一种胶原基眼角膜支架及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种胶原基眼角膜支架及其制备方法，属于医用生物材料领域。其基质为胶原蛋白，复合原花青素或花青素，使用透析方法添加花青素或原花青素，通过特定工艺制备成的透明、100～800μm厚的多层膜支架，作为角膜移植或修补手术中的人角膜移植供体材料的替代品。该角膜支架材料在角膜移植或修补术中作为上皮细胞或内皮细胞的附着支架，为细胞的生长提供营养支持，通过将花青素或原花青素与胶原蛋白融合，以及通过交联及电泳技术形成的平行多层角膜支架结构，透明度好，机械强度高，保证了其可以完全替代或部分行使人眼角膜的生理功能，得以使患者复明或起到治疗效果。
【专利说明】一种胶原基眼角膜支架及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种胶原基眼角膜支架材料及其制备方法，属于医用生物材料领域。
【背景技术】
[0002] 眼角膜是眼睛前端一层完全透明，呈横椭圆形的薄膜。在眼球屈光中占有重要的 地位，同时还与巩膜组织一起对精细的眼球内容物提供特殊的保护作用。角膜从结构上可 分为5层，中间一层为基质层，占整个角膜厚度的90%，主要由胶原纤维、粘合物质和角化 细胞组成。基质层的胶原纤维排列规则、均匀，成片状，层层紧密相叠，各纤维层又成十字交 叉排列。纤维层排列的这种结构特征有利于光线通过和屈折。许多患者因眼角膜疾病而导 致失明，该类患者复明的可行办法是进行角膜移植手术，但是目前角膜来源均来自于人类 供体捐献。供体来源有限与免疫排斥反应是制约施行角膜移植手术并成功的瓶颈，导致许 多眼角膜疾病患者长期处于等待供体捐献与失明的痛苦当中。因此开发一种来源方便，可 替代供体捐献角膜，免疫原性低的人工眼角膜就变得格外重要与迫切。
[0003] 原花青素和花青素均是强效自由基清除剂。原花青素还具有抗蛋白酶的作用，原 花青素连接在胶原蛋白上后，可以阻止胶原酶和弹性蛋白酶等对胶原蛋白分解作用。同时 原花青素不仅能够帮助胶原蛋白纤维形成交联结构，也可以帮助恢复因受伤和自由基所引 起的过度交联的损害。原花青素还能增强眼底视网膜毛细血管和四肢末梢毛细血管的微循 环，减少眼睛毛细血管出血，保护并改善视力。花青素对弹性蛋白酶和胶原蛋白酶起抑制作 用，能和蛋白质结合防止过氧化，同时还能能缓解眼部疲劳，加速维生素A在视网膜上合成 视紫质，预防近视，增进视力。
[0004] 本发明提供的胶原基眼角膜支架材料，利用仿生的原理，尽可能模拟天然人类眼 角膜的成分与结构特征，以去端肽胶原蛋白为基质，通过透析的方法添加复合原花青素或 花青素，使二者与胶原蛋白充分混合连接在一起，起到对胶原蛋白保护的作用，阻止蛋白酶 对胶原蛋白的分解作用，延长了胶原眼角膜的降解时间，同时还能起到增强眼部血管微循 环，缓解眼部疲劳，保护并改善视力，对角膜移植后的恢复起到一定的促进作用。另外通过 凝胶化、硬质化、电泳等方法形成多层、胶原纤维定向排列规则、机械强度高、透明的薄膜结 构，充分接近于天然人类眼角膜的"基质层的胶原纤维排列规则、均匀，成片状，层层紧密相 叠，各纤维层又成十字交叉排列"结构特征，如此可以更接近于人眼角膜的天然功能。以胶 原蛋白为基质的胶原眼角膜厚100?800 y m，具有多层结构，通过双交联剂原花青素或花 青素、EDC交联后机械强度高，降解周期长，透光性好，两面均利于细胞粘附生长，手术移植 后，可以完全替代或部分行使人眼角膜的生理功能，得以使患者复明或起到治疗效果。
【发明内容】
[0005] 本发明属于医用生物材料领域，涉及一种胶原基眼角膜支架材料及其制备方法。 该胶原基眼角膜支架材料的基质为胶原蛋白。
[0006] 本发明的目的在于提供一种胶原基眼角膜支架材料的制备方法，该支架材料是由 胶原蛋白组成，使用透析方法添加花青素或原花青素，通过特定工艺制备成的透明、100? 800 厚的多层膜支架，作为角膜移植或修补手术中的人角膜移植供体材料的替代品。该 角膜支架材料在角膜移植或修补术中作为上皮细胞或内皮细胞的附着支架，为细胞的生长 提供营养支持，同时在角膜支架成形中添加的DMEM培养基可进一步为细胞生长提供支持。 通过将花青素或原花青素与胶原蛋白融合，以及通过交联及电泳技术形成的平行多层角膜 支架结构，透明度好，机械强度高，保证了其可以完全替代或部分行使人眼角膜的生理功 能，得以使患者复明或起到治疗效果。
[0007] 本发明涉及一种多层、透明的胶原基眼角膜支架材料。
[0008] 本发明尤其涉及一种植入物形式的角膜支架材料。
[0009] -种胶原基眼角膜支架材料，其特征在于基本成分为胶原蛋白，添加复合原花青 素、花青素成分，通过特定工艺制成的多层结构的透明仿生眼角膜支架。
[0010] 一种胶原基眼角膜支架及其制备方法，其特征在于胶原蛋白为酶切去端肽的I型 胶原蛋白、III型胶原蛋白中的一种或两种，来源于牛腱、胎牛皮、猪皮、鱼皮、水母、海参中 的一种或多种。
[0011] 一种胶原基眼角膜支架及其制备方法，其特征在于胶原基眼角膜以多层相互垂直 的胶原纤维层交联叠加而成，膜厚度达100?800 ii m，透明，机械强度高。
[0012] 一种胶原基眼角膜支架材料，其特征在于包含的原花青素成分来源于葡萄籽、蓝 莓、玫瑰花，花青素成分来源于葡萄皮、蓝莓。
[0013] 一种胶原基眼角膜支架材料的制备方法，具体包括以下步骤。
[0014] (1)取胶原蛋白，溶解于0. 5mol/L的醋酸溶液中，配制成终浓度为0. 5?20g/L的 胶原溶液。装入透析袋，置于透析外液中进行透析2天。
[0015] (2)上述透析完的胶原溶液与添加10mm〇l/L HEPES的无酚红DMEM培养液以（1? 10) : (10?1)的比例混合均勻，得溶液A。
[0016] (3)取 1ml 上述溶液 A 铺膜（20*20mm)。
[0017] (4)置于培养箱中，37°C、5%二氧化碳孵育2h，至胶原凝胶化。随后于无菌条件下 进行干燥，至胶原凝胶转变为硬质玻璃状薄膜。
[0018] (5)向上述薄膜上添加2ml 0? 1?10g/L的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基）-碳化 二亚胺（EDC)溶液进行交联，然后倒掉EDC溶液，95%乙醇漂洗2次，纯化水洗涤。
[0019] (6)倒掉纯化水，瞭干，再添加0. 7ml溶液A，交联lh，沿一方向80mV、10mA进行电 泳 1 ?60min。
[0020] (7)重复步骤4。
[0021] (8)重复步骤5、6、7至胶原膜厚度达100?800 iim。每重复一次，电泳方向垂直 于上一循环电泳方向。
[0022] (9)揭膜，C〇60辐照或环氧乙烷灭菌。
[0023] 根据上述步骤（1)所述的透析外液为0.5mol/L的醋酸溶液或添加了原花青素、花 青素两种成分中的一种或两种的〇. 5mol/L的醋酸溶液。
[0024] 根据上述步骤（1)所述的透析外液中的原花青素、花青素的浓度为0. 01?5g/L。
[0025] -种胶原基眼角膜支架及其制备方法，其特征在于制备过程中通过透析添加使原 花青素或花青素与胶原蛋白的连接融合更充分，通过电泳的方法使每层胶原纤维定向排列 规则，同时相邻两层胶原纤维电泳方向垂直保证了胶原纤维层成十字交叉叠加。
[0026] -种胶原基眼角膜支架及其制备方法，其特征在于胶原眼角膜其透光率为 89% _97%，力学强度为 10-40MPa。
[0027] -种胶原基眼角膜支架及其制备方法，其特征在于胶原眼角膜支架可以作为一种 医疗器械应用于包括眼角膜疾病在内的人体各种膜类疾病的治疗，也可以作为提供细胞粘 附生长并起支持保护作用的组织工程支架材料使用，或用以培养细胞。
【具体实施方式】
[0028] 实施例1
[0029] (1)取胶原蛋白，溶解于0.5mol/L的醋酸溶液中，配制成终浓度为0.5g/L的胶原 溶液。装入透析袋，置于0. 5mol/L的醋酸溶液中进行透析2天。
[0030] (2)上述透析完的胶原溶液与添加1 Ommo 1 /L HEPES的无酚红DMEM培养液以 1 : 10的比例混合均匀，得溶液A。
[0031] (3)取 1ml 上述溶液 A 铺膜（20*20mm)。
[0032] (4)置于培养箱中，37°C、5%二氧化碳孵育2h，至胶原凝胶化。随后于无菌条件下 进行干燥，至胶原凝胶转变为硬质玻璃状薄膜。
[0033] (5)向上述薄膜上添加2ml0?lg/L的1-乙基-3-(3_二甲基氨丙基）_碳化二亚 胺（EDC)溶液进行交联，然后倒掉EDC溶液，95%乙醇漂洗2次，纯化水洗涤。
[0034] (6)倒掉纯化水，晾干，再添加0. 7ml溶液A，交联2h，沿一方向80mV、10mA进行电 泳 5min。
[0035] (7)重复步骤4。
[0036] (8)重复步骤5、6、7,电泳方向垂直于上一次电泳方向。
[0037] (9)揭膜，C〇60 辐照。
[0038] 实施例2
[0039] (1)取胶原蛋白，溶解于0. 5mol/L的醋酸溶液中，配制成终浓度为5g/L的胶原溶 液。装入透析袋，置于透析外液中进行透析2天。
[0040] (2)上述透析完的胶原溶液与添加10mmol/L HEPES的无酚红DMEM培养液以5 : 5 的比例混合均匀，得溶液A。
[0041] (3)取 1ml 上述溶液 A 铺膜（20*20mm)。
[0042] (4)置于培养箱中，37°C、5%二氧化碳孵育2h，至胶原凝胶化。随后于无菌条件下 进行干燥，至胶原凝胶转变为硬质玻璃状薄膜。
[0043] (5)向上述薄膜上添加2ml5g/L的1-乙基_3-(3-二甲基氨丙基）-碳化二亚胺 (EDC)溶液进行交联，然后倒掉EDC溶液，95 %乙醇漂洗2次，纯化水洗涤。
[0044] (6)倒掉纯化水，瞭干，再添加0? 7ml溶液A，交联2h，沿一方向80mV、10mA进行电 泳 30min。
[0045] (7)重复步骤4。
[0046] (8)重复步骤5、6、7,20次。每重复一次，电泳方向垂直于上一循环电泳方向。
[0047] (9)揭膜，C〇60 辐照。
[0048] 实施例3
[0049] (1)取胶原蛋白，溶解于0. 5mol/L的醋酸溶液中，配制成终浓度为lOg/L的胶原溶 液。装入透析袋，置于透析外液中进行透析2天。
[0050] (2)上述透析完的胶原溶液与添加1 Ommo 1 /L HEPES的无酚红DMEM培养液以 10 : 1的比例混合均匀，得溶液A。
[0051] (3)取 1ml 上述溶液 A 铺膜（20*20mm)。
[0052] (4)置于培养箱中，37°C、5%二氧化碳孵育2h，至胶原凝胶化。随后于无菌条件下 进行干燥，至胶原凝胶转变为硬质玻璃状薄膜。
[0053] (5)向上述薄膜上添加2ml10g/L的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基）_碳化二亚胺 (EDC)溶液进行交联，然后倒掉EDC溶液，95 %乙醇漂洗2次，纯化水洗涤。
[0054] (6)倒掉纯化水，瞭干,再添加0. 7ml溶液A，交联2h，沿一方向80mV、10mA进行电 泳 60min。
[0055] (7)重复步骤4。
[0056] (8)重复步骤5、6、7,50次。每重复一次，电泳方向垂直于上一循环电泳方向。
[0057] (9)揭膜，C〇60 辐照。
[0058] 实施例4细胞毒性试验 [0059](一）细胞培养
[0060] 小鼠胚胎成纤维细胞系（313410：)应用01^11培养基（含1%双抗和10%小牛血 清），37°C、5%二氧化碳细胞培养箱中培养。
[0061](二）MTT 测试
[0062] 吸取等量的细胞悬浮液，加入到胶原基眼角膜直接接触的24孔细胞培养板内。阴 性对照加入PBS，阳性对照加入DMS0(终浓度为10% )，空白组为只有细胞培养基。培养24 小时之后进行MTT测试。以酶联免疫检测仪0D 570nm处测量各孔的吸光值（0D值）。按下 式计算细胞抑制率：细胞抑制率=(1-处理组吸光度值/空白组吸光度值）X 100%。
[0063] MTT 测试：
【权利要求】
1. 一种胶原基眼角膜支架及其制备方法，其特征在于该胶原眼角膜支架基本成分为胶 原蛋白，添加复合原花青素、花青素成分。
2. 根据权利要求1所述的一种胶原基眼角膜支架及其制备方法，其特征在于所述胶原 蛋白为酶切去端肽的I型胶原蛋白、III型胶原蛋白中的一种或两种，来源于牛腱、胎牛皮、 猪皮、鱼皮、水母、海参中的一种或多种。
3. 根据权利要求1所述的一种胶原基眼角膜支架及其制备方法，其特征在于该胶原基 眼角膜以多层相互垂直的胶原纤维层交联叠加而成，膜厚度达100?800 y m，透明，机械强 度高。
4. 根据权利要求1所述的一种胶原基眼角膜支架及其制备方法，其特征在于制备方法 包括以下步骤： (1) 取胶原蛋白，溶解于0. 5mol/L的醋酸溶液中，配制成终浓度为0. 5?20g/L的胶原 溶液。装入透析袋，置于透析外液中进行透析2天； (2) 上述透析完的胶原溶液与添加10mm〇l/L HEPES的无酚红DMEM培养液以（1? 10) : (10?1)的比例混合均勻，得溶液A ; (3) 取lml上述溶液A铺膜（20*20mm); (4) 置于培养箱中，37°C、5%二氧化碳孵育2h，至胶原凝胶化。随后于无菌条件下进行 干燥，至胶原凝胶转变为硬质玻璃状薄膜； (5) 向上述薄膜上添加2ml 0. 1?10g/L的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基）-碳化二亚 胺（EDC)溶液进行交联，然后倒掉EDC溶液，95 %乙醇漂洗2次，纯化水洗涤； (6) 倒掉纯化水，瞭干，再添加0. 7ml溶液A，交联lh，沿一方向80mV、10mA进行电泳1? 60min〇 (7) 重复步骤4 ; (8) 重复步骤5、6、7至胶原膜厚度达100?800 ii m。每重复一次，电泳方向垂直于上 一循环电泳方向； (9) 揭膜，C〇60辐照或环氧乙烷灭菌。
5. 根据权利要求4所述的透析外液为0. 5mol/L的醋酸溶液或添加了原花青素、花青素 两种成分中的一种或两种的〇. 5mol/L的醋酸溶液。
6. 根据权利要求4所述的透析外液中的原花青素、花青素的浓度为0. 01?5g/L。
7. 根据权利要求4所述的一种胶原基眼角膜支架及其制备方法，其特征在于制备过程 中通过透析添加使原花青素或花青素与胶原蛋白的连接融合更充分，通过电泳的方法使每 层胶原纤维定向排列规则，同时相邻两层胶原纤维电泳方向垂直保证了胶原纤维层成十字 交叉叠加。
8. 根据权利要求1或4所述的一种胶原基眼角膜支架及其制备方法，其特征在于胶原 眼角膜其透光率为89% -97%，力学强度为10-40MPa。
9. 根据权利要求1所述的一种胶原基眼角膜支架及其制备方法，其特征在于胶原眼 角膜支架可以作为一种医疗器械应用于包括眼角膜疾病在内的人体各种膜类疾病的治疗， 也可以作为提供细胞粘附生长并起支持保护作用的组织工程支架材料使用，或用以培养细 胞。
【文档编号】A61L27/50GK104383599SQ201410662542
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年11月5日 优先权日:2014年11月5日
【发明者】张奎强, 毕宏伟 申请人:天津市赛瑞生物技术有限公司