强的松和羟氯喹在制备复方抗炎药物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了强的松和羟氯喹在制备复方抗炎药物中的应用，强的松使用总剂量为0.05mg/kg—2mg/kg，羟氯喹使用总剂量为0.83mg/kg—26.64mg/kg。在二甲苯致小鼠耳肿胀实验中，相当于成人正常用量一半的小鼠的强的松等效量的抗炎效果不明显，此剂量的强的松与羟氯喹合用后有明显的抗炎效果。细胞和分子生物学实验表明，羟氯喹与强的松联用能显著抑制LPS诱导的IL-1β和IL-6转录，此种抑制作用均比强的松或羟氯喹单用强。本发明开发了一种新型的复方抗炎药，并为降低强的松治疗的副作用，扩大其应用范围奠定了基础。
【专利说明】强的松和羟氯喹在制备复方抗炎药物中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及医药【技术领域】，具体涉及强的松和羟氯喹在制备复方抗炎药物中的应用。
【背景技术】
[0002]炎症是人体对感染、体内抗原抗体结合以及机械损伤的一种自身反应。通常表现为红、肿、热、痛和功能障碍。它可以是感染引起的感染性炎症，也可以不是由于感染引起的非感染性炎症。适度的炎症反应对人体是有益的，是人体自动的防御反应，而过度的或持续的炎症反应却会引起组织损伤和诱发疾病。
[0003]抗炎药用于治疗组织受到损伤后所发生的反应。抗炎药有两大类:一类是留体抗炎药，即肾上腺皮质所分泌的糖皮质激素氢化可的松及其人工合成的衍生物。另一类是非甾体抗炎药(non-steroid-ant1-1nflammatory drugs),即医疗实践中所指的解热镇痛抗炎药，如阿司匹林、保泰松等。
[0004]强的松等糖皮质激素(Glucocorticoid, GC)是一类具有很强抗炎和免疫抑制作用的药物，对许多非感染性炎症性疾病，尤其是变态反应疾病有良好的治疗作用。糖皮质激素可以纠正炎症反应的失调，在临床中常被用来治疗类风湿关节炎等炎症反应异常引起的疾病，主要是通过其与糖皮质激素受体(GR)的结合，经不同途径发挥作用。传统的观点认为GC的抗炎作用主要是通过与GR结合后增强抗炎基因或抑制炎症基因的转录而实现的。有报道指出，细胞内粘附分子基因的激活是炎症早期导致白细胞在炎症部位聚集的必要步骤。巨噬细胞产生的 α (TNF-α )可激活细胞间粘附分子(ICAM-1)基因的转录，这种激活作用主要由NF-κ B信号旁路经位于人ICAM-1基因启动子-187-178处的单一 NF-κ B结合位点调节，而糖皮质激素对ICAM-1表达的抑制经此NF-JB结合位点而产生。被糖皮质激素抑制后此基因是由GR与NF-JB信号旁路的相互作用调节的。作为抗炎剂，糖皮质激素可以下调某些促炎因子的表达，如I β (IL-Ιβ )，肿瘤坏死因子-β (TNF-β )，干扰素-a (IFN- a )和干扰素-β (IFN-β )等。一些与炎症反应有关的趋化因子，如白介素-8(IL_8)，巨噬细胞炎症蛋白_1β (ΜΙΡ-1β)，巨噬细胞炎症蛋白-3β (ΜΙΡ-3β )，单核细胞趋化蛋白-2(MCP-2)，单核细胞趋化蛋白-3 (MCP-3)，单核细胞趋化蛋白-4 (MCP-4)，胸腺活化调节趋化因子也可以被糖皮质激素下调。而像转化生长因子(TGF-β )，IL-10和IL-10R等可以抑制促炎因子产生的物质，其表达则被上调。但是GC的多效性作用也会产生很多不良反应，如引起儿童生长迟缓，免疫抑制，高血压，抑制伤口修复，骨质疏松以及代谢紊乱
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[0005]轻氯喹(hydr oxychloroquine, HCQ)是4_氨基喹酮类的抗痕药，也是一种独特的抗风湿病药物。羟氯喹能够稳定溶酶体抑制酶的活性，继而抑制由此引起的炎症介质的激活；同时能抑制肥大细胞释放组胺，减少白细胞的趋化性，从而减少其激活及中性粒细胞的吞噬作用。羟氯喹作用机制与氯喹相似，能够降低由脂多糖和植物凝集素刺激产生的前炎性细胞因子IFN-r、TNF-a和IL-6，也能够放大LPS诱导的单核细胞和小神经胶质细胞IL-6的表达。单独给药时，其产生的是诱导而不是抑制神经胶质细胞是通过激活转录因子NF-kB而产生前炎症细胞因子。目前普遍认为，羟氯喹治疗某些自身免疫性疾病的抗炎特点和有效性取决于其趋向溶酶体效应。羟氯喹通过抑制巨噬细胞中TNF-a mRNA合成而抑制TNF-α释放。但是，这样不干扰翻译后修饰或巨噬细胞释放细胞因子。羟氯喹阻断前炎症细胞因子的产生还能够阻碍LPS和大肠杆菌DNA诱导的鼠炎症反应和/或脓毒症的发生，羟氯喹也能够抑制细胞因子释放到全血中，使细菌诱导的炎症相关疾病从中获益。
[0006]溶酶体在真核细胞生物体内广泛存在，是参与体内降解异物、清除衰老和损伤，参与物质代谢和调节细胞免疫等的关键细胞器，对维持细胞稳态具有重要作用。成熟溶酶体内环境为酸性，这种酸性环境的维持，是空泡三磷酸腺酶(V-ATPase)质子泵作用的结果，对机体的大部分功能，如酶底物的消化、囊泡的融合等至关重要。溶酶体的生物合成受转录因子TFEB的调控。碱化溶酶体腔，将抑制其功能。
[0007]二甲苯诱导的小鼠耳肿胀模型造模方法简单，一般在涂抹二甲苯30~60min后达到最大肿胀度，90min后肿胀基本消除。实验中通常选择在给予二甲苯I h左右断颈处死小鼠，用打孔器取双侧耳部同一部位的耳片，称重后计算两耳片的重量差作为检测指标；也可通过测厚仪测量小鼠耳肿胀前后的耳厚度，从而计算出药物对炎症的抑制率。二甲苯模型主要机制是致使某些炎症介质如组胺、激肽和纤维蛋白溶解释放，引起局部血管扩张，毛细管通透性增加，炎症细胞浸润，造成耳部急性渗出性炎症水肿。一般皮质类固醇，如地塞米松、氢化可的松和部分非留体类抗炎药如阿司匹林等，都能有效抑制这种炎症，常作为此模型的阳性药物。
[0008]合理的联合用药，是近年来RA药物治疗的重要进展之一，可降低其长期大剂量应用的不良反应。慢作用抗风湿药如甲氨蝶呤等与糖皮质激素联用是较常用的联合用药方案，已广泛用于临床，然而对部分患者的疗效不甚理想。因此，更有效的联合用药方案的开发一直是RA研究的热点。
【发明内容】
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[0009]本发明的目的在于提供强的松和羟氯喹在制备复方抗炎药物中的应用。
[0010]本发明所述复方抗炎药物中强的松使用总剂量为0.05mg/kg—2mg/kg,轻氯喹使用总剂量为 0.83mg/kg一26.64mg/kg。
[0011]所述的药物中强的松使用总剂量为0.09mg/kg一2mg/kg,轻氯喹使用总剂量为1.66mg/kg —13.32mg/kg。
[0012]所述的药物中强的松使用总剂量为0.09mg/kg一lmg/kg,轻氯喹使用总剂量为3.33mg/kg —6.66mg/kg 。
[0013]所述的药物是片剂、胶囊剂或丸剂。
[0014]所述强的松和羟氯喹复方胶囊与双层片的制备，将强的松、羟氯喹原料药及各辅料过80目筛；将强的松与微晶纤维素及淀粉混合均匀，用80%乙醇溶液制软材，过18目筛制湿颗粒，于50°C烘干，20目筛整粒得强的松颗粒；将羟氯喹与微晶纤维素、羟丙基纤维素混合均匀，用80%乙醇溶液制软材，过18目筛制湿颗粒，于50°C烘干，20目筛整粒得羟氯喹颗粒；将其中一种颗粒用丙烯酸树脂II进行薄膜包衣，按1:1比例称取二种颗粒，加入1%硬脂酸镁混合均匀，填装胶囊，得强的松羟氯喹复方胶囊；将强的松颗粒及羟氯喹颗粒中各拌入1%硬脂酸镁，分别装于多功能旋转式压片机的2个加料斗中，压制成强的松羟氯喹双层片，每片重约0.3g。
[0015]为了避免药物之间的配伍变化，更好地发挥药物的治疗作用，减少其不良反应，本发明将药物强的松与羟氯喹分别制成颗粒，并对其中一种颗粒进行薄膜包衣，然后按比例填装成胶囊剂，或将颗粒经过双层压片机压片制成双层片。胶囊剂可提高药物稳定性，在体内起效快。双层片是两层构造的片剂，每层含有不同的药物，一层可以作为常释部分，另一层作为缓释部分，从而可以避免制剂中不同药物之间的配伍变化，或者达到缓释、控释的效果。双层片可增大载药量，方便患者用药，也适合于工业化生产。
[0016]验证本发明药物的抗炎效果可以采用如下方法:
(1)使用二甲苯致小鼠耳肿胀模型，观察的抗炎效果以及羟氯喹与强的松合用后的抗炎效果。
[0017](2)用细胞培养、Western Blotting等分子生物学方法观察轻氯喹与强的松联用的抗炎作用。
[0018]本发明经实验表明羟氯喹与强的松合用能增强其抗炎作用，能显著抑制LPS诱导的IL-1 β和IL-6转录，此种抑制作用均比强的松或羟氯喹单用强；羟氯喹能协同强的松上调GR的表达；羟氯喹能减少LysoTracker的光密度，碱化溶酶体；抑制溶酶体后，RAW264.7细胞GR的蛋白质含量上调。本发明开发了一种新型的复方抗炎药，并为降低强的松治疗的副作用，扩大其应用范围奠定了基础。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1为羟氯喹与强的松联用能显著抑制LPS诱导的IL-1 β和IL_6转录；
图2为羟氯喹能协同强的松上调GR的表达；
图3为轻氯喹减少LysoTracker的光密度,证实轻氯喹能碱化溶酶体；
图4为抑制溶酶体后，RAW264.7细胞GR的蛋白质含量上调。
【具体实施方式】
[0020]下面结合附图对本
【发明内容】
作进一步的说明。
[0021](1)制备强的松和羟氯喹复方胶囊与双层片，将强的松10g、羟氯喹原料药100g及各辅料过80目筛；将药物强的松与90g微晶纤维素(MCC)及200g淀粉混合均匀，用80%乙醇溶液制软材，过18目筛制湿颗粒，于50°C烘干，20目筛整粒得强的松颗粒约300g;将羟氯喹与50g MCC、150g羟丙基纤维素(HPMC)混合均匀，用80%乙醇溶液制软材，过18目筛制湿颗粒，于50°C烘干，20目筛整粒得羟氯喹颗粒约300g ;将其中一种颗粒用丙烯酸树脂II进行薄膜包衣，按1:1比例称取二种颗粒，加入1%硬脂酸镁混合均匀，填装胶囊，得强的松羟氯喹复方胶囊；将强的松及羟氯喹颗粒中各拌入1%硬脂酸镁，分别装于多功能旋转式压片机的2个加料斗中，压制成强的松羟氯喹双层片，片重约0.3g。
[0022](2)取健康雄性小鼠50只，随机分为空白组、模型组、强的松组(1.94μ g/g)，羟氯喹组(66.7 μ g/g)、强的松和轻氯喹联合用药组(1.94 μ g/g +66.7 μ g/g)共5组。适应性喂养4d后开始灌胃给药，连续给药7d，于7d最后一次给药Ih后，在小鼠右耳均匀涂二甲苯
0.02ml/只，30min后处死小鼠，用打孔器取下左右耳孔，以左右耳片重量之差计算肿胀度，比较各组之间肿胀度的差异。其中，空白组和强的松组在灌胃过程中各死亡一只小鼠。
[0023](3)观察羟氯喹与强的松联用对LPS诱导的小鼠巨噬细胞株RAW264.7的IL-1 β和IL-6转录的影响，参照图1。
[0024](4)用Western Blotting法检测轻氯喹对GR表达影响,参照图2。
[0025](5)使用溶酶体pH敏感探针LysoTracker,观察轻氯喹对LysoTracker的光密度的影响，参照图3。
[0026](6)采用溶酶体抑制剂BafilomycinAl,观察溶酶体抑制剂Bafilomycin Al对RAW264.7细胞GR蛋白质水平的影响，参照图4。
[0027]表1:强的松+羟氯喹联合用药小鼠耳肿胀实验结果(i 土SD)
【权利要求】
1.强的松和羟氯喹在制备复方抗炎药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征是:所述的药物中强的松使用总剂量为0.05mg/kg—2mg/kg,轻氯喹使用总剂量为 0.83mg/kg一26.64mg/kg。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征是:所述的药物中强的松使用总剂量为0.09mg/kg一2mg/kg,轻氯喹使用总剂量为 1.66mg/kg —13.32mg/kg。
4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征是:所述的药物中强的松使用总剂量为0.09mg/kg一 lmg/kg,轻氯喹使用总剂量为 3.33mg/kg 一6.66mg/kg。
5.根据权利要求1或2所述的应用，其特征是:所述的药物是片剂、胶囊剂或丸剂。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征是:所述强的松和羟氯喹复方胶囊与双层片的制备，将强的松、羟氯喹原料药及各辅料过80目筛；将强的松与微晶纤维素及淀粉混合均匀，用80%乙醇溶液制软材，过18目筛制湿颗粒，于50°C烘干，20目筛整粒得强的松颗粒；将羟氯喹与微晶纤维素、羟丙基纤维素混合均匀，用80%乙醇溶液制软材，过18目筛制湿颗粒，于50°C烘干，20目筛整粒得羟氯喹颗粒；将其中一种颗粒用丙烯酸树脂II进行薄膜包衣，按1:1比例称取二种颗粒，加入1%硬脂酸镁混合均匀，填装胶囊，得强的松羟氯喹复方胶囊；将强的松颗粒及羟氯喹颗粒中各拌入1%硬脂酸镁， 分别装于多功能旋转式压片机的2个加料斗中，压制成强的松羟氯喹双层片，每片重约0.3g。
【文档编号】A61K31/4706GK103599109SQ201310602641
【公开日】2014年2月26日 申请日期:2013年11月26日 优先权日:2013年11月26日
【发明者】段小群, 徐华强, 陈毅飞, 易伟, 张可锋, 李云秋, 周越菡, 吴卫, 黎荣, 李军 申请人:桂林医学院