一种用于高效构建无抗性标记重组分枝杆菌的抗性表达盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于高效构建无抗性标记重组分枝杆菌的抗性表达盒。该抗性表达盒含有精简后的潮霉素抗性基因（SEQ?ID?NO:1所示），以及位于潮霉素抗性基因两端的dif1和dif2序列。本发明精简后的Hyg基因序列由原来的1.7kb缩短至1kb左右，去掉了转录终止子，较长的天然启动子等复杂结构，便于PCR扩增，内部酶切位点更少（常见酶切位点已被定点突变掉），同时，Hyg自带短的人工启动子，在大肠杆菌和分枝杆菌中均可表达，定向插入时不影响下游基因的转录和翻译。本发明的抗性表达盒在精简后的Hyg基因两端添加了dif序列，可以在分枝杆菌中自动解离。Hyg基因丢失后，被破坏的基因仍可继续表达缩短的小肽，不影响下游基因的翻译，从而可有效避免极性效应。
【专利说明】一种用于高效构建无抗性标记重组分枝杆菌的抗性表达盒
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程领域，具体涉及一种用于高效构建无抗性标记重组分枝杆菌的抗性表达盒及其应用。
【背景技术】
[0002]Mtb是引起结核病的病原菌，可侵犯全身各器官，但以肺结核为最多见。结核病至今仍为重要的传染病，其诊断，预防和治疗研究进展缓慢。这3个方面均涉及到研究Mtb基因的功能，而对Mtb进行遗传改造在Mtb的研究中起着举足轻重的作用。结核分枝杆菌生长缓慢，难于对其进行遗传操作，需要昂贵的带负压的3级生物安全实验室，长时间培养不仅占用空间而且容易污染等等使结核分枝杆菌的研究耗时耗财耗力。以抗Mtb药物的研发为例，抗Mtb药物的研发昂贵且周期长。近半个世纪以来，直到2012年底刚刚有一种新作用机制的药物问世，且具有潜在的毒力。目前研究抗Mtb药物/疫苗最核心的问题之一就是建立有效，快速和廉价的基因工程菌。
[0003]目前在对分枝杆菌进行基因操作的过程中，仅有卡那霉素抗性基因和潮霉素抗性基因比较有效。因此，进行分枝杆菌突变株的研究时，如果所用菌株具有抗性基因，这会对以后的遗传操作带来不便。例如，基因敲除/遗传互补至少需2种抗性基因；遗传重组技术(recombineering)也需要2种抗性基因等。同时，在分枝杆菌中，有时需要表达多种抗原蛋白，需要多次遗传操作，因 此，产生无抗性重组菌株对后续操作尤为重要。可利用基因敲除技术用抗性基因将靶基因替换，但是基因敲除时还常常用到噬菌体包装技术。该技术需要将靶基因上游序列+抗性基因+靶基因下游序列(简称三片段)一起包装到噬菌体中，形成噬粒。三片段总长度有一定的限制，如果过长，将不能被包装到噬菌体，无法获得用于基因敲除的噬粒。由于包装有容量有限制，如果抗性基因短小，则可以适当增加靶基因上游序列+靶基因下游序列的长度，甚至可以加入其它元件，因此，有利于适当增加噬菌体包装的有效DNA片段长度。基因敲除后，最有效的检测方法之一是进行PCR验证，然而，以往的//汉基因具有的转录终止子具有复杂的二级结构使PCR很难进行。有发明将Zfes等序列加到Hyg两侧，而Res等序列需要人工表达一种外源蛋白来识别并作用后才可将?解离。即实际操作中，先将带的序列的质粒导入分枝杆菌,等筛选到序列插入基因组后的分枝杆菌，再导入另外一个可以表达解离蛋白的质粒，再经过筛选，可以得到?丢失的分枝杆菌。许多实验往往还需要继续筛选表达解离蛋白的质粒丢失的菌株。因此，非常繁琐，费时费力。有些类似的系统在分枝杆菌中抗性基因丢失的效率极低。dif序列加到Hyg两侧便于?基因的解离，最近几年才见报道。其优势在于，不需要人工表达外源蛋白来实现抗性基因的解离，因为分枝杆菌本身就编码这样的蛋白，因此，省去了很多不必要的麻烦。而且该系统的效率非常高，兼容性好(例如，慢速生长的结核分枝杆菌的i/i/序列在快速生长的耻垢分枝杆菌中同样起作用)。然而，在采用i/i/序列体系的研究中，其所用?抗性基因，片段长(1.7kb)，带有复杂的3’端2级结构，内部有常见的酶切位点，两端可用酶切位点少，且构建的抗性表达盒不能够“通用”。[0004]所以，如果能够构建在分枝杆菌中带有自动解离功能的更短小、易于遗传操作的带有多克隆位点的通用抗性表达盒，且可以不产生极性效应，将会极大简化多种分枝杆菌的遗传操作。在进行分枝杆菌遗传操作时候，因为利用抗性表达盒带入的抗性基因可自动解离，所以后续的遗传操作时将不会受到抗性基因选择的限制，而且，不带抗性基因的突变株也使得多种遗传研究更为可能，将为分枝杆菌的基因工程研究提供强有力的工具。
【发明内容】
[0005]本发明的一个目的在于提供一种经精简且自带人工启动子的潮霉素抗性基因Hyg0
[0006]本发明的另一个目的在于提供一种用于高效构建无抗性标记重组分枝杆菌的抗性表达盒。
[0007]本发明的另一个目的在于提供一种用于高效构建无抗性标记重组分枝杆菌的重组质粒。
[0008]本发明所采取的技术方案是:
一种精简改造后的潮霉素抗性基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0009]一种用于高效构建无抗性标记重组分枝杆菌的抗性表达盒，其含有精简改造后的潮霉素抗性基因，以及位于潮霉素抗性基因两端的ΛΥ7和序列，其特征在于，所述精简改造后的潮霉素抗性基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，difl和dif2序列分别如SEQ ID N0:7和SEQ ID N0:8所示。在此将该抗性表达盒命名为抗性表达
合”
[0010]优选的，所述抗性表达盒两端还添加了多重酶切位点。
[0011]所述抗性表达盒的核苷酸序列如SEQ ID N0:5或SEQ ID N0:6所示。
[0012]含有以上所述抗性表达盒的重组质粒。优选的，所述重组质粒的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示。
[0013]一种用于高效构建无抗性标记重组分枝杆菌的重组质粒，其含有:启动子、噬菌体整合位点、整合酶基因、dif-Ω HYG-?Τ抗性表达盒、复制起始位点。
[0014]按顺时针方向，噬菌体整合位点、整合酶基因、dif-Ω HYG-?Τ抗性表达盒依次连
接在一起。
[0015]所述启动子为LacZ启动子或BLA启动子,所述复制起始位点为大肠杆菌复制起点。
[0016]优选的，所述重组质粒的的核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示。
[0017]本发明的有益效果是:
(I)本发明精简后的场叉基因序列由原来的1.7kb缩短至Ikb左右，去掉了转录终止子，较长的天然启动子等复杂结构，便于PCR扩增，内部酶切位点更少(常见酶切位点已被定点突变掉)，同时，Hyg自带短的人工启动子,在大肠杆菌和分枝杆菌中均可表达,定向插入时不影响下游基因的转录和翻译。
[0018]( 2 )本发明的抗性表达盒在精简后的Hyg基因两端添加了 dif序列，可以在分枝杆菌中自动解离。?基因丢失后，被破坏的基因仍可继续表达缩短的小肽，不影响下游基因的翻译，从而可有效避免极性效应。[0019](3)本发明的抗性表达盒两端还添加了多重酶切位点，使得该表达盒既可以插入到特定序列中，还便于在其两侧定向添加其他序列。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]图1为质粒pU⑶HmKE的结构示意图；
图2为质粒pUCDHmKE酶切位点图；
图3为质粒pU⑶HmKE的构建流程图；
图4为整合型质粒pMH94DHmKE的结构示意图；
图5为整合型质粒pMH94DHmKE的构建流程图；
图6为整合质粒pblDHCiGn的结构示意图；
图7为质粒pblDHCiGn的构建流程图；
图8为dif-Ω HYG-?Τ表达盒与以往在分枝杆菌遗传操作中常用的含有潮霉素(HYG)抗性基因0--")的片段的比较简图(Pl，P2，P3:假定的Hyg启动子；Pa:假定的场叉人工启动子，它覆盖了表达盒中的?/i/V，常用的酶切位点:El，EcoRI (在我们的
dif-Ω WLQ-dif 表达盒中被去除了)，Nt，AfoiI ；Sp,SpeIE5, BcoRY ；M,NdeI ；H,
NindlII ；Χο,Ι?οΙ ；C,ClaI ；Xb,IbaI 各，Smal ；Nc, AfcoI ；P,PstI ；Nh, Me1-,Y,, KpnO ；
图 9 为存在于 pUCDHmke 质粒中的历.ζ?(1ΠΙ-ΖΑοΙ-1-历/?dllI 在 i/i/正链(A)
和负链(B)中的序列及其对应表达的多肽的分析(它们是表达盒Vl解离后留在基因组中的序列.Spel-Bamm-Eco-N-Eco认\-Nde\-mndl\\-Xho\-dif-Xho\-mnAIll-Ncol-Pstl-Nhel (存在于pblDHCln中)在i/i/负链中的序列及其对应表达的多肽的分析(C)，这是Jif-QHYG-Ji/表达盒V2解离后留在基因组中的序列，由三种读码框编码的氨基酸用蓝色的大写字母表示，划线部分表示在可读通的读码框中的dif序列编码的氨基酸，星号(*)表示终止子)。
【具体实施方式】
[0021]下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
[0022]以下实施例中所采用的分子生物学实验技术包括PCR扩增、质粒提取、质粒转化、DNA片段连接、酶切、凝胶电泳等，如无特殊说明，通常按照常规方法操作，具体可参见《分子克隆实验指南》(第三版)(Sambrook J, Russell Dff, Janssen K, Argentine J.黄培堂等译，2002，北京:科学出版社)，或按照制造厂商所建议的条件。
`[0023]以下实施例中PCR反应所用的pfu酶、dNTP以及相关试剂均购买自上海生工生物有限公司；抗生素潮霉素购自罗氏公司；大肠杆菌感受态DH5a购买于广州东盛生物科技有限公司，货号为C1042 ;DNA连接反应均采用Takara宝生物公司的T4 DNA连接试剂盒，型号:D6020A ;质粒DNA提取试剂盒(BSC01M1)、DNA回收试剂盒(BSC02M1)、PCR纯化试剂盒(BSC03M1)购自博日生物公司。
[0024]以下实施例中所用到的PCR引物和DNA片段由上海捷瑞生物工程有限公司负责合成。
[0025]实施例1构建质粒pU⑶HmKE
质粒PU⑶HmKE的结构示意图见图1，酶切位点图见图2，其含有上述的抗性表达盒。由图1可见，质粒PUCDHmKE按顺时针方向依次含有:大肠杆菌复制起点(pMBl0ri,?Τ-ΩΗΥ6-?Τ抗性表达盒，启动子P (BLA)(用于启动氨苄青霉素抗性基因Amp即WaA氨苄青霉素抗性基因办?/7可用于质粒筛选。
[0026]所述dif- Ω HYG-?Τ抗性表达盒上含有精简改造后的潮霉素抗性基因Qfyg、,如SEQ ID N0:1所述，该基因上的第24~73bp为启动子序列(Pr)，用于启动场?基因的表达。
?基因序列两端连接的必了序列如SEQ ID N0:7和SEQ ID N0:8所示。
[0027]另外在dif-amG-dif抗性表达盒的两端分别依次连接历fldIII酶切位点UXoI酶切位点、油al酶切位点，此3个酶切位点可用来切下质粒上的dif-QmG-dif抗性表达盒。
[0028]质粒pU⑶HmKE的构建流程图见图3，本流程中将使用到质粒pNBVl (由美国约翰霍普金斯大学William Bishai实验室惠赠，质粒图谱见图3，具体构建方法见参考文献I。质粒pNBVl中含有原始潮霉素抗性基因(场叉*)，约长1.7kb。
[0029]具体方法如下:
1.质粒pUCDis的构建
用限制性内切酶治7/?1和历‘/ III消化质粒pUC19 (商品质粒)，纯化回收试剂盒回收
2.6kb的片段；
合成DNA片段?/i/V和dif2 (如SEQ ID NO: 7和SEQ ID NO: 8所示，由上海捷瑞生物工程有限公司负责合成)，合成的?/i/V两端带有III和油<31酶切位点，i/i/J?两端带有油<31和命/?1酶切位点，所以，将difl和dif2以及纯化回收后的质粒pUC19 (Kpnl和Hindlll双酶切)进行三片段连接，转化大肠杆菌感受态DH5ci，利用含氨苄青霉素抗性的LB固体平板筛选出阳性克隆，挑取单克隆到LB液体培养基中培养后，提取质粒，酶切鉴定出正确的克隆即为质粒PU⑶is。
[0030]2.质粒 pUCDHmKE 的构建
扩增片段场叉:本步骤以质粒PNBVl为模板，用引物Hygf2 (5’ -TGTCTAGACCGGCCGTGCGGAATTAA-3，)(SEQ ID NO: 9)和 Hygr727(5，-ATTCTAGATCAGGCGCCGGGGGCGGTGTC-3’)(SEQ ID NO: 10)进行扩增。这对引物可从质粒pNBVl中扩增出约1.1kb的射片段，比原来的1.7kb明显精简了，且精简后的?基因依然可以表达并行使抗性基因的作用，其效率与原始质粒中H-基因表达抗性的效率相当。
[0031]扩增所得片段的两端带有酶切位点，将扩增获得的片段用消化，获得 ?片段切)，大小约为1.lkb。
[0032]将上一步中构建的质粒pU⑶is用ZhI消化，将以上酶切产物进行纯化回收4.0kb片段，即为pUCDI片段C?al切)。
[0033]将pUCDI片段C?al切)和Hyg片段C?al切)进行连接反应，转化大肠杆菌感受态DH5 α，利用含潮霉素抗性的LB固体平板筛选出阳性克隆，挑取单克隆到LB液体培养基中培养后，提取质粒，酶切鉴定出正确的克隆即为质粒PUCDH。将此质粒中的位点和
位点进行突变，去除掉这2个酶切位点，即得质粒pU⑶HmKE，其序列如SEQ ID NO: 2所示，其第426bp~1553bp为长1128bp的dif- Ω HYG-?Τ抗性表达盒，抗性表达盒两端为HindIII酶切位点aagctt和ZAoI酶切位点ctcgag。dif- Ω WYG-dif抗性表达盒中所含有的场?片段如SEQ ID N0:1所示。该?片段去掉了转录终止子，较长的天然启动子等复杂结构，便于PCR扩增，内部酶切位点更少(常见酶切位点已被定点突变掉)，同时，场Y自带短的人工启动子，在大肠杆菌和分枝杆菌中均可表达，定向插入时不影响下游基因的转录和翻译。
[0034]实施例2整合型质粒pMH94DHmKE的构建及应用
整合型质粒pMH94DHmKE的结构示意图见图4，质粒pMH94DHmKE按顺时针方向依次含有=LacZ启动子(可用于蓝白斑筛选，以及启动后面整个质粒骨架的表达)、噬菌体整合位点a?W、整合酶基因(可表达出整合酶，使质粒通过aii/M立点整合入分枝杆菌基因组)，dif- Ω YiYG-dif抗性表达盒,大肠杆菌复制起点(orii?)，氨节青霉素抗性基因办?/?(用于质粒筛选)。dif-QmG-dif抗性表达盒两端分别依次连接VifldIII酶切位点、通ol酶切位点，可用于切下质粒上的?///-ΩΗΥ6-ο?/抗性表达盒。
[0035]整合型质粒pMH94DHmKE的构建流程见图5，本构建流程中所用到的质粒pMH94由由美国约翰霍普金斯大学William Bishai实验室惠赠，质粒图谱见图5，具体构建方法见参考文献2。
[0036]具体操作如下:
1.将质粒PMH94与实施例1构建的质粒pUCDHmKE用HindiII消化，回收pMH94消化所得的大小约为6.0 kb的片段、pUCDHmKE消化所得的大小约为1.1 kb的片段，将两个片段进行连接反应后，转化大肠杆菌感受态DH5ci，利用含潮霉素抗性的LB固体平板筛选出阳性克隆，挑取单克隆到LB液体培养基中培养后，提取质粒，酶切鉴定出正确的克隆即为质粒 pMH94DHmKE。
[0037]2.将质粒pMH94DHmKE通过电转化的方法将其分别转入结核分枝杆菌(H37Rv结核标准菌株，由广州市胸科医院惠赠)和耻垢分枝杆菌(ATCC 700044)，获得相应的转化株。
[0038]将所得转化株于37°C孵箱中孵育12小时，充分复活细菌并使其抗性表达。用带滤芯的枪尖吹吸混匀后，分装至小管中，10000 rpm离心I分钟沉淀转化菌，弃上清，用0.6 mL7H9培养基重悬后，以500 μ?/板铺于7Η11含相应抗生素(150 μ g/mL HYG)培养板中。同时稀释一百倍后，500 KL/板铺板。避光于37度孵箱培养。
[0039]在含有潮霉素(HYG)的平板上可获得含有pMH94DHmKE质粒的结核分枝杆菌或耻垢分枝杆菌，此步证明了本发明的dif- Ω HYG-ο?/抗性表达盒可成功在分枝杆菌中表达。
[0040]将获得的带有pMH94DHmKE质粒的结核分枝杆菌或耻垢分枝杆菌转化株进行液体传代培养，在培养3天后(对于耻垢分枝杆菌)或14天后(对于结核分枝杆菌)，将培养的菌液进行稀释后铺平板，所得的平板上约有80%的菌落丢失了 Hyg抗性，即无法在含有潮霉素(HYG)的平板上生长,此步证明了本专利中的ο?/-ΩΗΥ6-ο?/抗性表达盒可成功在分枝杆菌中自动解离，且有较高的效率。
[0041]实施例3整合质粒pblDHCiGn的构建及其应用
整合质粒pblDHCiGn中，抗性表达盒以两侧带有双酶切位点的形式存在，此质粒的构建是为了证明在此种形式下，抗性表达盒依然有效。质粒结构见图6，按顺时针方向，其依次含有:启动子P(BLA)(用于启动后面办的表达)、氨苄青霉素抗性基因办 (可用于质粒筛选)、大肠杆菌复制起点、噬菌体整合位、整合酶基因Int (可表达出整合酶，使质粒通过ai#位点整合入分枝杆菌基因组)、dif-Ω HYG-?Τ抗性表达盒、增强的绿色荧光蛋白基因effP。dif-QmG-dif抗性表达盒两端连接不同的酶切位点。[0042]质粒pblDHCiGn的构建流程见图7，该流程中所用到的质粒pblueINT由美国约翰霍普金斯大学，Eric Nuermberger教授惠赠,其质粒图谱见图7,具体构建方法见参考文献3，序列如SEQ ID NO:3所示。
[0043]具体构建步骤如下:
1.构建质粒pblDHCln:用限制性内切酶治7/?1和feMlI消化质粒pblueINT，回收2.9kb 的功能片段 A ；以质粒 pUCDHmKE 为模板，用引物 Hygcf (5’-GCTGGTACCGCTAGCGCTGCAGCCATGGCAAGCTTCTCGAGTAAG-3’)(SEQ ID NO:11)和Hygcr (5’-GCAGGATCCGATATCGAATTCCATATGCCCAAGCTTCTCGAGACT-3’ ) (SEQ ID NO: 12)扩增出 1.2 kb 的 ?/i/-Ω HYG-1/i/ 片段(两端分别带有治奶1和酶切位点)，再经过酶切后，与功能片段A进行连接，得到4.1kb的质粒 pblDHCln。
[0044]2.构建质粒pblDHCGn:用限制性内切酶AfcoI和命/?1消化质粒pblDHCln，回收4.1kb的功能片段B ;以质粒pEGFP-Nl (商品质粒)为模板，用引物GYF_f(5，-GGTCCATGGTGAGCAAGGGCGAGG-3，)(SEQ ID NO:13)和 GYF-r(5，_ GCGGGTACCTTACTTGTACAGCTCGTCCATGC-3’)(SEQ ID NO: 14)扩增出 734 bp 的片段，经过酶切后，与功能片段B进行连接，得到质粒pblDHCGn。
[0045]3.构建质粒pblDHCiGn:用限制性内切酶SpeI和EcoRI消化质粒pblDHCGn，回收4.7kb的功能片段C ;用限制性内切酶尬a I和&0RI消化质粒pblueINT，回收2.1kb的
片段，与功能片段C进行连接，得到质粒pblDHCiGn，其序列如SEQ ID NO:4所示。
[0046]将构建得到的质粒pblDHCiGn通过电转化的方法转化入结核分枝杆菌或耻垢分枝杆菌中，获得相应的转化子，转化子可以观察到eGFP的表达。由此证明了在dif-QmQ-dif抗性表达盒两端添加了双酶切位点后，Hyg的启动子不仅可以启动场?抗性基因的表达，而且可以实现启动?抗性基因下游Λ./序列+酶切位点及其后面的基因的表达，此处绿色荧光蛋作为指示标记。
[0047]下一步，将获得的带有pblDHCiGn质粒的结核分枝杆菌或耻垢分枝杆菌转化株进行液体传代培养，在培养3天后(对于耻垢分枝杆菌)或14天后(对于结核分枝杆菌)，将培养的菌液进行稀释后铺平板，所得的平板上约有80%的菌落丢失了 HYG抗性，即无法在含有潮霉素(HYG)的平板上生长，由此再次证明了本发明的Jif-QHYG-Ji/抗性表达盒可成功在分枝杆菌中自动解离，且有较高的效率。而且，丢失了 HYG抗性的转化子依然可以观察到绿色荧光，此设计说明了抗性表达盒的自动解离不会对其插入后下游基因的表达产生影响，即本发明所设计的抗性表达盒无论存在与否均不影响下游基因的表达。
[0048]参考文献:
[1]Howard NS, Gomez JE, Ko C，Bishai WR.Color selection with ahygromycin-resistance-based escherichia col1-mycobacterial shuttle vector.Gene 1995;166:181-182.[2]Lee MH, Pascopella L, Jacobs WR, Jr., Hatfull GF.Site-specificintegration of mycobacteriophage 15:1ntegration-proficient vectorsfor mycobacterium smegmatis, mycobacterium tuberculosis, and bacillecalmette-guerin.Proc Natl Acad Sci USA 1991;88:3111-3115.[3]Zhang T, Li SY, Nuermberger EL.Autoluminescent Mycobacteriumtuberculosis for Rapid, Real-Time, Non-1nvasive Assessment of Drug and Vaccine
Efficacy.PLoS ONE.(2012)，7(1): e29774。
【权利要求】
1.一种精简改造后的潮霉素抗性基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.一种用于高效构建无抗性标记重组分枝杆菌的抗性表达盒，含有精简后的潮霉素抗性基因，以及位于潮霉素抗性基因两端的ΛΥ7和序列，其特征在于，所述精简后的潮霉素抗性基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，?/i/V和序列分别如SEQ ID NO: 7和SEQ ID NO:8 所示。
3.根据权利要求2所述的抗性表达盒，其特征在于，所述表达盒两段还添加了多重酶切位点。
4.根据权利要求3所述的抗性表达盒，其特征在于，所述抗性表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO:5 或 SEQ ID NO:6 所示。
5.含有权利要求2-4任一项所述抗性表达盒的重组质粒。
6.根据权利要求5所述的重组质粒，其特征在于，所述质粒的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。
7.一种用于高效构建无抗性标记重组分枝杆菌的重组质粒，其含有:启动子、噬菌体整合位点、整合酶基 因、权利要求2-4任一项所述的抗性表达盒、复制起始位点。
8.根据权利要求7所述的重组质粒，其特征在于，按顺时针方向，依次含有噬菌体整合位点、整合酶基因、权利要求2-5任一项所述的抗性表达盒。
9.根据权利要求7或8所述的重组质粒，其特征在于，所述启动子为LacZ启动子或BLA启动子，所述复制起始位点为大肠杆菌复制起点。
10.根据权利要求7或8所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒的的核苷酸序列如 SEQ ID NO:4 所示。
【文档编号】C12N15/11GK103451181SQ201310386264
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2013年8月29日 优先权日:2013年6月6日
【发明者】张天宇, 杨峰, 邹文英 申请人:中国科学院广州生物医药与健康研究院