一种基于同源重组的细菌基因点突变分子克隆技术的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种基于同源重组的细菌基因点突变分子克隆技术，该技术通过在目的原始菌基因A与其相邻基因B间插入基因片段C，插入的基因片段的插入位点在目的基因A和其相邻基因B的启动子间，且不影响2个基因的表达再以质粒为载体，经双酶切及连接后转化将上述的两个片段和基因片段C连接获得一个新的质粒，最后将新的质粒转化至原始菌。实现在原始菌内直接对目的基因进行点突变，且不改变基因的生存环境，不影响基因的表达。
【专利说明】—种基于同源重组的细菌基因点突变分子克隆技术
【技术领域】
[0001]本发明涉及分子生物领域，尤其一种基于同源重组的细菌基因点突变分子克隆技术。
【背景技术】
[0002]基因点突变(Gene Point Mutation)为DNA链中I个或I对碱基发生改变，包括碱基置换(转换、颠换)和移码突变(丢失或插人I个或几个碱基)。基因点突变是导致细菌性状改变的重要因素之一，如基因点突变导致抗生素靶位酶的变异，从而导致细菌产生抗生素耐药。如:(1)细菌喹诺酮耐药决定区(QRDRs)编码靶酶的基因点突变，导致药物作用靶位的改变，降低喹诺酮类药物的亲和力而耐药。(2)淋球菌mtrR基因第45位Gly (GGC — GAC) Asp、14 位 His (CAC — CGC) Arg 和第 51 位 Phe (TTC — GTC) Val 突变与淋球菌流行株的多重耐药性密切相关。(3) 23SrRNA基因A2143G点突变与幽门螺杆菌对克拉霉素的耐药相关。(4)rpsL基因的点突变分别与结核分枝杆菌对利福平、乙氨丁醇、异烟肼和链霉素耐药性密切 相关。
[0003]目前对基因点突变的研究主要是采用测序、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，PCR-SSCP(单链构像多态性分析，Single-Strand Conformation Polymorphism)等方法进行基因点突变测定，通过携带与不携带基因点突变菌株目的性状的比较分析，来认定基因点突变的作用机制。然而，这种方法只能通过基因点突变菌株和未点突变菌株之间的性状比较，来推测基因点突变与性状相关，不能直观的研究基因点突变的结果。此外，也有报道，在蛋白质功能研究中，采用点突变试剂盒构建点突变基因，用以研究基因点突变前后蛋白质功能的变化来研究基因点突变的功能。然而细菌的性状如耐药程度是多基因、多蛋白参与的复杂过程，而这种方法局限于个别基因及蛋白，难以解释基因点突变在细菌内部环境中导致的全部现象。所以，研究基因点突变功能的理想方法是:在原始菌中直接对目的基因进行点突变，而不改变基因的生存环境，但目前还没有一种理想的技术对细菌进行基因点突变。
[0004]同源重组(Homologus Recombination)是指发生在姐妹染色单体之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合，它也是基因敲除的方法之一。目前有采用“上游片段-插入基因-下游片段”的方式使靶基因失活。同源重组原理理论上也能被应用到构建基因点突变菌株中。但关键是同源重组至原始菌的片段，除携带基因点突变外，不能断开任何基因且不影响基因(含目的基因)表达。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种基于同源重组的细菌基因点突变分子克隆技术，实现在原始菌内直接对目的基因进行点突变，且不改变基因的生存环境，不影响基因的表达。
[0006]为了实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案:
[0007]—种基于同源重组的细菌基因点突变分子克隆技术，在目的原始菌基因A与其相邻基因B间插入基因片段C，插入的基因片段的插入位点在目的基因A和其相邻基因B的启动子间，且不影响2个基因的表达；然后采用PCR方法扩增2个片段，其中一个片段为:目的基因内部A开始到目的基因A启动子与B基因启动子之间的上游片段；另一片段为:A基因启动子与B基因启动子之间的开始到B基因内部的下游片段；再以质粒为载体，经双酶切及连接后转化将上述的两个片段和基因片段C连接获得一个新的质粒，该质粒含“上游片段-基因片段C-下游片段”;最后将新的质粒转化至原始菌。
[0008]本发明包括如下步骤:
[0009](I)克隆载体及菌株的选取:选取合适的质粒载体，确认其酶切位点，选择合适菌株作为克隆圃；
[0010](2)插入基因片段的选择；
[0011](3)上游片段及下游片段的制备:针对目的基因点突变位置和插入基因片段位置及相邻基因设计引物；每条上、下游引物添加相应的酶切位点和保护碱基，且上游片段的下游引物和下游片段的上游引物为碱基序列互补，引物位置在目的基因与其相邻基因的启动子间；
[0012](4)同源重组后基因点突变菌株的制备:上游片段、插入基因片段、下游片段分别经3次双酶切及连 接后转化至克隆菌，获得两端含原始菌基因片段、中间为抗生素筛选基因的质粒。
[0013]所述的原始菌为福氏志贺菌、大肠杆菌、沙门菌、霍乱菌或空肠弯曲菌等。
[0014]所述的插入基因片段为抗生素筛选基因。
[0015]本发明一种基于同源重组的细菌基因点突变分子克隆技术，实现在原始菌内直接对目的基因进行点突变，且不改变基因的生存环境，不影响基因的表达。细菌基因点突变是导致细菌性状改变的重要因素之一。本发明提供了一种细菌基因点突变的分子克隆技术，所述的技术通过福氏志贺菌的gyrA基因点突变进行验证并获得成功，该技术可推广应用到别的细菌如大肠杆菌、沙门菌、霍乱、空肠弯曲菌等细菌。该技术用10天左右时间可在实验室构建一个基因点突变菌株，可在实验室推广使用。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1:构建gyrA基因点突变不意图；(A).卡那霉素耐药基因插入的位点，箭头表示引物的位置(gyrAFl (Fl)，gyrARl (Rl)，gyrAF2 (F2)，gyrAR2 (R2)) ； (B) gyrA 基因突变点的序列。
【具体实施方式】
[0017]下面通过具体实施例对本发明做进一步的说明，但本发明并不为实施例所限制。
[0018]实施例1:细菌性痢疾是一种严重的肠道传染性疾病，流行范围广、传播速度快、发病率高，全球每年发病约1.65亿，其中1.63亿发生在发展中国家，每年死亡100万人。志贺菌是细菌性痢疾的病原菌，氟喹诺酮类药物(以环丙沙星为代表)是世界卫生组织(WH0，2004)推荐治疗细菌性痢疾的首选药物。但志贺菌氟喹诺酮耐药呈加重趋势，现有研究表明福氏志贺菌喹诺酮类药物耐药与gyrA Ser-83 — Leu (TCG — TTG)突变的密切相关，与87位点的基因点突变也有一定关系，但志贺菌gyrA Ser-83 — Leu及87位点的基因点突变直接导致其对环丙沙星MIC多大变化还没定论。所以本研究室通过构建基因点突变(gyrA基因的83位点TCG — TTG, 87位点GAC — GGC)菌株，以研究2个位点的基因点突变对氟喹诺耐药的影响，具体如下:
[0019]人工构建福氏志贺菌2a301的gyrA基因点突变菌株。采用抗生素筛选同源重组的方法构建福氏志贺菌2a301的gyrA基因点突变菌株，卡那霉素耐药基因盒插入gyrA基因与它的下游基因(UbiG)间，引物及耐药基因盒插入位点如图1所示，操作方法如下(完成5个阶段的时间约为10天):
[0020]1.下游片段转入质粒。以福氏志贺菌2a301为模板，以表2中引物gyrAF2和gyrAR2扩增出PCR产物片段(792bp，下游引物);下游片段与质粒pUC19经KpnI和EcoRI双酶切后，连接转化至大肠杆菌DH5a，产生菌株PUC19:gyrAF2R2，经PCR扩增后证实。
[0021]2.抗生素筛选基因转入质粒，并与下游片段相连。以KanF及KanR引物扩增aphA3基因(卡那霉素耐药筛选基因)，提取PUC19:gyrAF2R2质粒。PCR产物与质粒以KpnI和XbaI双酶切后，连接并转化至大肠杆菌DH5 α，以含卡那霉素的LB培养基进行筛选，产生pUC19:gyrAF2R2:Kan菌株，经PCR扩增后证实。
[0022]3.上游片段-抗生素筛选基因-下游片段相连接。菌株I和菌株13 (见表1)为杭州市氟喹诺耐药志贺菌分离株，其中菌株13的gyrA基因的83位点((TCG — TTG，丝氨酸—亮氨酸)；菌株I除83位点外，在87位点上也有突变(GAC — GGC，天冬氨酸一甘氨酸)。①以gyrAFl和gyrARl为引物，分别以福氏2a301、菌株1、菌株13等3个菌株为PCR模板，扩增获得3种上游片段。②提取pUC19:gyrAF2R2:Kan质粒，质粒及以上的3种上游片段经XbaI及PstI双酶切连接转化至大肠杆菌DH5 α，以含卡那霉素50 μ g ml_l及含氨苄西林IOOyg ml-?的平板进行筛选。③按以上的3种上游片段克隆获得3种类型的菌株，分别为pUC19:gyrAF2R2:Kan:gyrAFlRl- 301 (上游片段以福氏 2a:301 为模板)、pUC19:gyrAF2R2:Kan:gyrAFlRl-1 (上游片段以菌株 I 为模板)、pUC19:gyrAF2R2:Kan:gyrAFlRl_13 (上游片段以菌株13为模板)。
[0023]4.“上游片段-抗生素筛选基因-下游片段”同源重组至原始菌，获得基因点突变株。①以菌株pUC19:gyrAF2R2:Kan:gyrAFlRl_301/l/13 为模板，以 gyrARl 及 gyrAR2 为引物，扩增出2560bpPCR片段。②纯化后电转化至福氏志贺菌2a301中，以含卡那霉素50 μ gml-1的LB平板筛选同源重组子，其中以pUC19:gyrAF2R2:Kan:gyrAFlRl-301为模板的获得的菌株为Kan301 (不含基因点突变的筛选抗生素耐药对照株);以菌株I和13为模板获得的菌株为Kan301:83Leu87Gly和Kan301:83Leu(含基因点突变的筛选抗生素耐药突变株)。③经PCR扩增测序后证实上述突变株。
[0024]5.对基因点突变菌株进行目的性状的研究。通过以上步骤获得I个原始菌、I个对照株和2个基因点突变株等4个菌株，具体为:S.flexneri2a301 (原始菌)，Kan301 (不含基因点突变的筛选抗生素耐药，对照株)，Kan301:83Leu (含83位点基因点突变的筛选抗生素耐药突变株I)，Kan301:83Leu87Gly (含83和87双位点基因点突变的筛选抗生素耐药突变株2)。
[0025]采用常量肉汤稀释法，测定上述4类菌株对氟喹诺酮类抗生素环丙沙星的最小抑菌浓度(MIC)，结果表明:S.flexneri2a301(原始菌)和Kan301菌株(对照株)对环丙沙星的MIC都为0.03125 μ gmL—1。我们认为在gyrA和ubiG基因间插入卡那霉素筛选抗生素基因，对目的性状(即对环丙沙星的MIC)不影响。而Kan301:83Leu(突变株I)和Kan301:83Leu87Gly菌株(突变株2)对环丙沙星的MIC都为0.125 μ gmL-1，是
S.flexneri2a301 (原始菌)和Kan301菌株(对照株)MIC的4倍。
[0026]基于以上结果，得出结论:①在福氏志贺菌gyrA基因83位点的点突变直接导致菌株对环丙沙星的MIC从0.03125 μ gmL—1上升至0.125 μ g mL'②gyrA基因87位点的是否点突变，不直接影响gyrA基因83位点的点突变对MIC的影响。
[0027]表1本研究中所用到的菌株
[0028]
【权利要求】
1.一种基于同源重组的细菌基因点突变分子克隆技术，其特征在于在目的原始菌基因A与其相邻基因B间插入基因片段C，插入的基因片段的插入位点在目的基因A和其相邻基因B的启动子间，且不影响2个基因的表达；然后采用PCR方法扩增2个片段，其中一个片段为:目的基因内部A开始到目的基因A启动子与B基因启动子之间的上游片段；另一片段为:A基因启动子与B基因启动子之间的开始到B基因内部的下游片段；再以质粒为载体，经双酶切及连接后转化将上述的两个片段和基因片段C连接获得一个新的质粒，该质粒含“上游片段-基因片段C-下游片段”;最后将新的质粒转化至原始菌。
2.根据权利要求1所述的一种基于同源重组的细菌基因点突变分子克隆技术，其特征在于包括如下步骤: (1)克隆载体及 菌株的选取:选取合适的质粒载体，确认其酶切位点，选择合适菌株作为克隆囷； (2)插入基因片段的选择； (3)上游片段及下游片段的制备:针对目的基因点突变位置和插入基因片段位置及相邻基因设计引物；每条上、下游引物添加相应的酶切位点和保护碱基，且上游片段的下游引物和下游片段的上游引物为碱基序列互补，引物位置在目的基因与其相邻基因的启动子间； (4)同源重组后基因点突变菌株的制备:上游片段、插入基因片段、下游片段分别经3次双酶切及连接后转化至克隆菌，获得两端含原始菌基因片段、中间为抗生素筛选基因的质粒。
3.根据权利要求1或2所述的一种基于同源重组的细菌基因点突变分子克隆技术，其特征在于所述的原始菌为福氏志贺菌、大肠杆菌、沙门菌、霍乱菌或空肠弯曲菌。
4.根据权利要求1或2所述的一种基于同源重组的细菌基因点突变分子克隆技术，其特征在于所述的插入基因片段为抗生素筛选基因。
【文档编号】C12R1/19GK103966248SQ201410150158
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2014年4月10日 优先权日:2014年4月10日
【发明者】濮小英, 潘劲草, 张蔚, 郑伟, 汪皓秋 申请人:杭州市疾病预防控制中心