1-杂环取代苄基吡啶酮类化合物在制备治疗糖尿病肾病药物中的应用的制作方法

本发明属于化合物的新用途，具体是1-杂环取代苄基吡啶酮类化合物的新用途。
背景技术：
：糖尿病肾病(diabeticnephropathy，DN)一般指糖尿病肾小球硬化症，是由于糖尿病糖代谢异常所致的肾小球硬化，是糖尿病最常见的微血管并发症之一。糖尿病肾病的临床表现为蛋白尿进行性增加，肾小球滤过率(glomerularfiltrationrate,GFR)进行性下降。糖尿病肾病的基本病理改变是细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)增多导致的肾脏的纤维化(包括肾小球硬化和间质纤维化)。增多的ECM成分包括I型、IV型胶原蛋白、纤维连接蛋白(fibronection,FN)、层粘连蛋白等。早期主要表现为肾小球肥大；中期主要表现为基底膜增厚，系膜基质增生，其特征性病变是结节型肾小球硬化；晚期病变进展，表现为弥漫性肾小球硬化，并累及肾小管—间质纤维化。糖尿病肾病主要临床表现为：(1)蛋白尿：是糖尿病肾病的第一个临床表现，初为间断性，逐渐发展为持续微量白蛋白尿，最后发展为大量蛋白尿。(2)水肿：糖尿病肾病发生水肿时多由于大量蛋白尿所致，此阶段表明已发展至糖尿病肾病后期，多伴有GFR下降等肾功能减退的临床表现，提示预后不良。(3)高血压：出现较晚，到糖尿病肾病阶段时血压多升高，可能与糖尿病肾脏阻力血管的结构和功能的改变有密切关系，此外，水钠潴留也是高血压的因素之一。(4)贫血：有明显氮质血症的糖尿病性肾病患者，可有轻～中度的贫血。(5)肾功能异常：从蛋白尿的出现到肾功能异常，临床表现为血肌酐、尿素氮、尿酸增高。目前糖尿病肾病的主要治疗手段包括：1、控制危险因素：如降血糖、降血压、饮食治疗等，2、抗肾脏纤维化药物，包括降压药物血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)或血管紧张素受体拮抗剂(ARB)，该类药物具有改善肾内血流动力学、减少尿蛋白排出，抑制系膜细胞、成纤维细胞和巨噬细胞活性，改善滤过 膜通透性等药理作用。但ACEI和ARB类药物仅能应用于肌酐正常或肌酐轻度增高的患者(肌酐<265umol/L)。在研的抗肾脏纤维化药物有：吡非尼酮、BMP7、HGF、抗TGF-β抗体、醛固酮受体拮抗剂、中药、基因治疗等，但这些药物有的仍处于试验阶段，有的没有进入临床大规模应用，其疗效及安全性有待进一步评估。综上所述，目前缺乏治疗糖尿病肾病的有效药物。因此，针对上述疾病的治疗药物的开发一直是药学界的棘手问题。人们进行了许多的探索，但对寻找到对前述疾病有效的药物仍然成效甚微。吡啶酮类化合物结构具有多样性，生理活性广泛。结构的细微改变往往能够产生不可意料的效果。专利DE2362958公开了一类式I结构的化合物，具有镇痛、解热、排尿酸的作用。其中，基团A对活性没有影响，基团R3-R6对活性有影响。其中，特别展示了化合物1(即：吡非尼酮)的结构。专利EP90301607.9公开了化合物1具有抗肺纤维化的作用。有文献(JAmSocNephrol22:1144–1151,2011)也报道了化合物1的抗糖尿病肾病作用。中国专利CN102149683A(WO2010135976A1)1-取代苄基-5-三氟甲基-2-(1H)吡啶酮化合物，以及公开了该类化合物具有抗纤维化的作用。1-取代苄基-5-三氟甲基-2-(1H)吡啶酮化合物，具有式(II)的结构。其中R1～R4，R12选自：H,CN,NO2,羟基,氨基,卤原子,C1-C6的烷氧基,NR10R11,OR13,C(O)R14,O-C(O)R14R15,C1-C6的烷基,C1-C6的卤烷基,C2-C6的烯基, 羧基,羧酸酯；其中R1～R4，R12不同时为H,R14、R15选自C1-C6的烷基,在NR10R11和OR13的结构中，R10和R11选自：H、C1-C6羟烷基，酯化的C1-C6羟烷基，C1-C6烷氧基烷基，或结构式III,且R10和R11不同时为H；OR13选自：羟烷基，烷氧基烷基；结构式III中，R5选自：H，C1-C6的烷基,C1-C6的卤烷基,C1-C6羟烷基,C2-C6的烯基；R6～R9选自：H，C1-C6的烷氧基，＝O，C1-C4的烷基，C1-C4的卤烷基，C1-C4羟烷基，C2-C4的烯基；X选自N,CH2；Y选自N,O,CH；n为：1～6；及其药学上可用的盐。上述化合物中，当R10和R11选自的结构式为结构式III时，简称为1-杂环取代苄基吡啶酮类化合物。中国专利CN102149682A(WO2010135972)公开了一种1-取代芳基-5-三氟甲基-2-(1H)吡啶酮类化合物及其药学上可用的盐，以及所述化合物及其盐的制备方法和它们在制备治疗纤维化药物中的用途。其中1-取代苯基-5-三氟甲基-2-(1H)吡啶酮化合物，具有式(IV)的结构，其中，R1～R4，R12选自：H，CN，NO2，羟基，氨基，卤原子，C1-C6的烷氧基，NR10R11，OR13，C(O)R14，O-C(O)R14R15，C1-C6的烷基，C1-C6的卤烷基，C2-C6的烯基，羧基，羧酸酯；其中，R14、R15为：C1-C6的烷基；R10和R11选自：H，C1-C6羟烷基，酯化的C1-C6羟 烷基，C1-C6烷氧基烷基，或结构式V；且R1～R4，R12至少一个为NR10R11或OR13，OR13为C1-C6羟烷基，C1-C6烷氧基烷基；R10和R11不同时为H；结构式V中，R5选自：H，C1-C6的烷基，C1-C6的卤烷基，C1-C6羟烷基，酯化的C1-C6羟烷基，C2-C6的烯基；R6～R9选自：H，C1-C6的烷氧基，＝O，C1-C4的烷基，C1-C4的卤烷基，C1-C4羟烷基，C2-C4的烯基；X选自N，CH2；Y选自N，O，C；n为：1～6；及其药学上可用的盐。本发明在于研究1-杂环取代苄基吡啶酮类化合物的新用途。技术实现要素：本发明的目的在于提供1-杂环取代苄基吡啶酮类化合物的新用途。根据本发明的实施例，发现抗糖尿病肾病的活性与抗纤维化的活性是不一致的，与化合物的毒性也是不一致的。本领域的技术人员不能从化合物的抗纤维化活性推断出其抗糖尿病肾病和毒性的大小。也就是说，即便是有很强抗纤维化活性的药物也不能预见其在治疗糖尿病肾病中的效果是一样的好，而且其毒性也不可预见。本发明公开了1-杂环取代苄基吡啶酮类化合物在制备治疗糖尿病肾病药物中的应用，所述1-杂环取代苄基吡啶酮类化合物的结构式为：根据本发明的具体实施方式证明，1-杂环取代苄基吡啶酮类化合物能减轻糖尿病肾病肾小球硬化指数，降低24小时尿白蛋白，以上结果表明1-杂环取代苄基吡啶酮类化合物能够明显减轻肾小球硬化病变。说明该类化合物对糖尿病肾病具 有治疗作用，也就是说用1-杂环取代苄基吡啶酮类化合物制备的药物适用于治疗糖尿病肾病。根据本发明的实施方式证明，即使化合物的抗纤维化活性相当，但它们的抗糖尿病肾病作用差别是巨大的，毒性也是不同的。在本发明的研究中，发现了一个抗糖尿病肾病活性高，但是毒性低的化合物(化合物A)，有必要保护其在制备治疗糖尿病肾病药物中的应用。附图说明图1各组小鼠肾组织PAS染色(×400)图：db/m组：正常对照组模型组：db/db小鼠组，化合物A组：db/db小鼠加化合物A40mg/kg.d治疗组，化合物C组：db/db小鼠加化合物C40mg/kg.d治疗组，PFD组：db/db小鼠加吡非尼酮250mg/kg.d治疗组；图2UUO大鼠14天各组HE染色(×100)图：假手术组：正常对照组模型组：UUO大鼠组，化合物A组：UUO大鼠加化合物A12.5mg/kg治疗组，化合物C组：UUO大鼠加化合物C15mg/kg治疗组，化合物B组：UUO大鼠加化合物B15mg/kg治疗组，化合物D组：UUO大鼠加化合物D12.5mg/kg治疗组，PFD组：UUO大鼠加PFD250mg/kg治疗组；图3UUO大鼠14天各组Masson染色(×100)图：假手术组：正常对照组模型组：UUO大鼠组，化合物A组：UUO大鼠加化合物A12.5mg/kg治疗组，化合物B组：UUO大鼠加化合物B15mg/kg治疗组，化合物C组：UUO大鼠加化合物C15mg/kg治疗组，化合物D组：UUO大鼠加化合物D12.5mg/kg治疗组，PFD组：UUO大鼠加PFD250mg/kg治疗组。具体实施方式下面结合实施例对本发明做进一步的说明。本发明的实施例所述1-杂环取代苄基吡啶酮类化合物有以下两个化合物：化合物A，结构式如下：此外，为了说明化合物A和化合物B抗糖尿病肾病活性与毒性的不可预料性，本发明也引用了化合物C和化合物D的相关数据在实施例中。实施例1:化合物A、化合物C治疗db/db小鼠糖尿病肾病作用的研究1、实验方法：47只小鼠(全雄鼠)，8周龄，其中db/db小鼠37只、db/m小鼠(正常对照)10只。采用完全随机的方法，将10只DBM小鼠为DBM对照组。另37只db/db小鼠分为模型组、化合物A组、化合物C组、吡非尼酮(PFD)组(各组分别13、8、8、8只)，全雄鼠。于实验前对db/m组、模型组、化合物A组、化合物C组、PFD组小鼠留取24小时尿液，用ELISA法测尿微量白蛋白，判断小鼠糖尿病肾病的成模情况。治疗前，予各组小鼠称体重、尾静脉采血测血糖，8周龄时开始每天1次给予相应药物灌胃：db/m组、模型组小鼠予以0.5％CMC-Na灌胃；化合物A治疗组给予化合物A40mg/kg.d、PFD治疗组给予PFD250mg/kg.d灌胃、化合物C治疗组给予化合物C40mg/kg.d、PFD治疗组给予PFD250mg/kg.d灌胃。实验期间每2-4天一次称体重，每2周一次尾静脉采血测血糖。于小鼠24周龄时，以颈椎脱臼法处死全部小鼠。处死前再次以相同方法留取24小时尿液，测定尿白蛋白，称体重；于眶静脉取血离心后取上清检测血糖、尿白蛋白/肌酐比值(ACR)；留取各组小鼠肾脏组织，称肾重，制成肾组织切片，行病理PAS染色及评分。2、实验结果实验结束时，37只小鼠共死亡13只，分别是模型组4只、化合物A组2只、化合物C组2只、PFD组5只。至处死前，37只小鼠共存活24只，各组小鼠一般情况好，毛发黑有光泽，活动情况正常。2.1治疗前后血糖结果(见表1)各组小鼠治疗前后血糖结果均为尾静脉取血的血糖。各组小鼠治疗前血糖：与DBM组比较，模型组、PFD组、化合物A组、化合物C组血糖水平明显升高，差别有统计学意义；与模型组相比，PFD组、化合物A组、化合物C组血糖无统计学差异。各组小鼠治疗后血糖：与DBM组比较，模型组、PFD组、化合物A、化合物C组组血糖水平明显升高，差别有统计学意义；与模型组相比，PFD组、化合物A组、化合物C组血糖无统计学差异。表1各组小鼠治疗前后血糖水平组别n治疗前血糖(mmol/L)治疗后血糖(mmol/L)DBM组1011.12±1.589.20±1.73模型组924.34±3.14☆☆☆38.92±10.57☆☆☆化合物A组624.07±3.06☆☆☆43.45±4.95☆☆☆化合物C组627.28±4.43☆☆☆46.95±2.95☆☆☆吡非尼酮组323.87±2.20☆☆☆46.28±1.85☆☆☆与DBM组比较，☆P<0.05，☆☆P<0.01，☆☆☆P<0.001；2.2治疗前后24小时尿白蛋白、尿白蛋白/肌酐比值(ACR)结果(见表2)治疗前：(1)与DBM组相比，模型组、PFD组、化合物A组、化合物C组、24小时尿白蛋白、ACR明显升高；(2)与模型组相比，PFD组、化合物A组、化合物C组24小时尿白蛋白、ACR均无明显差异。治疗后：(1)与DBM组相比，模型组、PFD组、化合物A组24小时尿白蛋白、ACR明显升高；(2)化合物A组、化合物C组、PFD组与模型组比较，24小时尿白蛋白、ACR均明显下降，差别有统计学意义；(3)化合物A组与PFD组比较，化合物A组24小时尿白蛋白和ACR下降幅度较大，差别有统计学意义；(4)化合物C组与PFD组比较，化合物C组24小时尿白蛋白和ACR下降幅度无统计学意义；表2各组小鼠治疗前后尿白蛋白、ACR与DBM组比较，☆P<0.05，☆☆P<0.01，☆☆☆P<0.001；与模型组比较，△P<0.05，△△P<0.01，△△△P<0.001；与PFD组比较，○P<0.05，○○P<0.01，○○○P<0.001；2.3病理检查结果2.3.1PAS染色普通光学显微镜400倍镜下观察肾组织PAS染色切片，结果发现，DBM病理对照组及DBM组小鼠肾组织均无明显病理改变；模型组肾小球肥大，基底膜增厚，系膜区增宽，包括系膜细胞和系膜基质增多；与模型组相比，经过化合物A、化合物C、PFD治疗后的各组小鼠上述病变减轻(图1)。2.3.2肾小球硬化评分(GSI)结果。(见表3)实验过程中模型组小鼠的GSI明显高于DBM组；各治疗组与模型组相比，GSI均有明显下降。(1)与DBM组比较，模型组、PFD组、化合物A组、化合物C组GSI明显升高，差别有统计学意义；(2)与模型组比较，化合物A组、化合物C组、PFD组GSI明显下降，差别有统计学意义；(3)与PFD组比较，化合物A组GSI明显下降，差别有统计学意义；(4)与PFD组比较，化合物C组GSI无统计学意义；表3各组小鼠肾小球硬化指数评分组别nGSI*DBM组100.20±0.02模型组70.78±0.04☆☆☆化合物A组60.25±0.03△△△○化合物C组60.33±0.08△△△吡非尼酮组30.35±0.10△△△注：与DBM组比较，☆P<0.05，☆☆P<0.01，☆☆☆P<0.001；与模型组比较，△P<0.05，△△P<0.01，△△△P<0.001；与PFD组比较，○P<0.05，○○P<0.01，○○○P<0.001；3、实验结论：40mg/kg.d化合物A、40mg/kg.d化合物C治疗8周龄db/db小鼠的糖尿病肾病至24周龄能明显改善db/db小鼠肾小球硬化，化合物A抗db/db小鼠肾小球硬化疗效优于PFD和化合物C。实施例2:化合物A、化合物B、化合物C、化合物D抗肾纤维化的动物实验研究1、实验方法制备梗阻性肾纤维化实验动物模型，观察化合物A、化合物B、化合物C、化合物D抗肾纤维化的疗效。清洁级Sprague-Dawley大鼠(7-8周龄、雄性、体重180g200g),共41只，随机分为:假手术组(n＝9)，模型组(n＝9)，化合物A12.5mg/kg治疗组(n＝6)，化合物B15mg/kg治疗组(n＝3)，化合物C15mg/kg治疗组(n＝3)，化合物D12.5mg/kg治疗组(n＝6)，PFD250mg/kg治疗组(n＝5)除假手术组大鼠外，其他组大鼠均在无菌条件下行左侧输尿管结扎术。术前器械消毒，假手术组大鼠除不结扎、不剪断输尿管外，所有处理同前。化合物A12.5mg/kg治疗组，化合物B15mg/kg治疗组，化合物C15mg/kg治疗组，化合物D12.5mg/kg治疗组和PFD250mg/kg治疗组于手术前24h灌胃给相应剂量药物至手术后14天，模型组和假手术组以等量生理盐水灌胃至手术后14天。各组大鼠分别于术后第14天处死，留取左侧梗阻肾标本，行HE染色检查。肾组织肾小管间质损伤评分标准:参照:RadfordMGJr,DonadioJVJr,BergstralhEJ,etal.PredictingrenaloutcomeinIgAnephropathy.JAmSocNephrol1997,8(2):199-207.取肾组织HE染色切片，低倍镜下单盲依序观察左上、右上、左下、右下、中间5个肾小管间质视野，按肾间质损伤8项指标评分:肾小管上皮细胞空泡变性、肾小管扩张、肾小管萎缩、红细胞管型、蛋白管型、间质水肿、间质纤维化、间质细胞浸润，计算其均值，作为该标本的肾小管间质损伤指数。2、实验结果：(1)光镜下假手术组大鼠肾组织未见明显病变，肾小球、近端小管、远端小管和集合管的大小、形态正常，未见小管扩张，间质水肿、炎症细胞浸润及间质纤维化改变。模型组UUO术后第14天，梗阻侧肾组织皮质变薄，肾小管上皮细胞空泡变性及炎性细胞浸润明显，部分小管萎缩消失，远曲小管、集合管扩张呈囊状；部分近端小管保存尚好，间质可见成纤维细胞增殖和纤维化。与模型组相比，化合物B15mg/kg治疗组，化合物A12.5mg/kg治疗组，化合物C15mg/kg治疗组，化合物D12.5mg/kg治疗组和PFD250mg/kg治疗组术后14天，梗阻侧肾组织炎性细胞浸润明显减轻，肾小管上皮细胞变性、萎缩及间质纤维化程度有所减轻。与PFD组相比，化合物A15mg/kg组HE染色肾间质损伤评分较高，化合物D12.5mg/kg组MASSON染色肾间质损伤病理评分较低，有统计学意义。其余各治疗组肾间质损伤程度与PFD组无明显差异(表4，表5，图2,图3)。表4各组大鼠HE染色肾间质损伤病理评分结果注：与假手术组比较，☆p＜0.05，☆☆p＜0.01；☆☆☆p＜0.001；与模型组比较，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001；与PFD组比较，◆p＜0.05，◆◆p＜0.01；◆◆◆p＜0.001；表5各组大鼠MASSON染色肾间质损伤病理评分结果注：与假手术组比较，☆p＜0.05，☆☆p＜0.01；☆☆☆p＜0.001；与模型组比较，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001；与PFD组比较，◆p＜0.05，◆◆p＜0.01；◆◆◆p＜0.001；4、实验结论：根据HE染色肾间质损伤评分结果，化合物A、化合物B、化合物C、化合物D化合物均能有效防治肾纤维化。实施例3化合物A、B、C、D的急性毒性每个化合物的急性毒性实验方法如下：试验选用SPF级、4周龄左右KM小鼠60只，310×230×157mm鼠笼5只/笼饲养密度饲养。饲养室温度：20-25℃，湿度：40-70％，换气次数：10-15次/小时，12h/12h交替照明。检疫和适应环境饲养3天后分组、开始给药。本试验设定实验化合物溶液5个给药组和蒸馏水空白组，每组10只动 物，雌雄各半，灌服给药，1次/日，通过2周的笼旁观察及体重称量记录。表6各个化合物的半数致死量数据：化合物LD50(mg/kg)化合物A>2000化合物B669.8化合物C1168化合物D316.0当前第1页1 2 3