用于神经束再生的生物混合物的制作方法

说明

发明领域。

本发明涉及用于再生神经束的生物混合物(biohybrid)，其包含用于所述束再生的管状混合支架，以及涉及所述管状支架。

发明背景

影响中枢神经系统的各种疾病，诸如帕金森病，目前用缓解症状和减缓变性的药物治疗。然而，对于它们中的许多来说，并不存在构成真正且有效的治疗的疗法。

一种仍在临床试验中的解决方案是由原位移植的细胞组成的；然而，存在存活率低并且有效性低。

在周围神经系统中，还有其它类似于神经再生管道(duct)的解决方案。

在形成包括其它聚合物诸如聚-l-乳酸(plla)和其中schwann细胞生长并且其中掺入各种生长因子、神经营养因子等的多孔管中使用透明质酸(ha)是现有技术中已知的。

文章“newartificialnerveductsmadewithphotocrosslinkedhyaluronicacidforperipheralnerve20regeneration”，sakaiy1,matsuyamay,takahashik,satot,hattorit,nakashimas,ishiguron.biomedmatereng.2007;17(3):191-7描述了基于光网状(photoreticulated)ha的管状多孔结构，其直径为1.2mm和孔径为50μm，schwann细胞在其上生长。然而，该文献中描述的多孔管状结构与本发明不同之处在于它不由三层组成。此外，该文章中使用的试剂的组成是用肉桂酸改性的透明质酸并与本发明的组成不同，本发明是未改性的透明质酸，其随后通过与例如二乙烯基砜反应而交联，以形成hylan。组成的这种差异影响合成材料的物理化学行为、降解速率和生物反应，因此所述管道和本发明的管道是不可比的。

另一篇题为“bectrospunadherent-antiadherentbilayeredmembranesbasedoncross-linkedhyaluronicforadvancedtissueengineeringapplications”的文章，arnal-pastorm,martínezramosc.,

pérezgarnésm,monleónpradasm,vallésllucha.matersciengcmaterbiolappl.2013oct；33(7):4086-93涉及其中一层为ha，另一层为聚乳酸的双层结构。然而，这些不是管状结构，并且没有提及它们的孔隙度。

wo2006077085公开了衍生自自交联ha和神经元干细胞的生物材料，其用于再生周围神经系统和脊髓中的损伤。根据该文献的权利要求5，生物材料可以是具有多孔壁(wall)的管的形式。然而，在wo2006077085的情况下，不存在三层结构，其中它们中的每一个中具有不同孔隙度。该生物材料通过以下方法获得：a)用包被溶液处理ha衍生物，其促进神经干细胞粘附、神经突生长和分化；b)使分离的神经干细胞与前述步骤的ha衍生物接触，和c)在选自β-fgf(基本的成纤维细胞生长因子)、cntf(睫状神经营养因子)、bdnf(脑源性神经营养因子)和gdnf(胶质细胞衍生神经营养因子)或其混合物的神经营养生长因子存在下培养和扩增粘附的细胞。

专利申请us2003060871涉及一种生物稳定和生物可吸收的管状结构，其可以具有最多三层，其中一层总是膨胀的ptfe，并且另外两层可以是聚乳酸和ha。它是用于释放药物的支撑管(stent)。不同的层可能具有不同的孔径。然而并不是说ha是网状的。因此，它与本发明的管状支架也具有本质的差异。

目前没有产品允许以受保护的方式移植和运输脑中的神经细胞，以便在中枢神经系统疾病，特别是帕金森病中再生黑质纹状体束。本发明提供的可生物降解和生物相容的管状支架可以解决这个问题。

基于本发明的管道的策略以如下方式克服了现有技术的缺陷，其将允许用多巴胺能细胞重新弥补黑质，并保护和引导轴突延伸的过程，直到其到达与纹状体重新连接并以这种方式再生黑质纹状体束。

本发明提出的解决方案也可以用于周围神经系统中的神经再生。

本发明提供的解决方案具有以下有利性质：

a)管道壁允许必要分子的自由流动以用于细胞的发育和存活。

b)它保护移植细胞在意图再生并防止侵略性细胞到达其内部的地方。

c)它是可生物降解的并从身体完全消失而不需要新的外科手术干预。它消失的速度也可以通过合成过程中一些参数的微小变化来广泛地调节。

d)限制或抑制有机体内任何装置移植固有的对异物的反应影响。

e)它可以充当药物载体，使其在受损区域逐渐释放。

发明描述

在本说明书中，下面给出的术语具有以下含义：

-“混合管状支架”、“管状支架”、“混合管状管道”和“管状管道”可互换使用。

本发明涉及透明质酸的管状支架或混合管状管道，其中将聚-l-乳酸(plla)纤维引入到内腔中，并且可以用感兴趣的细胞通常诸如schwann细胞或胶质细胞和/或神经的神经元或前体体外接种，使得可以评价其性能。

管道的管状结构应能够隔离和保护在其内腔中接种的细胞免受周围的外部不利微环境影响，由于其多微孔形态，允许氧和营养物质的交换以及废物的处理。与此交换任务同时，多微孔结构充当大分子或细胞的屏障。

因此，本发明涉及可降解和生物相容的可植入管状支架，其特征在于其包含三个不同孔隙度的层：内层a)、中间层b)和外层c)，其间具有不间断的连接，并且所有三层由基于交联透明质酸的相同多孔水凝胶组成。

根据管状支架的具体实施方案：

-内层a)具有小于约1μm，优选约0.1至0.4μm，更优选约0.2μm的微孔，

-中间层b)具有大于内层和外层的孔的互连孔，其具有蜂窝结构，尺寸为约10至70μm，优选为约20至50μm，以及

-外层c)具有小于约12μm，优选约1至12，更优选约1至10μm的孔。

根据具体应用的需要，本发明的混合管状管道或管状支架可以具有高至5cm的长度。该管道或混合管状支架具有直径为1至0.20mm的位于中心的内部通道或内腔。中心通道在湿条件下应足够宽以允许在其中插入plla纤维。

本发明还涉及一种生物混合物，其定义为包含如上所定义的管状支架加上其中所含的产物的组件(assembly)，所述产物可以是例如细胞，它可以是神经营养因子等，或任何组合。这样的生物混合物可以在其内部携带schwann细胞或嗅觉围被胶质细胞(olfactoryenvelopingglial)，或通常是胶质细胞和神经细胞。

根据具体实施方案，生物混合物还包含其内腔中的生长因子和/或药物。生长因子是例如神经营养因子ngf、bdnf或gdnf。药物是例如多巴胺能药，诸如左旋多巴。

优选地，在嵌入凝胶或微粒的内腔中发现生长因子和/或药物。凝胶可以是例如可注射和原位可胶凝的肽或水凝胶的溶液，诸如纤维蛋白、胶原蛋白或琼脂糖。微粒可以具有亲水特征诸如明胶，或疏水性如plla，或交联明胶，取决于其中待加载的分子的特征和高至数十微米级的不同尺寸。

根据具体实施方案，生物混合物包含平行布置在内腔的高至数十微米的可降解合成聚酯(例如，聚-l-乳酸、聚乙醇酸(pga)、聚己酸内酯或其共聚物)的微丝、尼龙或丝，其用作支持粘附和引导细胞迁移和轴突延伸。

此外，本发明还涉及一种获得所定义的管状支架的方法，其特征在于至少包括：

-布置用于包含所述管状支架的模具，

-将纤维形式的聚合物材料引入所述模具中，

-制备ha溶液并在交联剂存在下搅拌它们，

-将所述溶液注入模具的凹槽中，获得在原位交联的模具-溶液组件，

-冷冻获得的整个模具-溶液，和

-冻干整个模具-溶液，从而获得多微孔的ha基质。

根据特定实施方案，模具是疏水性聚合物材料的模具，纤维形式的聚合材料是疏水性聚合材料，并且交联剂是二乙烯基砜、戊二醛或碳二亚胺。

根据该方法的另一具体实施方案，模具由聚四氟乙烯制成，纤维形式的聚合材料是聚ε-己内酯，并且交联剂是二乙烯基砜、戊二醛或碳二亚胺。

使用的模具具有可以是各种形状和尺寸的凹槽。例如，它们可以是正方形、圆形、椭圆形、不规则截面或任何其它多边形形状的凹槽。凹槽可高至3mm宽。

使用的纤维状材料(优选聚ε-己内酯)的直径为约200至2000μm，优选为200至1000μm；并且比管状管道的长度长。

当使用二乙烯基砜(dvs)作为交联剂时，可以使用0.5:1或更大的dvs:ha单体单元比例。

ha溶液可以是具有0.5重量%至8重量%的不同浓度的溶液，总是基于在0.2m氢氧化钠中的ha的重量。优选地，ha的溶液具有在0.2m氢氧化钠中的1至5重量%的ha的浓度。

搅拌ha溶液并冷冻至-20℃至少5h。模具-溶液组件的冻干24h在低于600pa的压力和约-80℃的初始温度下进行。由于水的升华，作为冻干的产物，获得了ha的多微孔基质。在冻干步骤之后，取出模具的管状支架和形成模具本身的材料的环，将纤维从纤维形式的聚合物中取出，获得具有位于中心的内部通道的管道，并将获得的ha管道水合。水合步骤之后，可将plla纤维插入其内部。

本发明还涉及通过上述方法获得的所定义的管状支架。

本发明还涉及所定义的管状支架或包含所述支架的生物混合物诱导神经束的再生和受损或变性的神经元群体的重新连接的用途。

本发明还涉及所定义的管状支架或包含所述支架的生物混合物用于在影响中枢神经系统的疾病优选帕金森病和脊髓损伤中再生黑质纹状体束的用途。

已经开发了毫米级ha管道，其具有独特的深度依赖性壁孔隙度，从而允许营养物或分子信号的扩散，同时防止细胞穿透它们。材料的制造过程的不同步骤赋予它们大小和结构稳定性，并明显地限制其在生理环境中的溶胀。管状管道具有其中感兴趣的细胞可以在受保护的环境中接种的内腔。可以沿着内腔预先包括纤维束，如对于合成聚酯、尼龙或丝(例如plla)所述，以促进细胞迁移或细胞生长。这些管道已显示与schwann细胞(sc)相容，如在体外培养中所证实的。特别定制的三维水凝胶在其活力、迁移和分布方面代表细胞的有利环境，因为它们以与其它更适合于细胞的底物诸如plla相同的量级增殖。尽管ha的低粘附性通常阻止良好的细胞增殖的典型特征，但sc细胞可以从数毫米的管道的一端到另一端覆盖内腔，从而形成基于细胞-细胞连接的连续层。此外，即使在没有轴突的情况下，管道内的培养的胶质细胞也随时间产生显著量的结构性髓鞘蛋白。由于所有这些原因，新的多孔ha管道是恢复受损的神经元束的有希望的策略。

已经开发的管道是神经束再生的巨大潜力的桥梁，由于以下几个原因：

首先，管道的特殊特征是三层多孔壁，其导致比其它可比设备更受控制的孔分布。

管道壁的独特表面能够防止移植细胞迁移出通道，形成对星形胶质细胞、巨噬细胞和其它宿主细胞的屏障，以防止其与内部物理相互作用。

尽管如此，微孔大小允许不同分子诸如营养物、废物、稀释气体和细胞因子以及涉及细胞通讯和调节的其它分子信号的流动。因此，壁隔室允许营养物和细胞碎片的交换，并且避免移植细胞和宿主细胞之间的接触。随着降解发生和大孔的内部多孔结构暴露出来，壁基质应在孔形状和尺寸方面模拟周围组织，类似于脑组织的那些。

其次，管道基质由透明质酸链组成，其是细胞外基质的组分，对宿主的免疫反应低，这对于移植目的应是理想的，同时是可生物降解的和生物相容的。此外，尽管交联的透明质酸是高吸湿性凝胶，但冻干过程限制了由于在水溶液中溶胀引起的大小变化。这是为了考虑其外科手术植入而顾及的关键因素，因为中枢神经系统(cns)中的神经和软组织对压缩非常敏感并且可能另外改变周围环境的再生反应。然而，扩散系数是小气体分子之一通过固体膜扩散的量级。

附图简述

图1显示管状支架的不同层的孔径分布(μm)和孔隙度(总孔体积的分数，%)。

图2显示葡萄糖通过混合管道的扩散(小分子)。

图3显示牛血清白蛋白(bsa，较大分子)通过管状管道的扩散。

图4通过共聚焦显微镜图像显示在内部培养10天的schwann细胞通过管道的扩散结果，其细胞骨架以灰色falcidin标记。虚线显示通道的界限：细胞无法通过该界限。

图5是与图4相同的schwann细胞培养物的扫描电子显微镜图像，其显示具有粘附细胞的通道和管的纵截面结构。在管道的外部或中间层都没有检测到细胞。

实施例

1.材料的制备

使用具有1.5mm宽的穿孔凹槽的聚四氟乙烯(ptfe)的薄块作为管道的模具。使用外直径为1.5mm的ptfe垫圈在每个凹槽中提供直径为400-450μm的聚ε-己内酯(pcl，polysciences)纤维，每3cm纤维使用一个垫圈以使所述纤维保持在中心。这些纤维对管道的内腔起阴性作用。在氢氧化钠溶液(naoh，scharlab)中制备1，3和5wt%ha的ha溶液(sigma-aldrich)，并轻轻搅拌。使用二乙烯基砜作为交联剂(dvs，sigma-aldrich)(通过1,4michael加成)，其中dvs:ha单体单元的摩尔比为9:10。加入后，将溶液再搅拌10秒，并注入模具的凹槽中。一旦溶液胶化，将模具放置在petri培养皿中以避免蒸发并冷却至-20℃。然后将模具-溶液组件在20pa和-80℃下冻干(lyoquest-85，telstar)24h，由于水升华而产生多微孔ha基质。然后将纤维管道从模具中小心地取出并除去ptfe环。为了从每个ha管道中提取pcl纤维，将所述纤维从其端部拉伸以减小其直径。最后，将管道切成6mm部分，并在4-8℃下储存在30无菌蒸馏水中直至使用(最多4周)。

在1，3和5wt%的ha的ha溶液冻干之后获得ha管道，并与交联剂一起注入模具中。结果是具有长度为5.384±0.246mm和宽度为1.251±0.117mm的大小的软的、稳定的管道。该管道具有直径为0.406±0.056mm的位于中心的内部通道。中心通道在湿条件下足够宽以允许在其内部插入plla纤维。

中心通道从支架的一端延伸到另一端。在ha-plla的情况下，软纤维平行于通道表面布置以有利于细胞在其上的延伸。

使用在5重量%的ha管道壁的不同区域中的孔隙度的扫描电子显微镜(sem)图像的结构研究揭示了独特的可渗透底物，其中观察到三个孔拓扑结构(topologies)。通道表面具有连续且均匀的具有微孔的层；内部结构显示较大的互连的蜂窝状孔，并且外表面粗糙，具有随机的腔分布。

2.细胞和混合管道

使用schwann大鼠细胞(scs，innoprot)的原代培养物。sc生长在培养瓶(flask)中，并在含有必需和非必需氨基酸、维生素、有机和无机化合物、激素、生长因子、微量矿物质和10%的胎牛血清的完全培养基(p60123，innoprot)中，在37℃、5%co2下生长至聚集(converge)。所有的实验用第4至6代的细胞进行。将5%的ha管道与其中空或被plla纤维占据的内腔消毒，并将它们的膜消毒并预处理以通过连续两次用70°乙醇冲洗1小时用于在层流的围绕物中进行细胞培养实验。每次用50°和30°的乙醇冲洗样品10分钟，然后用去离子水彻底冲洗。通过mts测定(celltiter96aqueousonesolution，promega)评价sc的活力和增殖。在ha管道和其内腔中具有plla纤维的5ha管道中，与二维材料相比，随着培养时间，吸光度显著增加。在两种三维结构中获得的结果对于每个培养物是量级相同的，并与第10天的plla膜发现的那些相似。将活细胞和死细胞染色并通过荧光显微镜拍照；培养5天和10天后的图像显示了三种结构：ha管道、ha-plla管道和plla纤维束的大量钙黄绿素染色的活细胞。plla纤维上的细胞死亡率高于内部具有或不具有这种纤维的ha管道。定量地，流式细胞术分析揭示随着培养时间，管道内死细胞的百分比降低(活/死细胞活力测定，lifetechnologies)，而当细胞用对照(孔板培养孔)培养时，没有发生死细胞的这种降低。沿着内腔的一端培养10天后，无论其是否填充有纤维，通过免疫组织化学和图像处理对管道内细胞分布的研究均揭示了均匀的细胞群体。在含有plla纤维的那些管道中，细胞似乎更好地沿着内腔截面分布，而细胞在空内腔中略微卷成叶(leaf)；这个事实反映沿管道的平均强度的偏差，这在第一种情况下更大。最后，通过抗gfap、抗p75和抗s100抗体的染色将细胞的身份证实为sca，并且在具有或不具有纤维的管道中通过falcidin揭示了它们的形态。在ha管道中，在培养10天后，sc达到高汇合度(degreeofconfluence)并且具有细胞过程，通常是分枝的。细胞以层形式扩散和增殖，并沿着内腔迁移。然而，在plla纤维上，sc细胞相对于纤维的长轴排列，并且显示出双极形态，主要是纺锤形状和建立的细胞-细胞接触。在多光子成像中，可以观察到，不需要任何切割，细胞适应包被ha和ha-plla管道的内腔。通过扫描电子显微镜(sem)图像可以证实类似的结果，其中细节允许根据底物评估细胞的不同粘附程度：细胞显示圆形构造，其形成聚集体并建立位于ha内腔的表面上的粘附，但伸长并完全粘附到纤维，这揭示了亲密的plla-细胞接触。培养10天后髓鞘糖蛋白(p0)的表达与ha和ha-plla管道中1天相比增加。髓鞘蛋白零(p0)的表达在3d环境中有趣地增加，而不增加任何轴突信号，所述髓鞘蛋白零编码主要的髓鞘蛋白质(构成成熟schwann细胞中总蛋白的多于50%)并参与在压实过程中髓鞘螺旋缠绕中的膜的粘附。这一表达p0在1天后几乎不可检测，但10天后在具有纤维和不具有纤维的管道中的存在均是大量的。

图2和3显示，两种生理感兴趣的小分子，诸如葡萄糖和蛋白质(诸如bsa)，都可以容易地扩散通过管壁。图4和5显示在内部接种的细胞中通道限制的有效性。这同时显示来自外部的细胞不能穿透通道。该特性保护管内的细胞免受环境的可能的攻击。

作为三层膜不是生物活性营养物和分子通过的障碍，而是阻止细胞从内向外迁移或从外部穿透的证据，扩散结果也通过schwann细胞培养物的管道呈现，图4和5。