一株敲除丙酮酸甲酸裂解酶基因的工程菌及其应用的制作方法

一株敲除丙酮酸甲酸裂解酶基因的工程菌及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一株敲除丙酮酸甲酸裂解酶基因的工程菌及其应用。本发明利用基因同源重组、基因插入失活的方法敲除产1,3-丙二醇的野生型菌株中的丙酮酸甲酸裂解酶flpB基因，从而得到甲酸代谢途径被阻断的基因工程菌。用本发明的工程菌进行1,3-丙二醇的发酵生产，副产物甲酸合成大幅度降低，使得甲酸对细胞的毒害作用降低，1,3-丙二醇浓度、生产强度与底物转化率提高。实验证明，将本发明的工程菌按常规方法发酵32小时，甲酸合成量降低90％以上，1,3-丙二醇浓度可达72g/L以上。本发明将促进微生物发酵法生产1,3-丙二醇技术进步，具有应用价值。
【专利说明】一株敲除丙酮酸甲酸裂解酶基因的工程菌及其应用

【技术领域】
[0001] 本发明属于生物【技术领域】，具体涉及一株敲除丙酮酸甲酸裂解酶基因的工程菌及 其应用。

【背景技术】：
[0002] 1，3-丙二醇（PDO)是一种重要的化工原料，有多种重要用途。它可用来合成杂环、 药物中间体、聚酯、润滑剂、染料、油墨、防冻剂等，其主要用途是合成聚酯-聚对苯二甲酸 丙二醇脂（PTT)。PTT是继50年代聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET)、70年代聚对苯二甲酸丁 二醇酯（PBT)之后实现工业规模的新的可成纤聚酯高分子材料，是一种极有发展前途的新 型聚酯材料。1998年PTT被美国评为六大石化新产品之一。PTT与PET、PBT相比除具有聚 酯的耐化学性外，还具有其它一些更优良的特性。如尼龙的弹性恢复性；在全范围无需添加 特殊化学药品即能呈现良好的连续印染特性；抗紫外、臭氧和氮氧化合物的着色性；抗内 应力；低水吸附、低静电以及良好的可生物降解性；可循环利用性等。由于PTT的具有以上 优良特性，它在地毯工业、服装材料、工程热塑料以及其它众多领域有着很广泛的应用。
[0003] Dupont和Shell两家跨国公司曾采用化学合成路线，以环氧乙烷或丙烯为原料生 产roo。化学合成法生产roo的缺点是副产物多，选择性和产率较低，操作条件需要高温高 压，设备投资巨大，原料不可再生；同时由于产量有限，长期以来roo售价偏高。目前ι，3-丙 二醇的生产方法主要是微生物发酵法。与化学合成法相比，微生物发酵法生产1，3-丙二醇 具有显著的优点：1、利用成本较低的可再生资源（如甘油、玉米、淀粉）为原料；2、生产条 件温和，操作简便，不需贵重金属催化剂；3、选择性好，副产物较少，易于分离纯化；4、环境 污染小。微生物发酵法是以生物技术为特征的"绿色工业"向传统石油化工提出的强有力 的挑战，具有重要的现实意义，因而越来越受到重视。
[0004] 微生物发酵法生产1，3-丙二醇是利用微生物歧化甘油产生。至今所有被发现的 1,3-丙二醇生产菌种均为细菌，其中克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae)、弗氏梓檬酸杆 菌（Citrobacter freudii)和丁酸梭菌（Clostridium butyricum)具有较高的 1，3_ 丙二 醇转化率和1，3-丙二醇生产强度，具有较高的开发前景，从而得到了较多关注。
[0005] 目前被用来生产1，3_丙二醇的克雷伯氏菌主要分离自土壤环境中。克雷伯氏菌 只能利用甘油产生1，3-丙二醇。在发酵产生1，3-丙二醇的过程中，甘油发生岐化反应。还 原途径包括两步反应：第一步，由依赖于辅酶B 12的甘油脱水酶催化甘油脱水生成3-羟基丙 醛；第二步，由1，3-丙二醇氧化还原酶催化3-羟基丙醛还原生成1，3-丙二醇，此过程消耗 1摩尔还原力。还原途径则消耗氧化途径中多余的还原力，生成1，3_丙二醇。氧化途径中 的产物与糖类发酵产物一致，并产生供细胞生长所必需的ATP，在氧化产物形成的同时释放 还原力NADH。氧化途径中甘油先被氧化生成丙酮酸；丙酮酸被丙酮酸甲酸裂解酶催化分解 为乙酰CoA和甲酸，甲酸容易分解为0) 2和H 2。乙酰CoA在经乙酰磷酸形成乙酸的过程中 生成过量的ATP，而在经乙醛形成乙醇的反应中要消耗2摩尔还原力；丙酮酸也可能转化为 2, 3-丁二醇，乳酸和琥珀酸，生成乳酸的过程要消耗1摩尔还原力，而生成琥珀酸的过程要 消耗2摩尔还原力。
[0006] 克雷伯氏菌发酵甘油产生1，3-丙二醇，从代谢途径分析可知，甘油被转化为主产 物1，3-丙二醇的同时，产生多种副产物：甲酸、乳酸、乙酸、琥珀酸、2, 3-丁二醇和乙醇等。 副产物有机酸往往对发酵产生抑制作用。有文献报道甲酸、乙酸、乳酸等对微生物菌体生长 及利用底物存在抑制作用。甲酸抑制作用大于乙酸，lg/L甲酸即明显抑制底物利用及菌体 生长，2g/L乙酸开始对发酵产生较明显影响，而乳酸的抑制浓度较高。甲酸可能对克雷伯氏 菌发酵甘油产生1，3-丙二醇产生抑制作用。副产物有机酸的生成不但抑制细胞生长，还会 造成底物甘油的浪费。例如，乳酸的产生导致1，3-丙二醇产量降低。研宄报道敲除乳酸代 谢途径关键编码基因乳酸脱氢酶基因，可以使乳酸合成大幅度减少，1，3-丙二醇生产能力 得到增强。


【发明内容】
：
[0007] 本发明的目的是提供一种生产1，3-丙二醇的工程菌一敲除甲酸代谢途径基因的 工程菌及其构建方法和应用。
[0008] 本发明的敲除甲酸代谢途径基因的工程菌，是通过以下方法构建的，将产1，3_丙 二醇的野生型菌株的丙酮酸甲酸裂解酶flpB基因敲除后获得的工程菌。
[0009] 所述的1，3-丙二醇的野生型菌株优选为克雷伯氏菌属（Klebsiella)的细菌，进 一步优选为肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae) 〇
[0010] 所述的将克雷伯氏菌的丙酮酸甲酸裂解酶flpB基因敲除，优选通过以下方法敲 除：
[0011] a、PCR扩增克雷伯氏菌的丙酮酸甲酸裂解酶flpB基因的部分序列，将其与自杀载 体相连，然后再导入杂交供体菌株中；
[0012] b、将步骤a获得的携带有丙酮酸甲酸裂解酶flpB基因的部分序列与自杀载体的 供体菌与克雷伯氏菌进行双亲本杂交，利用同源重组、基因插入失活，经筛选后获得丙酮酸 甲酸裂解酶flpB基因被失活的敲除乙酸代谢途径基因的克雷伯氏菌。
[0013] 所述的步骤a的PCR扩增克雷伯氏菌的丙酮酸甲酸裂解酶f I pB基因的部分 序列是丙酮酸甲酸裂解酶flpB基因的哪一部分序列并不重要，只要是该基因的部分同 源序列即可。当所述的产1，3_丙二醇的野生型菌株为肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae)时，所述的步骤a的PCR扩增克雷伯氏菌的丙酮酸甲酸裂解酶flpB基 因的部分序列优选为是以肺炎克雷伯氏菌的基因组DNA为模板，以上游引物pflB-F: taggtacctgaaagacaaattcgcccag 与下游弓丨物 pflB-R :gagagctccatgcgatccattacttcgt 组 成的引物进行PCR扩增后的序列。
[0014] 所述的自杀载体可为自杀载体pGPCm，可从试剂公司购买。
[0015] 所述的将携带有丙酮酸甲酸裂解酶flpB基因部分同源序列的自杀载体导入杂交 供体菌株中，可以通过热激法、电转化法、接合转化法等常规方法转化杂交供体菌。
[0016] 所述的杂交供体菌可以为大肠杆菌SMlO ( λ Pir)。通过双亲本杂交，使丙酮酸甲酸 裂解酶flpB基因的部分序列与产1，3-丙二醇的目的菌株发生同源重组，从而使产1，3-丙 二醇的野生型菌株中的丙酮酸甲酸裂解酶flpB基因插入失活，从而获得敲除甲酸代谢途 径基因的工程菌。
[0017] 本发明还提供了敲除甲酸代谢途径基因的工程菌在生产1，3-丙二醇中的应用。
[0018] 本发明利用同源重组、基因插入失活的方法使产1，3-丙二醇的野生型菌株中的 丙酮酸甲酸裂解酶flpB基因沉默，从而得到甲酸代谢途径被阻断的基因工程菌。用本发明 的工程菌进行1，3-丙二醇的发酵生产，甲酸生产大幅度降低，使得副产物甲酸对细胞的毒 害作用大大减少，1，3-丙二醇生产浓度、速率提高，另外，由于减少甲酸的代谢分流作用，提 高了底物转化率。实验证明，将本发明的工程菌按常规方法发酵32小时，1，3-丙二醇浓度 可达72g/L以上，甲酸合成减少90%以上。本发明在微生物发酵法生产1，3-丙二醇具有实 用价值，可促进微生物发酵生产1，3-丙二醇水平提高。

【专利附图】

【附图说明】：
[0019] 图1是回收并纯化PCR扩增的PflB基因目的片段图
[0020] 图2是载体pGPCm的物理图谱

【具体实施方式】：
[0021] 以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0022] 实施例1 :甲酸代谢途径关键基因一丙酮酸甲酸裂解酶flpB基因被失活的肺炎克 雷伯氏菌突变株的构建。
[0023] (1)、克隆丙酮酸甲酸裂解酶基因 pflB部分序列
[0024] 设计PCR扩增部分丙酮酸甲酸裂解酶flpB基因序列的引物，引物序列 如下：上游引物 pflB-F :taggtacctgaaagacaaattcgcccag 与下游引物 pflB-R : gagagctccatgcgatccattacttcgt。以野生型肺炎克雷伯氏菌（保藏于中国典型培养物保 藏中心，保藏编号为：CCTCC M 2011075)基因组DNA为模板，在引物pflB-F和pflB-R的引 导下，PCR扩增丙酮酸甲酸裂解酶pflB的部分序列，PCR扩增条件为：先95°C 3min ;然后 94°C lmin，50°C lmin，72°C lmin，共 32 个循环；最后 72°C lOmin。反应结束后，将 PCR 扩增 产物进行1. 0%琼脂糖凝胶电泳，回收并纯化约850bp的目的基因片段（图1)，将其克隆入 载体PMD18-T (TaKaRa公司）中，将重组质粒转化大肠杆菌Dh5a感受态细胞，筛选阳性转 化子，提质粒，测序验证，用限制性内切酶kpnl和sacl进行酶切鉴定，获得插入序列正确的 重组质粒，命名为pT-pflB质粒。
[0025] (2)、构建丙酮酸甲酸裂解酶基因 pflB自杀载体pGP-pfIB
[0026] 用限制性内切酶kpnl和sacl酶切pT-pflB质粒，回收并纯化长度约为850bp的 PflB基因 DNA片段，再将其与经kpnl和sacl酶切的载体pGPCm(其物理图谱如图2所示） 用DNA连接酶进行连接，将连接产物转入大肠杆菌SMlO ( λ pir)感受态细胞，筛选阳性转化 子，培养，提取质粒，kpnl和sacl酶切验证，得到含有丙酮酸甲酸裂解酶基因 pflB的部分 序列的重组自杀载体pGP-pflB，即将丙酮酸甲酸裂解酶基因 pflB的部分同源序列与自杀 载体pGPCm相连。
[0027] (3)、构建丙酮酸甲酸裂解酶flpB基因被敲除的肺炎克雷伯氏菌突变株
[0028] 将步骤⑵的携带有载体pGP-pflB的大肠杆菌SMlO ( λ pir)(供体菌）和野生型 肺炎克雷伯氏菌（CCTCC M 2011075)(受体菌）进行双亲本杂交，具体方法为：在含有氯霉 素的LB液体培养基中过夜培养混合后的供体菌和受体菌；供体菌和受体菌按数量比3:1比 例混合后，涂布于氯霉素抗性LB平板上，37°C培养12小时；用挑选培养基上的氯霉素抗性 菌落克隆，梯度稀释后再次涂布于氯霉素抗性平板上，37°C培养进行筛选，得到具有氯霉素 (Cm)抗性的重组菌株，即为甲酸代谢途径关键基因一丙酮酸甲酸裂解酶flpB基因被插入 失活的肺炎克雷伯氏菌突变株（敲除丙酮酸甲酸裂解酶fIpB基因的肺炎克雷伯氏菌突变 株）。
[0029] 实施例2 :丙酮酸甲酸裂解酶flpB基因被插入失活的肺炎克雷伯氏菌突变株的活 性检测。
[0030] 对实施例1的丙酮酸甲酸裂解酶flpB基因被插入失活的肺炎克雷伯氏菌突变株 进行丙酮酸甲酸裂解酶的活性检测，以野生型肺炎克雷伯氏菌为对照，具体方法包括以下 步骤：
[0031] (1)将丙酮酸甲酸裂解酶flpB基因被失活的肺炎克雷伯氏菌突变株接种于IOOmL 培养基（每升水中含有甘油20g，胰蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 5g，pH 7.0，120°C灭菌 20min)中，在37°C下振荡培养6-12小时，每2小时取样离心收集菌体；
[0032] (2)用IOOmL磷酸缓冲液（0. 1M，pH7. 5)悬浮洗涤菌体2次；
[0033] (3)用2. 5mL磷酸缓冲液（0· 1M，ρΗ7· 5)悬浮菌体；
[0034] (4)超声波低温4°C破碎菌体；
[0035] (5)3000g低温离心30min，取上清测定酶活，测定方法为用紫外分光光度计测定 反应体系在OD 34tlmi处Imin内的变化值，即Λ A 34(lnm/min。反应体系为：含20mM的丙酮酸钠， 0. 08mMCoA，I mM NAD，2mM DTT，6mM DL 苹果酸钠，I. 4U/mL 柠檬酸合成酶，13. 8u/mL 苹果酸 脱氢酶，在pH为7. 5,终浓度为0. 03M磷酸钾缓冲溶液中进行反应。加入IOuL粗酶液激活 酶促反应。测定IOmin内NADH在340nm处吸光度的变化。酶活力单位定义为：在温度为 30°C，pH为7. 5条件下，每分钟内转化Iu mol丙酮酸所需的酶量定义为1个酶活单位。
[0036] 结果显示，实施例1构建的敲除丙酮酸甲酸裂解酶flpB基因的肺炎克雷伯氏菌突 变株的丙酮酸甲酸裂解酶活性为野生型菌株的1. 5% -3. 6%，表明实施例1构建的敲除丙 酮酸甲酸裂解酶flpB基因的肺炎克雷伯氏菌突变株的丙酮酸甲酸裂解酶失活。
[0037] 实施例3 :利用敲除丙酮酸甲酸裂解酶flpB基因的肺炎克雷伯氏菌突变株发酵生 产1，3_丙二醇
[0038] (1)培养基
[0039] LB培养基（g · Γ1):酵母粉5,蛋白胨10, NaCl 10,琼脂10,调节至pH 7.0,用于 克雷伯氏菌菌种的短期保藏及活化。种子及发酵培养基组成见表1 :
[0040] 表1 :培养基组成
[0041]

【权利要求】
1. 一种敲除甲酸代谢途径基因的工程菌的构建方法，其特征在于，是将克雷伯氏菌属 (Klebsiella)的细菌的丙酮酸甲酸裂解酶flpB基因敲除后获得的工程菌。
2. 根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的克雷伯氏菌属的细菌为肺炎 克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae)。
3. 根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的将克雷伯氏菌的丙酮酸甲酸 裂解酶flpB基因敲除，具体通过以下方法敲除： a、 PCR引物扩增克雷伯氏菌的丙酮酸甲酸裂解酶flpB基因的部分序列，将其与自杀载 体相连，然后再导入杂交供体菌株中； b、 将步骤a获得的携带有丙酮酸甲酸裂解酶flpB基因的部分序列与自杀载体的供体 菌与克雷伯氏菌进行双亲本杂交，利用同源重组、基因插入失活，经筛选后获得丙酮酸甲酸 裂解酶flpB基因被失活的敲除甲酸代谢途径基因的克雷伯氏菌。
4. 根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，当所述的克雷伯氏菌属的细 菌为肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae)时，所述的步骤a的PCR扩增克雷 伯氏菌的丙酮酸甲酸裂解酶flpB基因的部分序列是以肺炎克雷伯氏菌的基因组DNA 为模板，以上游引物 pflB-F :taggtacctgaaagacaaattcgcccag 与下游引物 pflB-R : gagagctccatgcgatccattacttcgt组成的引物对进行PCR扩增后的序列。
5. 根据权利要求3或4所述的构建方法，其特征在于，所述的自杀载体为自杀载体 pGPCm，所述的杂交供体菌为大肠杆菌SM10 ( A pir)。
6. -种按照权利要求1、2、3或4所述的构建方法构建得到的敲除甲酸代谢途径基因的 工程菌。
7. 权利要求6所述的敲除甲酸代谢途径基因的工程菌在生产1，3_丙二醇中的应用。
8. -种按照权利要求5所述的构建方法构建得到的敲除甲酸代谢途径基因的工程菌。
9. 权利要求8所述的敲除甲酸代谢途径基因的工程菌在生产1，3_丙二醇中的应用。
【文档编号】C12R1/22GK104498523SQ201410834675
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年12月26日 优先权日:2014年12月26日
【发明者】周胜, 秦启伟, 黄友华, 俞也频, 尼松伟 申请人:中国科学院南海海洋研究所