一种通过同源重组敲除ura5基因的高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型及其构建方法
【专利摘要】本发明涉及一种高山被孢霉（Mortierella?alpinaATCC32222）的尿嘧啶营养缺陷型菌株及其构建方法。本发明采用高山被孢霉ATCC32222为材料，运用根癌农杆菌介导的遗传操作技术进基因敲除，得到一株高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型，对产油真菌高山被孢霉ATCC32222的基础理论研究及产品开发具有重要的意义。
【专利说明】—种通过同源重组敲除ura5基因的高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型及其构建方法
【【技术领域】】
[0001]本发明涉及一种高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株及其构建方法，属于生物工程【技术领域】。
【【背景技术】】
[0002]高山被孢霉是一种重要的花生四烯酸(ARA)生产菌株，它具有ARA含量高、安全、多不饱和脂肪酸(PUFAs)组成合理等特点，已经应用于工业生产ARA。目前对高山被孢霉的研究主要集中在菌种选育和发酵条件优化等方面。高山被孢霉的基因操作系统目前还没有被很好的建立起来。这就对高山被孢霉脂肪酸合成途径的基础理论研究和基因工程改造形成了极大的障碍。目前广泛使用的丝状真菌转化筛选标记有以下三种:营养缺陷型标记、抗生素抗性标记和荧光报道基因。营养缺陷型菌株经基因工程改造后，无外源抗性标记基因残留，可以用于工业生产。所以，获得性状良好的营养缺陷型菌株在工业微生物育种、遗传学、医学、食品生物技术等领域都有着非常重要的作用。但是，目前获得丝状真菌营养缺陷型菌株主要依赖于诱变筛选的方法。这种方法效率极低且经常伴随着基因组中其他位置DNA序列中未知的突变。这种由诱变得来的无表型特征的带有遗传背景隐患的菌株可能为以后的基因工程改造和工业生产带来不可预知的麻烦。
[0003]利用同源重组实现的基因敲除方法可以在不影响基因组中其他基因的前提下破坏目的基因，使目的基因编码的蛋白丧失功能，而且，与随机诱变相比，同源重组效率相对较高，通过同源重组获得目的菌株的重复性好。可见，利用同源重组定向打断目的基因，是获得优良营养缺陷型菌株的最佳方法。但是，对于丝状真菌来说，同源重组的效率受很多因素的影响:同源序列的长度、相似性、G/C含量、靶基因的转录状态、非同源末端连接、染色质结构和转化方法。在一些酵母菌中，同源序列只需达到50-100bp即可实现同源重组；而丝状真菌通常需要Ikb以上甚至几kb的高质量同源性序列。并且不同菌株、不同基因的敲除需要满足不同的条件，些许 的序列差异都可能导致同源重组的失败。乳清酸磷酸核糖转移酶(OPRTase)是高山被孢霉合成尿嘧啶合成代谢途径中的关键酶。使编码OPRTase的ura5基因失活，可以获得高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株。但是，由于ura5基因在细胞生命过程中具有极其重要的地位，导致了真核细胞的自我防御与修复机制作用十分敏感。用基因敲除的方法靶向失活ura5基因构建丝状真菌的尿嘧啶营养缺陷型菌株，在国际上一直未有公开报道的成功先例。
[0004]难以被转化是丝状真菌基因操作系统远远落后于与其他物种的重要原因之一。在国内一直未见对高山被孢霉遗传操作的先例。根癌农杆菌介导的转化方法已经被越来越多的应用到丝状真菌中，和其它转化方法相比具有四个优点:一、受体细胞可以是孢子或菌丝，不需制备原生质体。二、选择具有单核的孢子作为受体时可避免菌丝的多核所造成的转化子不稳定的问题。三、该方法利用天然的转化载体系统，转化效率高，成功率高，载体可容纳大片段的异源DNA，且基本上为单拷贝插入。四、该方法可以提高同源重组效率。因此，通过根癌农杆菌的转化为高山被孢霉ura5基因靶向失活提供了有效操作手段。
[0005]高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株为这种重要的PUFAs生产菌株的基因操作提供了先决条件。这种营养缺陷性菌株既可用于对产油真菌脂肪酸合成与积累的理论研究，也可用于基因工程改造，具有成为PUFAs超级工业生产菌株的潜力。
【
【发明内容】
】
[0006]本发明要解决的技术问题是提供一种高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株。所述营养缺陷型菌株是通过同源重组的方法祀向缺失Mortierella alpina ATCC32222ura5基因(654bp)中的213bp_230bp共18bp的序列实现的。
[0007]所述同源重组的同源臂DNA序列来源于Mortierella alpina ATCC32222基因组(DDBJ/EMBL/GenBank accession ADAG00000000, first version ADAGO1000000)中，ura5基因上游1393bp (-1180至+212)和下游1362bp (+231至+1592)的片段。
[0008]本发明还提供了一种构建高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株的方法，所述方法包括获得ura5敲除基因片段，并利用ura5敲除基因片段进一步构建敲除质粒pBIG4K0ura5。然后用重组质粒pBIG4K0ura5转化根癌农杆菌，最后用经转化的含质粒pBIG4K0ura5的根癌农杆菌转化高山被孢霉并对转化后的高山被孢霉进行筛选和鉴定，获得尿嘧啶营养缺陷型菌株。具体步骤如图1，用PCR的方法获得质粒pBluescriptIISK+的MCS基因片段。用限制性内切酶NheI和MunI，EcoRI和XbaI分别对MCS基因片段和质粒pBIG2RHPH2进行酶切，并通过连接反应将MCS基因片段插入质粒pBIG2RHPH2的EcoRI和XbaI位点之间得到质粒PBIG4。用融合PCR的方法获得并连接ura5基因的上下游序列，得到敲除基因片段。用限制性内切酶EcoRI和KpnI对敲除基因片段和质粒pBIG4进行酶切，并通过连接反应将敲除基因片段插入质粒PBIG4，得到重组质粒pBIG4K0ura5。将重组质粒pBIG4K0ura5转化根癌农杆菌C58C1。借助 根癌农杆菌C58C1介导的基因同源重组打断ura5基因，经过筛选鉴定得到高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株。
[0009]具体地，本发明提供一种高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株，该菌株是通过失活MortierellaalpinaATCC32222基因组中编码乳清酸磷酸核糖转移酶OPRTase的ura5基因构建而成的。
[0010]根据一种优选的实施方式，ura5基因的失活是通过缺失654bp的ura5基因中的213bp-230bp共18bp的序列而实现的。
[0011]本发明还提供一种制备权利要求1或2所述的高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株的方法,通过同源重组使高山被孢霉ura5基因中的213bp-230bp共18bp序列缺失从而使ura5基因失活，所使用的同源臂分别是ura5基因上游-1180至+212的1393bp和下游+231至+1592的1362bp的片段，具体步骤为:首先获得ura5敲除基因片段，并进一步构建敲除质粒pBIG4K0ura5，然后用重组质粒pBIG4K0ura5转化根癌农杆菌，最后用经转化的含质粒 pBIG4K0ura5 的根癌土壤杆菌 Agrobacterium tumefaciensC58Cl-pBIG4K0ura5(CGMCCN0.7730)转化高山被孢霉并对转化后的高山被孢霉进行筛选和鉴定，获得尿嘧啶营养缺陷型菌株。
[0012]其中所使用的根癌农杆菌为:Agrobacterium tumefaciensC58Cl。此菌株获赠于日本京都县立大学YasuyukiKubo教授。[0013]基因敲除使用的根癌农杆菌起始载体为:pBIG2RHPH2。此载体获赠于日本京都县立大学Yasuyuki Kubo教授，其序列为SEQ N0.1。
[0014]根据一种优选的实施方式，基因敲除载体构建的具体步骤如下:
[0015]I)用PCR的方法获得质粒pBluescript II SK+的MCS基因片段；
[0016]2)用限制性内切酶EcoRI和XbaI对MCS基因片段和质粒pBIG2RHPH2进行酶切，并通过连接反应将MCS基因片段插入质粒pBIG2RHPH2的EcoRI和XbaI位点之间得到质粒PBIG4 ；
[0017]3)用融合PCR的方法获得并连接ura5基因的上下游序列，得到敲除基因片段；
[0018]4)用限制性内切酶EcoRI和KpnI对敲除基因片段和质粒pBIG4进行酶切，并通过连接反应将敲除基因片段插入质粒PBIG4获得pBIG4K0ura5。
[0019]优选地，步骤3)中的敲除基因片段是通过下述步骤获得的，
[0020]首先根据NCBI数据库设计如下引物
[0021]Pl:GACCGGAATTCCGACGCTGACATTACACATTTATCC
[0022]P2:TGACGGTGGTGCAGGCCAGAGGGCCAAAGATGATGTCGTGCTCAATG
[0023]P3:TTGAGCACGACATCATCTTTGGCCCTCTGGCCTGCACCACCGTCATT
[0024]P4:TGCGGGGTACCCATGCGAATCACAGATATGG
[0025]然后以高山被孢霉AT CC32222基因组为模板，用引物P1、P2和引物P3、P4分别扩增上下游片段，再以上下游片段为模板，在反应体系中加入PU P4进行融合PCR反应，获得K0ura5敲除基因片段。
[0026]更优选地,根据质粒pBluescriptIISK+的序列信息设计如下引物:
[0027]MCS 上游:TTTCGCTAGCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGT
[0028]MCS 下游:AACAACAATTGGGGCTCCACCGCGGTGGCGGCCG
[0029]然后用PCR的方法获得步骤I)中的质粒pBluescriptIISK+的MCS基因片段。
[0030]所述的根癌农杆菌介导的基因敲除方法是采用根癌农杆菌转化高山被孢霉，具体为:取100 μ L根癌农杆菌与100 μ L高山被孢霉孢子混合，均匀涂布于铺有玻璃纸頂固体培养基上，进行转化培养，然后筛选获得高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株。
[0031]在本发明中，根癌农杆菌转化高山被孢霉的具体步骤如下:
[0032](I)取保存于_80°C的含有质粒pBIG4K0ura5的根癌农杆菌C58C1于含有100 μ g/mL利福平和100 μ g/mL卡那霉素的YEP固体培养基平板划线；30°C倒置避光培养48小时；
[0033]⑵挑取单克隆接种至20mL含有100 μ g/mL利福平和100 μ g/mL卡那霉素的液体YEP培养基中30°C，200rpm避光培养24-48小时；
[0034]⑶4000g离心5分钟收集菌体，倒掉上清，加5mUM培养基重悬菌体，4000g离心5分钟，倒掉上清，加2mUM培养基重悬菌体；
[0035]⑷用頂培养基调整菌浓度至0D600=0.9，30°C，200rpm避光培养至O D 600 =
1.5 ；
[0036](5)收集高山被孢霉孢子，用血球计数器计数，调整孢子浓度到IO6个每100μ L ;
[0037](6)取100 μ L根癌农杆菌与100 μ L孢子混合，均匀涂布于铺有玻璃纸頂固体培养基上，23°C避光培养48-96小时；
[0038](7)将玻璃纸转移到含有100 μ g/mL壮观霉素，100 μ g/mL头孢噻肟，0.05g/L尿嘧啶的GY平板上，25-30°C培养至产生大量孢子。
[0039]在本发明中，IM固体培养基是以组分 1.74g/LK2HP04,1.37g/LKH2P04,0.146g/LNaCl，0.49g/LMgS04.7Η20，0.078g/LCaCl2,0.0025g/LFeS04.7Η20，0.53g/L (NH4)2SO4, 7.8g/LMES, 1.8g/L葡萄糖，0.5%甘油，20g/L琼脂构成的。
[0040]本发明基于对高山被孢霉ATCC32222基因组生物信息学分析的基础上，采用根癌农杆菌介导的基因敲除的方法，经过大量的实践尝试，构建了高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株。获得的高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株具有多次传代的遗传稳定性，且脂肪组分析结果与原养型菌株无明显差别。该菌株可以作为基因工程的受体菌株使用。
[0041]本发明获得的根癌土壤杆菌Agrobacterium tumefaciens C58C1-pBIG4K0ura5已于2013年06月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号为CGMCCN0.7730。
【【专利附图】
【附图说明】】
[0042]图1为构建敲除质粒示意图；
[0043]图2为高山被孢霉OPRTase保守结构域分析示意图；
[0044]图3为融合PCR琼脂糖凝胶电泳图。
【【具体实施方式】】
[0045]以下通过实施例来进一步阐述本发明，下例实施例中未注明具体条件的实验方法，基本上都按照常见的分子克隆手册进行实验操作。
[0046]实施例1:高山被孢霉ATCC32222基因组生物信息学分析
[0047]根据高山被孢霉ATCC32222 基因组信息(DDBJ/EMBL/GenBank accessionADAG00000000, first versionADAG01000000)预测的蛋白质编码序列经 BLAST(E-valuelE-5)对蛋白数据库 NR(www.ncb1.nlm.nih.gov),KOGs 和 COGs,KEGG, Swiss-Prot和UniReflOO, BRENDA搜索比对。使用InterProScan对蛋白质结构数据库进行比对。预测得到编码OPRTase的ura5基因coding序列全长654bp,其基因组序列无内含子。并根据ura5基因序列信息map高山被孢霉基因组序列，得到ura5基因以及上下游序列信息。
[0048]实施例2:K0ura5敲除基因片段的获得
[0049]根据基因组生物信息学分析结果，针对OPRTase的蛋白质保守序列的活性位点(如图2)，对ura5基因的DNA序列设计了包含不同长度的同源臂DNA序列敲除方案，以不同的长度和间距的上下游序列片段组合尝试对ura5基因进行打断。经过大量实践和比较筛选过程确认，使用的同源臂分别是ura5基因上游-1180至+212的1393bp和下游+231至+1592的1362bp的片段时，能够获得以下成功实施案例。该成功案例的具体实施步骤如下:
[0050]首先，根据NCBI数据库中设计引物
[0051]Pl:GACCGGAATTCCGACGCTGACATTACACATTTATCC
[0052]P2:TGACGGTGGTGCAGGCCAGAGGGCCAAAGATGATGTCGTGCTCAATG
[0053]P3:TTGAGCACGACATCATCTTTGGCCCTCTGGCCTGCACCACCGTCATT
[0054]P4:TGCGGGGTACCCATGCGAATCACAGATATGG
[0055]引物P15'端引入EcoRI酶切位点；引物P45'端引入KpnI酶切位点。以高山被孢霉ATCC32222基因组为模板，用引物P1、P2和引物P3、P4分别扩增上下游片段。切胶纯化。再以上下游片段为模板，反应体系中加入P1、P4进行融合PCR反应，获得K0ura5敲除基因片段，各PCR产物琼脂糖凝胶电泳见图3，Ml为D2000Marker，l号泳道为上游同源臂，2号泳道为下游同源臂，3号泳道为融合PCR产物，M2为lkbladderMarker。将基因克隆到pEGMT-easy 载体上，3730 测序。
[0056]实施例3:敲除质粒pBIG4K0ura5的构建
[0057]根据质粒pBluescriptIISK+的序列信息设计引物:
[0058]MCS 上游:TTTCGCTAGCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGT
[0059]MCS 下游:AACAACAATTGGGGCTCCACCGCGGTGGCGGCCG
[0060]用PCR的方法获得质粒pBluescriptIISK+的MCS基因片段。
[0061]用限制性内切酶EcoRI和XbaI对MCS基因片段和质粒pBIG2RHPH2进行双酶切，试剂盒回收后，使用T4连接酶连接。连接体系为(IOyL):MCS基因片段2yL，载体2yL，10XT4连接酶buffer I μ L，T4连接酶I μ L，无菌水41 μ L。4°C过夜连接。
[0062]连接产物转化大肠杆菌T0P10感受态。转化方法如下:
[0063]⑴无菌状态下取100 μ L感受态细胞，加入1-2 μ L连接产物，混匀。
[0064]⑵将⑴中感受态移入电转杯中，避免产生气泡。
[0065]⑶将电转杯放入Bio-Rad电转仪，调到合适预设程序档位，电转。
[0066]⑷电转后的感受态移至含有900 μ LSOC复苏培养基的离心管中，37°C，150rpml小时。
[0067](5)取200 μ L涂布100 μ g/mL卡那霉素抗性YEP固体培养基平板。倒置37°C培养过夜。
[0068]挑取阳性转化子，提取质粒，测序验证，结果表明连接成功。获得质粒PBIG4。
[0069]用限制性内切酶NheI和MunI，EcoRI和KpnI对敲除基因片段K0ura5和质粒pBIG4进行酶切，试剂盒回收后，使用T4连接酶连接，转化T0P10感受态，挑取阳性转化子，提取质粒，测序验证，结果表明连接成功。获得质粒pBIG4K0ura5。
[0070]其中，SOC复苏培养基是以组分20g/LTryptOne，5g/L酵母粉，0.5g/LNaCl, 2.5mMKCl, IOmMMgCl2.20mM葡萄糖构成的；YEP固体培养基是以组分IOg/LTryptone, 10g/L 酵母粉,5g/LNaCl, 20g/L 琼脂构成的。
[0071]实施例4:根癌农杆菌介导转化高山被孢霉
[0072]在已有的国内外文献有关根癌农杆菌转化方法报道的基础上，做了适当的优化调整，具体成功实施例如下:
[0073]⑴取保存于_80°C的含有质粒pBIG4K0ura5的根癌农杆菌C58C1于含有100 μ g/mL利福平和100 μ g/mL卡那霉素的YEP固体培养基平板划线。30°C倒置避光培养48小时。
[0074]⑵挑取单克隆接种至20mL含有100 μ g/mL利福平和100 μ g/mL卡那霉素的液体YEP培养基中30°C，200rpm避光培养24-48小时。
[0075](3) 4000g离心5分钟收集菌体，倒掉上清。加5mUM培养基重悬菌体，4000g离心5分钟，倒掉上清。加2mUM培养基重悬菌体。
[0076]⑷用頂培养基调整菌浓度至0D600=0.9。30°C，200rpm避光培养至0D600-1.5。
[0077](5)收集高山被孢霉孢子，用血球计数器计数，调整孢子浓度到IO6个每100 μ L。[0078](6)取100 μ L根癌农杆菌与100 μ L孢子混合，均匀涂布于铺有玻璃纸頂固体培养基上。23°C避光培养48-96小时。
[0079](7)将玻璃纸转移到含有100 μ g/mL壮观霉素，100 μ g/mL头孢噻肟，0.05g/L尿嘧啶的GY平板上。25-30°C培养至产生大量孢子。
[0080]其中，液体YEP培养基是以组分lOg/LTryptone，10g/L酵母粉，5g/LNaCl构成的。
[0081]实施例5:高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株筛选和鉴定
[0082]⑴用3mL生理盐水冲刷共培养的平皿表面，收集液体于一个无菌1.5mL离心管中。过25 μ m滤膜。
[0083]⑵分别取200 μ L涂布于含有lmg/mL5-F0A，100 μ g/mL壮观霉素，100 μ g/mL头孢噻肟，0.05g/L尿嘧啶的GY平板上。
[0084](3)25°C避光培养 5_10 天。
[0085]⑷随时用无菌镊子挑出长出的真菌菌丝，接种于含有lmg/mL5-F0A，100 μ g/mL壮观霉素，100 μ g/mL头孢噻肟，0.05g/L尿嘧啶的GY平板上。25°C避光培养2_4天。
[0086](5)将⑷中明显生长的菌落分别接种到含有尿嘧啶和不含有尿嘧啶的SC固体平板上。
[0087]25 O 培养 2-4 天。
[0088](6)观察在高山被孢霉两种平板上的生长情况。挑出只在含有尿嘧啶的SC平板上生长的菌落，接种于含有0.5mg/mL5-F0A的GY斜面上。
[0089](7)将(6)中斜面上的高山被孢霉菌株孢子在含有0.5mg/mL5-F0A的GY斜面上传代3次，每一次传代都重复步骤(5)中描述实验。
[0090]⑶稳定遗传的菌株鉴定为尿卩密唳营养缺陷型表型保藏于含有0.5mg/mL5-F0A的GY斜面上。
[0091]⑶提取具有尿嘧啶营养缺陷型表型高山被孢霉基因组。用引物:
[0092]上游:ATGACCATCAAGGATTACCAGCGCG
[0093]下游:ATCCTTAAACACCGTACTTCTCGCG
[0094]PCR获得ura5基因，PCR产物纯化后，测序，鉴定为213bp_230bp缺失的ura5基因。
[0095]实施例6:高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株脂肪组提取与检测
[0096]⑴将高山被孢霉原养型菌株与实施例5筛选获得的三株高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株接种于发酵培养基(营养缺陷型菌株需额外添加0.05g/L尿嘧啶)中，25°C，200rpm 培养 7-14 天。
[0097]其中，发酵培养基是购买自以组分50g/L葡萄糖，2.0g/LL-酒石酸铵，7.0g/LKH2PO4, 2.0g/LNa2HP04, 1.5g/LMgS04.7H20,1.5g/LYeast extract，。.lg/L CaCl2.2H20,8mg/LFeCl3.6H20, lmg/LZnS04.7H20,0.lmg/LCuS04.5H20,0.lmg/LCo (NO3) 2.6H20,0.lmg/LMnSO4.5H20 构成的。
[0098]⑵收集菌体，冷冻干燥。
[0099]⑶取IOOmg干重菌丝，加入2mL4mol/L盐酸。
[0100](4) 80°C水浴0.5小时，-800C 15分钟。重复一次。80°C水浴0.5小时。
[0101](5)冷却至室温,加入ImL甲醇,混匀。[0102](6)加入1mL氯仿，震荡10分钟。6000g离心3分钟。收集氯仿。
[0103](7)重复(6)两次。
[0104](8)合并氯仿(3mL)，加入ImL饱和氯化钠，混匀，3000g离心3分钟。收集氯仿层于新瓶。剩余液体加入ImL氯仿，3000g离心3分钟。合并氯仿(4mL)。
[0105](9)氮吹干燥，加入ImL乙醚，转移至洁净的已经称重的瓶中。氮吹干燥，称重得到总脂肪重量。高山被孢霉原养型菌株与三株尿嘧啶营养缺陷型菌株总脂肪含量见表1。
[0106]表1、高山被孢霉原养型菌株与三株尿嘧啶营养缺陷型菌株总脂肪含量
[0107]
【权利要求】
1.一种高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株，其特征在于该菌株是通过失活Mortierella alpinaATCC32222基因组中编码乳清酸磷酸核糖转移酶OPRTase的ura5基因构建而成的。
2.根据权利要求1所述的高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株，其特征在于:ura5基因的失活是通过缺失654bp的ura5基因中的213bp_230bp共18bp的序列而实现的。
3.一种制备权利要求1或2所述的高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株的方法，其特征在于，通过同源重组使高山被孢霉ura5基因中的213bp-230bp共18bp序列缺失从而使ura5基因失活，所使用的同源臂分别是ura5基因上游-1180至+212的1393bp和下游+231至+1592的1362bp的片段，具体步骤为:首先获得ura5敲除基因片段，并进一步构建敲除质粒pBIG4K0ura5，然后用重组质粒pBIG4K0ura5转化根癌农杆菌，最后用经转化的含质粒pBIG4K0ura5的根癌土壤杆菌转化高山被孢霉并对转化后的高山被孢霉进行筛选和鉴定，获得尿嘧啶营养缺陷型菌株。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，其中所使用的根癌农杆菌为:Agrobacterium tumefaciensC58Cl。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，基因敲除使用的根癌农杆菌起始载体为:PBIG2RHPH2。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，基因敲除载体构建的具体步骤如下: 1)用PCR的方法获得质粒pBluescriptII SK+的MCS基因片段； 2)用限制性内切酶EcoRI和XbaI对MCS基因片段和质粒pBIG2RHPH2进行酶切，并通过连接反应将MCS基因片段插入质粒pBIG2RHPH2的EcoRI和XbaI位点之间得到质粒pBIG4 ； 3)用融合PCR的方法获得并连接ura5基因的上下游序列，得到敲除基因片段； 4)用限制性内切酶EcoRI和KpnI对敲除基因片段和质粒pBIG4进行酶切，并通过连接反应将敲除基因片段插入质粒PBIG4获得pBIG4K0ura5。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤3)中的敲除基因片段是通过下述步骤获得的， 首先根据NCBI数据库设计如下引物
PI:GACCGGAATTCCGACGCTGACATTACACATTTATCC
P2:TGACGGTGGTGCAGGCCAGAGGGCCAAAGATGATGTCGTGCTCAATG
P3:TTGAGCACGACATCATCTTTGGCCCTCTGGCCTGCACCACCGTCATT
P4: TGCGGGGTACCCATGCGAATCACAGATATGG 然后以高山被孢霉ATCC32222基因组为模板，用引物P1、P2和引物P3、P4分别扩增上下游片段，再以上下游片段为模板，在反应体系中加入P1、P4进行融合PCR反应，获得K0ura5敲除基因片段。
8.根据权利要求7所述的方法,其特征在于,根据质粒pBluescriptIISK+的序列信息设计如下引物:
MCS 上游:TTTCGCTAGCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGT
MCS 下游:AACAACAATTGGGGCTCCACCGCGGTGGCGGCCG 然后用PCR的方法获得步骤I)中的质粒pBluescriptIISK+的MCS基因片段。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的根癌农杆菌介导的基因敲除方法是采用根癌农杆菌转化高山被孢霉，具体为:取100 μ L根癌农杆菌与100 μ L高山被孢霉孢子混合，均匀涂布于铺有玻璃纸頂固体培养基上，进行转化培养，然后筛选获得高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于根癌农杆菌转化高山被孢霉的具体步骤如下: Cl)取保存于-80°C的含有质粒pBIG4KOura5的根癌农杆菌C58C1于含有100 μ g/mL利福平和100 μ g/mL卡那霉素的YEP固体培养基平板划线；30°C倒置避光培养48小时； ⑵挑取单克隆接种至20mL含有100 μ g/mL利福平和100 μ g/mL卡那霉素的液体YEP培养基中30°C，200rpm避光培养24-48小时； ⑶4000g离心5分钟收集菌体，倒掉上清，加5mUM培养基重悬菌体，4000g离心5分钟，倒掉上清，加2mUM培养基重悬菌体； ⑷用頂培养基调整菌浓度至0D600=0.9，30°C，200rpm避光培养至O D 600 = 1.5 ;(5)收集高山被孢霉孢子，用血球计数器计数，调整孢子浓度到IO6个每100μL ; (6)取100μ L根癌农杆菌与100 μ L孢子混合，均匀涂布于铺有玻璃纸頂固体培养基上，23 °C避光培养48-96小时； (7)将玻璃纸转移到含有100μ g/mL壮观霉素，100 μ g/mL头孢噻肟，0.05g/L尿嘧啶的GY平板上，25-30°C培养 至产生大量孢子。
【文档编号】C12R1/645GK103468581SQ201310347934
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年8月9日 优先权日:2013年8月9日
【发明者】陈卫, 郝光飞, 陈永泉, 陈海琴, 黄小云, 杜凯, 赵山山, 张灏 申请人:江南大学