体内实验，从而为 开发文蛤的护肝功能食品提供可靠的实验依据。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1为分子段< 5kDa的酶解液进行G-25葡聚糖凝胶层析图；
[0018] 图2为对目标肽进行HPLC分析并测定的氨基酸序列结果分析图；
[0019] 图3-A为正常组Chang liver肝细胞经油红0染色的结果图；
[0020] 图3-B为模型组Chang liver肝细胞经油红0染色的结果图；
[0021] 图3-C为药物组Chang liver肝细胞经油红0染色的结果图。
【具体实施方式】
[0022] 以下通过结合附图、序列表及实施例对本发明作进一步说明。
[0023] 实施例1
[0024] 1、NAFLD模型的建立
[0025] 正常肝Changliver细胞（下称正常组细胞）置于DMEM培养液、37°C、5%C02的 培养箱中培养，待细胞贴壁达到80%后弃培养液，0. 25%的胰蛋白酶消化，传代培养。选择 生长状态良好的细胞，用15yg/mL的软脂酸对Changliver细胞进行诱导，处理12h、24h、 48h、72h后收集细胞并测定甘油三脂（TG)含量，TG检测方法按照试剂盒说明书进行。选择 使正常肝Changliver细胞TG含量明显增加且细胞生长良好的诱导时间，建立体外NAFLD 细胞模型（下称模型组细胞）。
[0026] 正常肝Changliver细胞用15 iig/mL软脂酸诱导后的TG含量结果发现软脂酸作 用后TG含量均有明显上升，但作用48h后，其细胞内的TG含量上升最多，较正常组TG含量 上升300%左右，镜下观察细胞生长状态良好，因此建立NAFLD细胞模型的软脂酸诱导时间 为48h(见表1)，且经油红0染色发现模型组细胞内脂滴数量比正常组细胞增多，细胞死亡 率低、重复性好，显示该造模方法简便易行。
[0027] 表1软脂酸处理Chang1iver细胞后的TG含量变化
[0028]
【权利要求】
1. 一种对非酒精性脂肪肝病细胞模型具有修复作用的文蛤酶解寡肽，其特征在于包含 如下氨基酸序列：Gin Leu Asn Trp Asp。
2. -种如权利要求1所述对非酒精性脂肪肝病细胞模型具有修复作用的文蛤酶解寡 肽的制备方法，其特征在于包括如下步骤： ① 建立非酒精性脂肪肝病细胞模型，将正常肝细胞置于DMEM培养液、37°C、5% C02的 培养箱中培养，待细胞贴壁达到80%后弃培养液，0. 25%的胰蛋白酶消化，传代培养，选择 生长状态良好的细胞，用软脂酸对正常肝细胞进行诱导，处理1211、2411、4811、7211后收集细 胞并测定甘油三脂（TG)含量，选择使正常肝细胞TG含量明显增加且细胞生长良好的诱导 时间，以建立体外非酒精性脂肪肝病细胞模型； ② 将文蛤去壳取内脏后放入蒸馏水中轻轻搅拌，洗去杂质后匀浆，存放于-20°C 或-80°C备用； ③ 将步骤②制得的文蛤匀浆液进行酶解，经过超滤膜，分别截取5KDa分子量以下、 5KDa?8KDa以及8KDa分子量以上的3个不同分子段酶解液，用G-25葡聚糖凝胶层析， 对所得的各个峰进行收集，获得的产物分别作用于步骤①的非酒精性脂肪肝病细胞模型细 胞，以筛选使得非酒精性脂肪肝病细胞模型细胞TG含量减低率最大的酶解液进行收集，然 后将收集的最大峰酶解液于280nm下过Zorbax SB-C18色谱柱，得到两个洗脱峰，收集大 的洗脱峰高效液相检测其纯度显示为单一组分，并测定其氨基酸序列，确认为Gin Leu Asn Trp Asp。
3. 根据权利要求2所述的对非酒精性脂肪肝病细胞模型具有修复作用的文蛤酶解寡 肽的制备方法，其特征在于所述步骤①中软脂酸为15u g/mL，对正常肝细胞进行诱导。
4. 根据权利要求2所述的对非酒精性脂肪肝病细胞模型具有修复作用的文蛤酶解寡 肽的制备方法，其特征在于所述步骤③中使得非酒精性脂肪肝病细胞模型细胞TG含量减 低率最大的为5KDa分子量以下分子段的酶解液，其TG含量降低率达54. 2%。
5. 根据权利要求2所述的对非酒精性脂肪肝病细胞模型具有修复作用的文蛤酶解寡 肽的制备方法，其特征在于所述步骤③中对文蛤匀浆液分别用5种蛋白酶进行酶解，该5种 蛋白酶分别为中性蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶。
6. 根据权利要求4所述的对非酒精性脂肪肝病细胞模型具有修复作用的文蛤酶解寡 肽的制备方法，其特征在于步骤③中使得非酒精性脂肪肝病细胞模型细胞TG含量减低率 最大的酶为碱性蛋白酶，酶解条件为40°C、pH为9. 5、料液比为1:2、酶解时间为8h且加酶 量为 1000U/g。
【文档编号】C12P21/06GK104387451SQ201410624999
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年11月7日 优先权日:2014年11月7日
【发明者】杨最素, 赵莎莎, 丁国芳, 黄芳芳, 赵玉勤, 余方苗 申请人:浙江海洋学院