一种fgf-21突变体蛋白的制备及其在治疗非酒精性脂肪肝中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种FGF-21突变体蛋白的制备及其在治疗非酒精性脂肪肝中的应用。本发明成纤维细胞生长因子-21突变体的氨基酸序列为SEQ?ID?NO：2所示，其编码基因序列为SEQ?ID?NO：1所示。本发明在获得了FGF-21突变体基因后，在宿主细胞中高效可溶性地表达了FGF-21突变体蛋白，经过一系列的蛋白纯化步骤获得了FGF-21突变体蛋白。动物学试验结果表明，本发明的FGF-21突变体能够更加有效降低非酒精性脂肪肝模型动物体内的血脂水平，改善肝脏内脂肪堆积且能显著改善肝脏功能。本发明的FGF-21突变体可用于制备非酒精性脂肪肝药物。
【专利说明】一种FGF-21突变体蛋白的制备及其在治疗非酒精性脂肪肝中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及成纤维细胞生长因子-21(FGF-21)基因突变，涉及FGF-21突变体蛋白的制备，还涉及该FGF-21突变体在制备治疗非酒精性脂肪肝疾病药物中的应用，属于成纤维细胞生长因子-21突变蛋白领域。
【背景技术】
[0002]近年来，随着人们的生活水平不断提高，饮食习惯逐渐发生不合理的改变，非酒精性脂肪肝(nonalcohol ic fat ty liver di sease, NAFLD)的发生率日渐增高,约在10% -20%左右。近年来总结NAFLD的转归发现，50%发展为肝纤维化，15%发展为肝硬化，3%发展为肝衰竭或者需要进行肝移植。而NAFLD又与目前所共认的糖尿病，高血压，高脂血症，腹型肥胖等代谢综合征(MS)共同伴随。NAFLD发病机制尚不清楚，目前大多数学者认为肝脏脂肪累积、胰岛素抵抗起关键作用，反过来，肝脏脂肪变性又加重胰岛素抵抗。因此，有学者认为肥胖特别是中心性肥胖和胰岛素抵抗是发生NAFLD的危险因素。
[0003]成纤维细胞生长因子-21 (fibrobla st growth factor21, FGF-21)是近期发现的体内又一个代谢调节因子，属于成纤维细胞生长因子家族，其特异性作用于肝脏、脂肪、胰岛细胞且不依赖于胰岛素有效安全地调节血糖血脂的能力深得研究人员青睐。最新流行病学研究表明，FGF-21与非酒精性脂肪肝(NAFLD)密切相关，在健康受试者和NAFLD受试者中，血清FGF-21水平不仅与身高体重比(BMI)呈正相关，并与长时禁食相关。Li等的研究表明，NAFLD患者的血清FGF-21水平显著高于健康人，并与肝脏甘油三酯水平相关。除此之外，本实验室在动物 模型中发现FGF-21可以有效改善胰岛素抵抗，降低血清胰岛素浓度，显著降低血清中甘油三脂、胆固醇以及低密度脂蛋白的含量，显示其具有治疗NAFLD的潜能，近期美国礼莱公司针对FGF-21的临床结果也同样显示其显著的降脂效果，更进一步说明FGF-21有望成为治疗非酒精性脂肪肝的新型药物。
【发明内容】
[0004]本发明的目的之一是提供成纤维细胞生长因子-21 (FGF-21)突变体及其编码基因；
[0005]本发明的目的之二是提供含有成纤维细胞生长因子-21 (FGF-21)突变体基因的重组原核表达载体，以及含有该重组原核表达载体的宿主细胞；
[0006]本发明的目的之三是提供制备上述成纤维细胞生长因子-21 (FGF-21)突变体的方法；
[0007]本发明的目的之四是将该成纤维细胞生长因子-21 (FGF-21)突变体应用于制备成治疗非酒精性脂肪肝的药物或药物组合物。
[0008]本发明上述目的是通过以下技术方案来实现的:
[0009]一种FGF-21突变体，其分子量约为20ku，其氨基酸序列为SEQ ID NO:2所示；编码该FGF-21突变体的核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示。
[0010]获得本发明所述的FGF-21突变体的方法，包括如下步骤:从正常人肝脏中提取RNA，并以此为模板逆转录获得编码FGF-21的基因，以此为模板，通过over lap PCR获得FGF-21突变体基因，将所获得的FGF-21突变体基因连接到原核表达载体中；将所述重组原核表达载体转化适当的宿主细胞，并进行诱导表达、纯化。
[0011]含有FGF-21突变体核苷酸序列的重组原核表达载体以及含有该重组原核表达载体的宿主细胞也包括在本发明的保护范围之内。优选的，可以将FGF-21突变体核苷酸序列与携带分子伴侣的原核表达载体相连接。其中，所述的分子伴侣优选为小分子泛素样修饰蛋白(SUMO)。
[0012]本发明还提供了一种制备FGF-21突变体的方法，包括:将携带FGF-21突变体核苷酸序列的重组原核表达载体转化至宿主细胞中；诱导表达FGF-21突变体融合蛋白，分离纯化FGF-21突变体融合蛋白，利用SUMO蛋白酶切除与FGF-21突变体融合表达的分子伴侣部分，纯化，即得。
[0013]优选的，所述的原核表达载体为pSUMO (Cat.N0.1005,1006, Life Sensors),所述的宿主细胞为TransB(DE3)(北京全式金生物技术有限公司，目录号:CD811);所述的分子伴侣优选为小分子泛素样修饰蛋白(SUMO);其中，所述的纯化包括:将融合蛋白进行树脂亲和层析，依次经洗涤、洗脱、脱盐；纯化的融合蛋白酶切后进行树脂亲和层析，即得。[0014]优选的，对于蛋白纯化，所述的亲和层析树脂为HisTrapTM FF crude colum ;所述的杂蛋白洗脱液包括:45mmol / L 咪唑，500mmol / L NaCl, 55mmol / L Na3PO4, ρΗ7.4 ;所述的洗脱液包括:550mmol / L 咪唑，500mmol / L NaCl,55mmol / L Na3PO4,ρΗ7.4 ;所述的脱盐采用 HiPr印ΤΜ26 / IODesaltingo
[0015]pSUMO和大肠杆菌TransB (DE3)都可通过商业途径购买得到。
[0016]本发明在获得了 FGF-21突变体基因后，与原核表达载体pSUMO重组，导入宿主细胞中，经过一系列的蛋白纯化步骤后获得了 FGF-21突变体蛋白，并对纯化后的FGF-21突变体进行活性检测。
[0017]本发明所制备的FGF-21突变体是通过MSG模型鼠来检测其治疗NAFLD效果的。动物学试验结果表明，与野生型FGF-21相比，本发明FGF-21突变体能够更加有效降低非酒精性脂肪肝模型动物体内的血脂水平，改善肝脏内脂肪堆积且能显著改善肝脏功能。本发明的FGF-21突变体可作为药物治疗非酒精性脂肪肝。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1FGF-21突变体蛋白纯化
[0019]1.蛋白质标准分子量；2.未纯化的FGF-21突变体融合蛋白；3.纯化的FGF-21突变体融合蛋白；4.FGF-21突变体融合蛋白酶切产物；5.纯化的FGF-21突变体蛋白
[0020]图2HPLC分析FGF-21突变体蛋白
[0021 ] 经过HPLC分析，在大约16min处出现FGF-21突变体蛋白峰，且其纯度可达95 %以上。
[0022]图31-5周各实验组体重变化
[0023]治疗组体重相对于生理盐水组体重显著下降，且从治疗第三周开始，FGF-21突变体治疗组体重较野生型FGF-21治疗组体重下降更多(差异显著)，与正常组无明显差异，与模型组差异极显著。注:n=8，mean土SEM.*P < 0.05，**P < 0.01vs生理盐水组，#P < 0.05，##P < 0.01vs 野生型 FGF-21。
[0024]图 40GTT
[0025]口服葡萄糖后30min，生理盐水组小鼠血糖迅速上升至最高达到(14.7±0.49)mmol.L-1，而正常对照组小鼠血糖为(10.7±0.49)mmol.L-1。FGF-21突变体治疗组小鼠血糖上升幅度显著低于生理盐水组为(11.6±0.64)mmol.L-10此外，FGF-21突变体治疗组血糖下降速度明显快于野生型FGF-21治疗组。注:n=8，mean土SEM.*P < 0.05，**P< 0.01vs生理盐水组。[0026]图5-9停药后，各实验组肝脏脂代谢关键基因表达变化
[0027]FGF-21突变体显著降低？八540:140:2基因表达水平，显著升高0)1^、此?-1基因表达水平，且显著优于野生型FGF-21治疗组。注:n=8，mean土SEM.*P < 0.05，**P < 0.01vs生理盐水组，#P < 0.05，##P < 0.01vs 野生型 FGF-21。
[0028]图10停药后，各实验组肝脏HE染色结果对比
[0029]在光学显微镜下，生理盐水组肝细胞肿胀，胞浆可见大量空泡，以肝小叶中央区为重，空泡大小不等，以大为主；FGF-21突变体治疗组肝细胞浆内可见较小的脂肪空泡，数量比较少；野生型FGF-21治疗组肝细胞内可见较小的脂肪空泡，但数量较多。
【具体实施方式】
[0030]下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0031]说明:本发明中涉及的基因的设计、合成、突变和克隆，原核表达载体的构建，核酸提取及序列分析及鉴定，以及表达产物的分离和纯化等操作步骤，可按照本领域已知的技术进行(参见CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY)。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0032]实施例1FGF-21突变体基因的克隆
[0033]1、FGF-21 cDNA 的获得
[0034]Trizol提取人肝脏总RNA，以总RNA为模板，Oligo (dT) 15为引物，参照M-MLV反转录酶说明书进行cDNA第一条链合成。
[0035]2、PCR方法扩增FGF-21基因
[0036]根据FGF-21基因去除信号肽的核苷酸序列，设计引物，通过互补延伸的方法获得去除信号肽的FGF-21基因。利用软件Primer5.0设计FGF-21基因克隆引物(Pl和P2)。
[0037]循环参数为:95°C预变性5min，95°C 30s，56°C 30s，72°C 45s的顺序，15个循环后，72°C再延伸 lOmin。
[0038]3、overlap PCR 获得 FGF_21 突变基因
[0039]利用软件Primer5.0设计FGF-21突变引物(P3、P4和P5)。以P3和P4为引物，FGF-21基因为模板，进行PCR扩增，获得PCR产物I ;以P2和P5为引物，FGF-21基因为模板，进行PCR扩增，获得PCR产物2 ;以P3和P2为引物，PCR产物I和PCR产物2混合物为模板，进行PCR扩增，获得FGF-21突变基因。
[0040]循环参数为:941:预变性51^11，941: 30s, 58°C 40s，72°C 50s的顺序，12个循环后，72°C再延伸 lOmin。
[0041]表1克隆FGF-21突变体基因的引物
[0042]
【权利要求】
1.一种成纤维细胞生长因子-21突变体，其特征在于:其氨基酸序列为SEQ ID N0:2所示。
2.编码权利要求1所述的成纤维细胞生长因子-21突变体基因，其特征在于:其核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示。
3.含有权利要求2所述成纤维细胞生长因子-21突变体基因的原核表达载体。
4.含有权利要求3所述原核表达载体的宿主细胞TransB(DE3)。
5.一种制备权利要求1所述的成纤维细胞生长因子-21突变体的方法，包括:将编码成纤维细胞生长因子-21突变体核苷酸序列与原核表达载体相连接，得到重组原核表达载体；载体本身携带分子伴侣SUMO，连接后形成SUMO与成纤维细胞生长因子-21突变体连接而成的融合基因；将该重组原核表达载体转化至宿主细胞TransB(DE3)中；诱导表达成纤维细胞生长因子-21突变体融合蛋白，分离纯化该融合蛋白，利用SUMO蛋白酶切除与其融合表达的分子伴侣部分，纯化，即得。
6.按照权利要求5所述的方法，其特征在于:所述的原核表达载体为pSUMO;所述的宿主细胞为TransB(DE3);所述的分子伴侣为小分子泛素样修饰蛋白。
7.按照权利要求5所述的方法，其特征在于:所述的成纤维细胞生长因子-21突变体核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示；成纤维细胞生长因子-21突变体氨基酸序列为SEQ IDNO:2所示。
8.按照权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的纯化包括:成纤维细胞生长因子-21突变体融合蛋白进行树脂亲和层析，依次经过洗涤、洗脱、脱盐；将酶切后的蛋白进行树脂亲和层析，即得。
9.一种治疗非酒精性脂肪肝的药物组合物，包括:治疗上有效的权利要求1所述的成纤维细胞生长因子-21突变体和药学上可接受的载体或辅料。
10.权利要求1所述的成纤维细胞生长因子-21突变体在制备治疗非酒精性脂肪肝药物中的应用。
【文档编号】C12N15/70GK103923207SQ201410150150
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2014年4月8日 优先权日:2014年4月8日
【发明者】任桂萍, 朱升龙, 李德山, 王文飞, 刘铭瑶, 叶贤龙 申请人:东北农业大学