技术领域本发明属于中药技术领域，具体涉及一种六味石榴片在制备抑制皮肤黑色素瘤细胞SK-HEL-1细胞增殖药物中的应用及六味石榴片的制备方法。
背景技术：
六味石榴胶囊标准号WS-10474（ZD-0474）-2002，记载于国家中成药标准汇编外科妇科分册。由石榴子90g、肉桂45g、肉豆蔻45g、胡椒45g、红花45g、大托叶云实45g作为原料药制成，具有温肾，暧腰膝的功效。用于妇女白带病。现有技术中，尚未有六味石榴片在在制备抑制人皮肤黑色素瘤细胞SK-HEL-1细胞增殖药物中的应用的报道，也未见有六味石榴片提取制备方面采用超临界萃取的报道，而传统粉碎的方法，工艺粗糙、落后，杂质多，导致患者用量过大，不方便服用，严重影响了本品在临床上应用。
技术实现要素：
发明目的：本发明的目的在于提供一种六味石榴片在制备抑制皮肤黑色素瘤细胞SK-HEL-1细胞增殖药物中的应用。本发明的另一个目的在于提供一种六味石榴片的制备方法。本发明的目的是通过如下的方案实现的：六味石榴片在制备抑制皮肤黑色素瘤细胞SK-HEL-1细胞增殖药物中的应用，所述六味石榴片由石榴子90g、肉桂45g、肉豆蔻45g、胡椒45g、红花45g、大托叶云实45g作为原料药制成，所述六味石榴片的制备方法包括如下步骤：取石榴子90g、肉桂45g、肉豆蔻45g、胡椒45g、红花45g、大托叶云实45g，加入到CO2超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为4-6%，萃取压力15-30MPa，温度30-50℃，CO2流量l-3ml/g生药·min，萃取时间300-400min，得超临界萃取物，将超临界萃取物加入淀粉，70%乙醇制胶囊，干燥，压片，制成500片，每片重0.30g。优选的，上述的六味石榴片在制备抑制皮肤黑色素瘤细胞SK-HEL-1细胞增殖药物中的应用，所述六味石榴片的制备方法包括如下步骤：取石榴子90g、肉桂45g、肉豆蔻45g、胡椒45g、红花45g、大托叶云实45g，加入到CO2超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为5%，萃取压力25MPa，温度40℃，CO2流量2ml/g生药·min，萃取时间350min，得超临界萃取物，将超临界萃取物加入淀粉，70%乙醇制胶囊，干燥，压片，制成500片，每片重0.30g。现有技术中，六味石榴胶囊口服，一次5粒，一日3次。六味石榴胶囊服药量大。采用本发明方法制备成的六味石榴片每片重0.30g，每次仅需1片，一日服用3次。在具有更多活性成分的条件下大大减少了服用量。此结论可以通过下述试验证明。试验一、不同方法制备的六味石榴片中胡椒碱含量的比较l、仪器及试药本发明六味石榴片：按实施例1方法制备，使用315g原料药，经提取制成500片，每片重0.30g。原六味石榴胶囊，按照WS-10474（ZD-0474）-2002标准方法制备。Agilent1200高效液相色谱仪；METTLERAE240电子分析天平；胡椒碱对照品（中国药品生物制品检定所）。2、方法照高效液相色谱法（中国药典2015年版第四部凡例十五）测定。色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水（77∶23）为流动相；检测波长为343nm。理论板数按胡椒碱峰计算应不低于1500。对照品溶液的制备精密称取胡椒碱对照品适量，置棕色量瓶中，加无水乙醇制成每1ml含20μg的溶液，即得。本发明的六味石榴片的供试品溶液的制备取本发明的六味石榴片6g，混匀，取0.12g，精密称定，置50ml棕色量瓶中，加无水乙醇40ml，超声处理30分钟，放冷，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。对照产品供试品溶液的制备取对照六味石榴胶囊6g，混匀，取0.3g，精密称定，置50ml棕色量瓶中，加无水乙醇40ml，超声处理30分钟，放冷，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。3、结果结果表明，本发明六味石榴片中胡椒碱的含量为4.10-8.05mg/片；而原六味石榴胶囊中胡椒碱的含量为0.81mg/粒，每次服用量2片的胡椒碱含量为原胶囊剂5粒含量的2-4倍，在服用量减少的情况下，胡椒碱含量有很大提高。上述研究表明，采用本发明制备方法制备的六味石榴片，有效成分含量远远高于WS-10474（ZD-0474）-2002标准记载的方法制备的六味石榴胶囊。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明作更进一步的说明，以便本领域的技术人员更了解本发明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。实施例1取石榴子90g、肉桂45g、肉豆蔻45g、胡椒45g、红花45g、大托叶云实45g，加入到CO2超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为5%，萃取压力25MPa，温度40℃，CO2流量2ml/g生药·min，萃取时间350min，得超临界萃取物，将超临界萃取物加入淀粉，70%乙醇制胶囊，干燥，压片，制成500片，每片重0.30g。经检测，成品中胡椒碱的含量为8.05mg/片。实施例2取石榴子90g、肉桂45g、肉豆蔻45g、胡椒45g、红花45g、大托叶云实45g，加入到CO2超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为4%，萃取压力15MPa，温度30℃，CO2流量1ml/g生药·min，萃取时间300min，得超临界萃取物，将超临界萃取物加入淀粉，70%乙醇制胶囊，干燥，压片，制成500片，每片重0.30g。经检测，成品中胡椒碱的含量为4.15mg/片。实施例3取石榴子90g、肉桂45g、肉豆蔻45g、胡椒45g、红花45g、大托叶云实45g，加入到CO2超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为6%，萃取压力30MPa，温度60℃，CO2流量3ml/g生药·min，萃取时间400min，得超临界萃取物，将超临界萃取物加入淀粉，70%乙醇制胶囊，干燥，压片，制成500片，每片重0.30g。经检测，成品中胡椒碱的含量为6.03mg/片。实施例4：六味石榴片抑制人皮肤黑色素瘤细胞SK-HEL-1细胞增殖的实验研究资料1．实验材料1.1实验用细胞株人皮肤黑色素瘤细胞SK-HEL-1细胞，山东大学实验室细胞库，DMEM+10%FBS常规培养。1.2实验药物研究药物：本发明六味石榴片：按实施例1方法制备。药液储液：称取100mg六味石榴片，溶于5ml无水乙醇中，0.2μm滤器过滤，500μldoff管分装，-20℃存储，同时0.2μm滤器过滤无水乙醇以备对照组之用。1.3实验试剂DMEM(GIBCO公司Cat.No.12100-061Lot.No.758137)；胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司Lot.No.100419）；NaHC03(上海久亿化学试剂有限公司Cat.No.11810-033Lot.No.1088387)；Trypsin（AMRESCO公司）；EDTA（AMRESCO公司）；PenicillinGSodiumSalt（AMRESCO公司1）；StreptomycinSulfate(AMRESCO)；无水乙醇（淄博亚杜兰经贸有限公司）；MTT(Biosharp批号：0793)：PBS（实验室自配）；1.4实验器材莱卡倒置显微镜（德国Leica型号：DMIL）；可见-紫外光微孔板检测仪（美国MD公司型号：SPECTRAMAX190）；C02培养箱（FORMA型号：3111）；超净台（苏净集团安泰公司制造型号：SW-CJ-ZFD）；纯水仪（美国Sprlng公司型号：S/N020579）；精密移液器（法国吉尔森公司型号：P2）；电子天平（德国赛多利斯有限公司型号：BT323S）；全自动高压灭菌锅（日本SANYO公司型号：MLS-3020）；台式电热鼓风干燥箱(上海精密实验设备公司型号：DHG9123A)；冰箱(西门子公司型号：KG18V21TI)；液氮罐（CBS型号：2001）；低速离心机（上海安亭科学仪器厂型号：KA-1000）；0.2μm滤器（MILLIPORE型号：SLGP033RB）；1cm培养皿(NEST公司)、96孔培养板（NEST公司）；细胞计数板；离心管、移液管、Tips若干。2．实验方法1)SK-HEL-1细胞用DMEM+10%FBS于37℃、5%C02进行常规培养（10cm培养皿），当细胞生长至对数期时，收集细胞，弃去培养液，PBS轻洗3遍，加入3ml0.25%胰蛋白酶-0.04%EDTA，37℃消化2min后，向其中加入5ml完全培养基中和反应，吹打细胞后将其转入离心管中，1000rpm离心5min，调整细胞悬液浓度3×104个/ml。2)将细胞种入96孔培养板中，每孔加入细胞悬液180μl，培养板放入细胞培养箱中(37℃，5%C02)常规培养。3)根据细胞生长情况，一般长至50%-70%，加入六味石榴片溶液，继续培养24h。4)24h后加入20μlMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。5)4h后扣板法倒去上清，用吸水纸轻轻拍干，每孔加入200μl二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490nm处测量各孔的吸光值。6)同时设置本底（不加细胞，只加培养液），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定6个复孔。7)结果以药物对细胞的抑制率表示：细胞增值抑制率(%)=（对照孔OD值-给药孔OD值）、对照孔OD值×100%。实验重复3次。3．统计处理采用MicrosoftExcel2007软件中的相关分析和Studentt检验，数据以mean±S．D．表示。4．实验结果MTT法实验后统计结果显示，与对照组比较，当剂量达到5mg/ml时，对SK-HEL-1细胞增殖抑制有差异(P<0.05)，剂量在10mg/ml时该差异具有显著性(P<0.01)，当剂量达到15-20mg/ml时有极显著性差异(P<0.001)。表1六味石榴片对SK-HEL-1细胞增殖抑制影响研究(X±SD)组别药物浓度（mg/ml）抑制率（%）对照组00159.12±3.2321017.12±4.98*31525.75±6.94**42032.56±8.59**注：与对照组比较，*P<0.01；**P<0.001。5．实验结论本发明的六味石榴片可以抑制SK-HEL-1细胞增殖，减少SK-HEL-1细胞的细胞生长数目，该作用呈剂量依赖性。