使用包含氧化的海藻酸盐的生物砖制备构建体的方法与流程

文档序号:13176525阅读:来源:国知局
技术特征:
1.一种制备构建体,例如三维构建体,组织前体,组织或器官的方法,其包括,使用生物砖或包含生物砖的组合物(例如生物墨汁)进行生物打印的步骤;其中,所述生物砖包括:细胞,包裹细胞的核层,和,封装核层的壳层,所述生物砖的核层和壳层各自独立地由生物可降解材料制成;并且至少一个壳层包含氧化的海藻酸盐;优选地,所述方法产生了具有预定模式(例如任何预定形状)的构建体,例如三维构建体,人工组织或其前体;例如,所述构建体具有片状结构(例如长方形,正方形,圆形,椭圆形,六角形或不规则形状的片状结构),或中空管状结构,或中空三维结构(例如中空立方体,中空球体,中空的矩形棱柱体,中空圆柱体,或中空的不规则形状的三维结构),或实心三维结构(例如实心立方体,实心球体,实心矩形棱柱体,实心圆柱体,或实心不规则形状的三维结构),或其任何组合;优选地,所述构建体模拟天然组织或器官的形状;优选地,所述方法使用了至少1种(例如,2、3、4、5、6、7、8、9、或10种)组合物(例如生物墨汁);优选地,所述方法中的生物打印步骤是连续的和/或基本连续的;优选地,所述方法包括,连续地生物打印多个层,以获得具有预定模式的、包含多个层的三维构建体,其中每个层根据预定的模式用所述组合物(例如生物墨汁)进行生物打印;优选地,所述方法包括,连续地生物打印多个区段,以获得具有预定模式的、包含多个区段的三维构建体,其中每个区段根据预定的模式用所述组合物(例如生物墨汁)进行生物打印;优选地,所述方法还包括,使用生物砖以及任选的载体(例如生物粘合剂)制备组合物(例如生物墨汁)的步骤;优选地,所述方法还包括,根据天然组织或器官的形状和/或细胞排布模式,建立构建体(例如三维构建体)的结构模型的步骤;优选地,所述方法不会对组合物(例如生物墨汁)中或生物砖内的细\t胞造成机械损伤;例如,所述组合物(例如生物墨汁)中或生物砖内至少80%、85%、87.5%、90%、92.5%、95%、或98%的细胞在生物打印后能够存活、增殖、分化、分泌、迁移和/或具有正常的新陈代谢;优选地,所述方法还包括,在允许生物砖内的细胞增殖、分化、迁移、分泌和/或新陈代谢的条件下,培养所获得的构建体;例如,培养所获得的构建体至少0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、25、或30天;优选地,在3D培养箱或生物反应器中培养所获得的构建体;优选地,在培养过程中对构建体施加物理刺激(例如压力,剪切力,光照,加热等)和/或化学刺激(例如激素,细胞因子,化学试剂等);优选地,生物砖的核层和/或壳层和/或载体中的生物可降解材料在培养过程中至少一部分被降解;优选地,生物砖内的和/或生物砖之间的细胞在培养过程中彼此连接;优选地,所述方法产生了尺寸为至少30μm、50μm、100μm、200μm、500μm、1mm、2mm、5mm、1cm、2cm、5cm、10cm、20cm、或50cm的构建体。2.权利要求1的方法,其中所述生物砖的壳层不包含细胞;优选地,所述生物砖包括至少一个核层,例如1个、2个、3个、4个、5个或更多个核层;优选地,所述生物砖包括至少二个核层,并且各个核层各自独立地由生物可降解材料制成,和/或,各个核层各自独立地包裹相同或不同的细胞或细胞组合;优选地,所述生物砖包括至少一个壳层,例如1个、2个、3个、4个、5个或更多个壳层;优选地,所述生物砖的最外侧包含至少一个壳层;更优选地,位于生物砖最外侧的壳层包含氧化的海藻酸盐;优选地,所述生物砖包括:一个核层和一个壳层;或者,一个核层和2个或更多个壳层;或者,2个或更多个核层和一个壳层;或者,至少2个核层和至少2个壳层;优选地,所述生物砖由内到外依次包括:核层和壳层;或者,核层、\t第一壳层、和第二壳层;或者,第一核层、第二核层、和壳层;或者,第一核层、第二核层、第一壳层、和第二壳层;或者,第一核层、第一壳层、第二核层、和第二壳层;优选地,所述生物砖具有一定的力学强度,从而能够实现立体堆积;优选地,所述生物砖具有0.01-0.4GPa的硬度,例如0.01-0.02、0.02-0.03、0.03-0.04、0.04-0.05、0.05-0.06、0.06-0.07、0.07-0.08、0.08-0.09、0.09-0.1、0.1-0.15、0.15-0.2、0.2-0.3、0.3-0.4、0.01-0.4、0.01-0.05、0.05-0.1、0.1-0.2、0.2-0.4、0.05-0.15、或0.06-0.1GPa的硬度;和/或,具有0.01-100MPa的弹性模量,例如0.01-0.05、0.05-0.1、0.1-0.5、0.5-0.8、0.8-1、1-1.2、1.2-1.4、1.4-1.6、1.6-1.8、1.8-2、2-2.4、2.4-2.8、2.8-3.2、3.2-4、4-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-80、80-100、0.5-4、0.5-1、1-1.5、1.5-2、2-3、0.8-1.6、1.4-2.4、0.8-3.2、0.01-100、1-100、10-100、或0.5-50MPa的弹性模量。3.权利要求1或2的方法,其中,所述生物砖的核层能够为细胞的生命活动提供微环境;优选地,所述核层各自独立地由生物可降解材料制成,并且所述生物可降解材料是生物相容性的;优选地,用于制备核层的生物可降解材料是天然存在的(例如来源于动植物的天然存在的生物可降解材料),人工合成的,重组产生的,经过改性的,或者其任何组合;优选地,用于制备核层的所述生物可降解材料包含天然存在的可降解聚合物,例如胶原蛋白,纤维蛋白,壳聚糖,海藻酸盐,淀粉,透明质酸,层粘连蛋白,琼脂糖,明胶,葡聚糖,以及其任意组合;经过改性的可降解聚合物,例如经过改性的海藻酸盐,例如氧化海藻酸盐(例如氧化海藻酸钠);和/或,合成的可降解聚合物,例如聚磷腈,聚丙烯酸及其衍生物(例如聚甲基丙烯酸,丙烯酸和甲基丙烯酸的共聚物),聚乳酸(PLA),聚羟基乙酸(PGA),聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA),聚原\t酸酯(POE),聚己内酯(PCL),聚羟基丁酸酯(PHB),聚氨基酸(例如聚赖氨酸),可降解性聚氨酯,以及其任何组合;优选地,用于制备核层的所述生物可降解材料能够被酶(例如细胞分泌的酶)所降解;优选地,所述核层的降解能够提供维持或促进所述细胞的生命活动的营养物质;优选地,所述生物可降解材料选自胶原蛋白(例如I型,II型,III型胶原蛋白)、纤维蛋白、壳聚糖、海藻酸盐(例如海藻酸钠)、氧化海藻酸盐(例如氧化海藻酸钠)、淀粉、透明质酸,层粘连蛋白,弹性蛋白,明胶、葡聚糖、聚氨基酸(例如聚赖氨酸)、琼脂糖、可降解性聚氨酯或其任何组合;优选地,所述核层包含I型胶原蛋白和/或海藻酸盐,例如包含I型胶原蛋白和海藻酸钠;或者,包含层粘连蛋白;或者,包含淀粉;或者,包含可降解性聚氨酯;或者,包含海藻酸盐(例如海藻酸钠)和氧化海藻酸盐(例如氧化海藻酸钠);优选地,所述核层为凝胶状。4.权利要求1-3任一项的方法,其中,所述生物砖具有选自下列的一个或多个技术特征:(1)所述生物砖中的所有壳层都包含氧化的海藻酸盐,或者,位于最外侧的壳层包含氧化的海藻酸盐;(2)所述氧化的海藻酸盐包含氧化的海藻酸钠和/或氧化的海藻酸钙;(3)所述氧化的海藻酸盐的分子量为4kDa-1500kDa,例如4-10kDa、10-20kDa、20-30kDa、30-40kDa、40-50kDa、50-60kDa、60-70kDa、70-80kDa、80-90kDa、90-100kDa、100-200kDa、200-300kDa、300-400kDa、400-500kDa、500-600kDa、700-800kDa、800-900kDa、900-1000kDa、1100-1200kDa、1200-1300kDa、1300-1400kDa、或1400-1500kDa;(4)所述氧化的海藻酸盐的G/M值为0.2-5,例如0.2-0.3、\t0.3-0.4、0.4-0.5、0.5-0.6、0.6-0.7、0.7-0.8、0.8-0.9、0.9-1.0、1.0-1.5、1.5-2.0、2.0-2.5、2.5-3.0、3.0-3.5、3.5-4.0、4.0-4.5、或4.5-5.0;(5)所述氧化的海藻酸盐的氧化度为1-40%,例如1-2%、2-3%、3-4%、4-5%、5-6%、6-7%、7-8%、8-9%、9-10%、11-12%、12-13%、13-14%、14-15%、15-16%、16-17%、17-18%、18-19%、19-20%、20-25%、25-30%、30-35%、或35-40%;(6)用于制备所述至少一个壳层的氧化的海藻酸盐的粘度为100-3000mPa·s,例如100-200、200-300、300-400、400-500、500-600、600-700、700-800、800-900、900-1000、1000-1100、1100-1200、1200-1300、1300-1400、1400-1500、1500-1600、1600-1700、1700-1800、1800-1900、1900-2000、2000-2100、2100-2200、2200-2300、2300-2400、2400-2500、2500-2600、2600-2700、2700-2800、2800-2900、或2900-3000mPa·s;(7)所述至少一个壳层包含1-25%(wt)的氧化的海藻酸盐,例如,包含1-2%、2-3%、3-4%、4-5%、5-6%、6-7%、7-8%、8-9%、9-10%、10-15%、15-20%、20-25%(wt)的氧化的海藻酸盐;(8)所述至少一个壳层包含氧化的海藻酸盐(例如,上文所定义的氧化的海藻酸盐),以及海藻酸盐(例如海藻酸钠和/或海藻酸钙);其中,优选地,海藻酸盐与氧化的海藻酸盐的质量比为1:9至9:1,例如1:9、2:8、3:7、4:6、5:5、6:4、7:3、8:2、9:1;(9)所述至少一个壳层在不超过28天的时间内完全降解,例如,在不超过21天、不超过14天、不超过12天、不超过10天、不超过9天、不超过8天、不超过7天、不超过6天、不超过5天、不超过4天、不超过3天、或不超过2天的时间内完全降解;(10)所述至少一个壳层能够为细胞的生命活动提供微环境。5.权利要求1-4任一项的方法,其中,除了所述的包含氧化的海藻酸盐的至少一个壳层以外,所述生物砖还包含一个或多个额外的壳\t层;优选地,所述额外的壳层能够为细胞的生命活动提供微环境;优选地,所述额外的壳层各自独立地由生物可降解材料制成,并且所述生物可降解材料是生物相容性的;优选地,用于制备所述额外的壳层的生物可降解材料是天然存在的(例如来源于动植物的天然存在的生物可降解材料),人工合成的,重组产生的,经过改性的,或者其任何组合;优选地,用于制备所述额外的壳层的所述生物可降解材料包含天然存在的可降解聚合物,例如胶原蛋白,纤维蛋白,壳聚糖,海藻酸盐,淀粉,透明质酸,层粘连蛋白,琼脂糖,明胶,葡聚糖,以及其任意组合;经过改性的可降解聚合物,例如经过改性的海藻酸盐,例如氧化海藻酸盐(例如氧化海藻酸钠);和/或,合成的可降解聚合物,例如聚磷腈,聚丙烯酸及其衍生物(例如聚甲基丙烯酸,丙烯酸和甲基丙烯酸的共聚物),聚乳酸(PLA),聚羟基乙酸(PGA),聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA),聚原酸酯(POE),聚己内酯(PCL),聚羟基丁酸酯(PHB),聚氨基酸(例如聚赖氨酸),可降解性聚氨酯,以及其任何组合;优选地,用于制备所述额外的壳层的所述生物可降解材料能够被酶(例如细胞分泌的酶)所降解;优选地,所述额外的壳层的降解能够提供维持或促进所述细胞的生命活动的营养物质;优选地,所述生物可降解材料选自胶原蛋白(例如I型,II型,III型胶原蛋白)、纤维蛋白、壳聚糖、海藻酸盐(例如海藻酸钠或海藻酸钙)、氧化海藻酸盐(例如氧化海藻酸钠)、淀粉、透明质酸,层粘连蛋白,弹性蛋白,明胶、葡聚糖、聚氨基酸(例如聚赖氨酸)、琼脂糖,或其任何组合;优选地,所述额外的壳层包含海藻酸盐(例如海藻酸钠或海藻酸钙),例如包含海藻酸钙和明胶,任选地还包含弹性蛋白;或者,包含氧化海藻酸盐(例如氧化海藻酸钠);或者,包含海藻酸盐(例如海藻酸钠或海藻酸钙)和氧化海藻酸盐(例如氧化海藻酸钠);或者,包含海藻酸盐(例如海藻酸钠或海藻酸钙)和琼脂糖。6.权利要求1-5任一项的方法,其中,所述生物砖的壳层(例如,所述包含氧化的海藻酸盐的至少一个壳层,和/或所述额外的壳层)具有选自下列的一个或多个技术特征:(1)所述壳层为包裹的细胞提供了力学保护;优选地,所述壳层各自独立地具有0.01-0.4的硬度,例如0.01-0.02、0.02-0.03、0.03-0.04、0.04-0.05、0.05-0.06、0.06-0.07、0.07-0.08、0.08-0.09、0.09-0.1、0.1-0.15、0.15-0.2、0.2-0.3、0.3-0.4、0.01-0.4、0.01-0.05、0.05-0.1、0.1-0.2、0.2-0.4、0.05-0.15、或0.06-0.1GPa的硬度;和/或,具有0.01-100MPa的弹性模量,例如0.01-0.05、0.05-0.1、0.1-0.5、0.5-0.8、0.8-1、1-1.2、1.2-1.4、1.4-1.6、1.6-1.8、1.8-2、2-2.4、2.4-2.8、2.8-3.2、3.2-4、4-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-80、80-100、0.5-4、0.5-1、1-1.5、1.5-2、2-3、0.8-1.6、1.4-2.4、0.8-3.2、0.01-100、1-100、10-100、或0.5-50MPa的弹性模量;(2)所述壳层各自独立地为通透性的;例如,所述壳层对于水,氧气,和营养物质(糖类例如葡萄糖,脂肪,蛋白质,氨基酸,短肽,矿物质,维生素,细胞因子,核苷酸)是通透性的;(3)所述壳层各自独立地具有用于生物砖内外物质交换的通道或孔;优选地,通道的直径为至少10、20、50、100、150、200、250、300、350、400、或500nm;优选地,所述孔的直径为至少100、200、400、600、800、1000、1500、2000、4000、或5000nm;(4)所述壳层的厚度各自独立地为0.1-50μm,例如0.1-0.5、0.5-1、1-2、2-5、5-10、10-15、15-20、20-25、25-30、30-50、50-100、100-200、200-300、300-400、400-500、0.1-1、1-5、1-10、5-10、10-20、10-30、5-20、或1-20μm;(5)所述壳层各自任选地经过处理(例如使用壳层固定液进行处理,例如,以改善壳层的力学性能);更优选地,位于生物砖最外侧的壳层经过处理(例如使用壳层固定液进行处理,例如,以改善壳层的力学性能)。7.权利要求1-6任一项的方法,其中,所述核层和/或壳层各自独立地还包含额外的试剂,例如,营养物质、细胞外基质、细胞因子和/或药物活性成分;优选地,所述额外的试剂能够调控(例如促进)细胞的增殖、分化、迁移、分泌和/或新陈代谢;优选地,所述营养物质包括但不限于,核苷酸,氨基酸,多肽,碳水化合物(例如单糖,寡糖,多糖),脂质,维生素;优选地,细胞外基质选自多糖,例如糖胺聚糖、蛋白聚糖;结构蛋白,例如胶原和弹性蛋白;粘着蛋白,例如纤粘连蛋白和层粘连蛋白;优选地,所述细胞因子可以是用于调控细胞的增殖、分化、迁移、分泌和/或新陈代谢的细胞因子,包括但不限于:-与细胞生长相关的细胞因子,例如胰岛素、类胰岛素生长因子(如IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ)、转化生长因子(如TGFα和TGFβ)、血管内皮生长因子、表皮生长因子、成纤细胞生长因子、血小板来源生长因子、骨肉瘤来源生长因子、生长激素释放抑制因子、神经生长因子、白细胞介素(如IL-1、IL-1、IL-3)、红细胞生长素、集落刺激因子、皮质醇、甲状腺素,或其任何组合;-与细胞分化相关的细胞因子,例如Oct3/4,Sox2,Klf4,c-Myc,GATA4,TSP1,β-甘油磷酸钠,地塞米松,维生素C,胰岛素,IBMX,吲哚美锌,血小板衍生生长因子BB(PDGF-BB),5-氮杂胞苷,或其任何组合;-与细胞迁移相关的细胞因子,例如环磷酸腺苷,三磷酸磷脂酰肌醇,基质细胞衍生因子-1、N-钙粘蛋白,核因子κB,骨连接素,血栓素A2,Ras,或其任何组合;和/或-与细胞新陈代谢相关的细胞因子,例如胰岛素生长因子1、TRIP-Br2、DKK-1、sRANKL、OPG、TRACP-5b、ALP、SIRT1(2-7)、PGC-1α,PGC-1β、OPG、IL-3、IL-4、IL-6、TGF-β、PGE2、G-CSF、TNF-α,或其任何组合;优选地,所述药物活性成分为能够调控(例如促进)细胞的增殖、分化、迁移、分泌和/或新陈代谢的试剂;优选地,所述药物活性成分选自rhIL-2、rhIL-11、rhEPO、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、G-CSF、GM-CSF、rHuEPO、sTNF-R1、和rhTNF-α。8.权利要求1-7任一项的方法,其中,所述生物砖的核层各自独立地包含一个或多个细胞,例如1-106个细胞,例如10-900、20-800、30-700、40-600、50-500、60-400、70-300、80-200、10-100个、10-103个、10-104个、10-105个、10-106个细胞;优选地,所述细胞为细菌、酵母、植物细胞或动物细胞,例如哺乳动物细胞,优选人细胞;优选地,所述细胞为粘附细胞,例如分化的粘附细胞或未分化的粘附细胞;优选地,所述细胞为多能干细胞;优选地,所述细胞来源于选自下述的组织:结缔组织(例如,疏松结缔组织、致密结缔组织、弹性组织、网状结缔组织和脂肪组织)、肌肉组织(例如,骨骼肌、平滑肌和心肌)、泌尿生殖组织、胃肠组织、肺组织、骨组织、神经组织和上皮组织(例如,单层上皮和复层上皮)、内胚层来源的组织、中胚层来源的组织和外胚层来源的组织;优选地,所述细胞选自肌肉细胞(例如,骨骼肌细胞、心肌细胞、平滑肌细胞和成肌细胞)、结缔组织细胞(例如,骨细胞、软骨细胞、成纤维细胞以及分化为成骨细胞、软骨细胞或淋巴组织的细胞)、骨髓细胞、内皮细胞、皮肤细胞、上皮细胞、乳腺细胞、血管细胞、血细胞、淋巴细胞、神经细胞、许旺细胞、胃肠细胞、肝细胞、胰细胞、肺细胞、气管细胞、角膜细胞、泌尿生殖细胞、肾细胞、脂肪细胞、实质细胞、周细胞、间皮细胞、基质细胞、未分化的细胞(如干细胞和祖细胞)、内胚层来源的细胞、中胚层来源的细胞、外胚层来源的细胞、癌来源的细胞,细胞系、诱导的多能干细胞(iPS)、或其任何组合;优选地,所述生物砖的尺寸为20-2000μm,例如30-1900μm,40-1800μm,50-1700μm,60-1600μm,70-1500μm,80-1400μm,90-1300μm,100-1200μm,200-1000μm,300-800μm,400-600μm,100-500μm;优选地,所述生物砖为球形,或者任何期望的形状(例如立方体,矩形棱柱,六棱柱,圆柱,或不规则的形状);优选地,所述生物砖为固体或半固体,例如凝胶态;优选地,所述生物砖以混合物的形式存在;优选地,所述生物砖是分离的生物砖;优选地,所述生物砖提供于容器中。9.权利要求1的方法,其中,所述组合物(例如生物墨汁)包含权利要求2-8任一项中所定义的的生物砖;优选地,所述组合物包含生物砖和载体(所述载体优选包含生物粘合剂);优选地,所述载体(例如生物粘合剂)及其降解产物对于细胞是无毒的,和/或对于宿主是非免疫原性的;优选地,所述载体(例如生物粘合剂)包含生物可降解材料;优选地,所述载体(例如生物粘合剂)中的生物可降解材料是生物相容性的;优选地,所述载体(例如生物粘合剂)中的生物可降解材料的降解能够提供维持或促进生物砖内的细胞的生命活动的营养物质;优选地,所述载体(例如生物粘合剂)中的生物可降解材料是天然存在的(例如来源于动植物的天然存在的生物可降解材料),人工合成的,重组产生的,经过改性的,或者其任何组合;优选地,所述载体(例如生物粘合剂)中的生物可降解材料包含天然存在的可降解聚合物,例如胶原蛋白,纤维蛋白,壳聚糖,海藻酸盐,淀粉,透明质酸,层粘连蛋白,明胶,葡聚糖,弹性蛋白,以及其任意组合;经过改性的可降解聚合物,例如经过改性的海藻酸盐,例如氧化海藻酸盐(例如氧化海藻酸钠);和/或,合成的可降解聚合物,例如聚磷腈,聚丙烯酸及其衍生物(例如聚甲基丙烯酸,丙烯酸和甲基丙烯酸的共聚物),聚乳酸(PLA),聚羟基乙酸(PGA),聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA),聚原酸酯(POE),聚己内酯(PCL),聚羟基丁酸酯(PHB),聚氨基酸(例如聚赖氨酸),可降解性聚氨酯,以及其任何组合;优选地,所述载体(例如生物粘合剂)中的生物可降解材料选自胶原、纤维蛋白、壳聚糖、海藻酸盐(例如海藻酸钠或海藻酸钙)、氧化海藻酸盐(例如氧化海藻酸钠)、淀粉、透明质酸、层粘连蛋白、弹性蛋白、明胶、聚氨基酸(例如聚赖氨酸)、琼脂糖、葡聚糖、甲基纤维素、聚乙烯醇、聚丙烯酸及其衍生物(例如聚丙烯酸或其酯、聚甲基丙烯酸或其酯)、聚丙烯酰胺、聚N-取代丙烯酰胺或其任何组合;优选地,所述载体(例如生物粘合剂)包含海藻酸钠;或者,包含海藻酸盐(例如海藻酸钠或海藻酸钙)和氧化海藻酸盐(例如氧化海藻酸钠);优选地,所述载体还包含水,无机盐,pH缓冲剂,稳定剂,防腐剂,或其任何组合;优选地,所述载体(例如生物粘合剂)为液体或半液体(例如凝胶);优选地,所述载体(例如生物粘合剂)的粘度为1-1000Pas,例如1-2、2-3、3-4、4-5、5-6、6-7、7-8、8-9、9-10、10-12、12-14、14-16、16-18、18-20、20-25、25-30、30-50、50-80、80-100、100-200、200-300、300-400、400-500、500-800、或800-1000、1-3、3-8、8-16、3-10、10-20、20-50、50-160Pas、或30-160Pas;优选地,所述载体(例如生物粘合剂)包含额外的试剂,例如,营养物质、细胞外基质、细胞因子和/或药物活性成分;优选地,所述额外的试剂能够调控(例如促进)细胞的增殖、分化、迁移、分泌和/或新陈代谢;优选地,所述额外的试剂包括,维持或促进细胞的生命活动的营养物质(包括但不限于,核苷酸,氨基酸,多肽,碳水化合物(例如单糖,寡糖,多糖),脂质,维生素,细胞培养基);和/或,改善或调控细胞的生命活动的物质,例如细胞因子,细胞外基质,抗凋亡剂,抗氧化剂,药物活性成分,或其任何组合;优选地,细胞外基质选自多糖,例如糖胺聚糖、蛋白聚糖;结构蛋白,例如胶原和弹性蛋白;粘着蛋白,例如纤粘连蛋白和层粘连蛋白;优选地,所述细胞因子是用于调控细胞的增殖、分化、迁移、分泌\t和/或新陈代谢的细胞因子,包括但不限于:-与细胞生长相关的细胞因子,例如胰岛素、类胰岛素生长因子(如IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ)、转化生长因子(如TGFα和TGFβ)、血管内皮生长因子、表皮生长因子、成纤细胞生长因子、血小板来源生长因子、骨肉瘤来源生长因子、生长激素释放抑制因子、神经生长因子、白细胞介素(如IL-1、IL-11、IL-3)、红细胞生长素、集落刺激因子、皮质醇、甲状腺素,或其任何组合;-与细胞分化相关的细胞因子,例如Oct3/4,Sox2,Klf4,c-Myc,GATA4,TSP1,β-甘油磷酸钠,地塞米松,维生素C,胰岛素,IBMX,吲哚美锌,血小板衍生生长因子BB(PDGF-BB),5-氮杂胞苷,或其任何组合;-与细胞迁移相关的细胞因子,例如环磷酸腺苷,三磷酸磷脂酰肌醇,基质细胞衍生因子-1、N-钙粘蛋白,核因子κB,骨连接素,血栓素A2,Ras,或其任何组合;和/或-与细胞新陈代谢相关的细胞因子,例如胰岛素生长因子1、TRIP-Br2、DKK-1、sRANKL、OPG、TRACP-5b、ALP、SIRT1(2-7)、PGC-1α,PGC-1β、OPG、IL-3、IL-4、IL-6、TGF-β、PGE2、G-CSF、TNF-α,或其任何组合;优选地,所述药物活性成分为能够调控(例如促进)细胞的增殖、分化、迁移、分泌和/或新陈代谢的试剂;优选地,所述药物活性成分选自rhIL-2、rhIL-11、rhEPO、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、G-CSF、GM-CSF、rHuEPO、sTNF-R1、和rhTNF-α;优选地,所述组合物(例如生物墨汁)包含至少约10%(w/w)、至少约20%(w/w)、至少约30%(w/w)、至少约40%(w/w)、至少约50%(w/w)、至少约60%(w/w)、至少约70%(w/w)、至少约80%(w/w)、至少约90%(w/w)的生物砖;优选地,所述组合物(例如生物墨汁)为液体,半固体(例如凝胶)或固体组合物,例如溶液,悬浮液,凝胶,或浓缩物;优选地,所述组合物(例如生物墨汁)是可挤出的组合物。10.权利要求1-9任一项的方法,其中,所述生物砖通过包括下述步骤的方法来制备:(1)提供一种或多种核层材料,所述核层材料各自独立地由生物可降解材料制成,并且各自独立地包裹相同或不同的细胞或细胞组合;(2)提供一种或多种壳层材料,所述壳层材料各自独立地由生物可降解材料制成,并且其中,至少一种壳层材料包含氧化的海藻酸盐;(3)从步骤(1)所述的一种或多种核层材料中选择一种核层材料,并将其颗粒化,从而获得第一核层;(4)任选地,使用来自步骤(1)的一种核层材料或使用来自步骤(2)的一种壳层材料对步骤(3)的所述第一核层进行包被;(5)任选地,重复步骤(4)一次或数次;(6)使用来自步骤(2)的一种壳层材料对前一步骤的产物进行包被,从而产生所述生物砖,其中,步骤(4)-(6)使用的壳层材料中的至少一种包含氧化的海藻酸盐;优选地,在步骤(1)中,将细胞、用于形成核层的生物可降解材料和任选的期望的额外试剂(例如,营养物质、细胞外基质、细胞因子和/或药物活性成分)均匀混合,从而获得核层材料;优选地,步骤(2)所述的壳层材料不包含细胞;优选地,在步骤(3)-(6)中,使用制备微球体的仪器,例如造粒仪来进行颗粒化和包被;优选地,在每一次进行步骤(4)之后,如果所获得的产物的最外层包被为壳层材料,则任选地进行下述步骤:对最外层包被进行处理(例如使用壳层固定液进行处理,例如以改善壳层的力学性能);优选地,在步骤(6)之后,对所获得的生物砖的最外侧壳层进行处理(例如使用壳层固定液进行处理,例如以改善壳层的力学性能);优选地,在步骤(6)中,使用来自步骤(2)的包含氧化的海藻酸盐的壳层材料对前一步骤的产物进行包被;优选地,所述制备生物砖的方法在无菌条件下进行;优选地,所述\t方法在GMP工作间里进行;优选地,所述制备生物砖的方法在步骤(6)之后,将获得的生物砖贮存于4℃,例如贮存3小时、6小时、12小时、1天、2天、或3天。11.权利要求1-10任一项的方法,其中,所述组合物通过包括下述步骤的方法来制备:将所述生物砖与载体(例如生物粘合剂)混合;优选地,所述组合物(例如生物墨汁)和/或载体(例如生物粘合剂)具有权利要求9定义的任何一项或多项技术特征。12.一种构建体,其通过权利要求1-11任一项的方法制备;优选地,所述构建体是三维构建体,组织前体,组织或器官;优选地,所述构建体是活的构建体;优选地,所述构建体包含多个生物砖;优选地,所述生物砖以预定的模式排布;优选地,所述构建体(例如三维构建体,组织前体,组织或器官)的尺寸为至少30μm、50μm、100μm、200μm、500μm、1mm、2mm、5mm、1cm、2cm、5cm、10cm、20cm、或50cm;优选地,所述构建体的至少一个部分是生物打印的;优选地,所述构建体具有预先确定的结构;优选地,所述构建体具有一层或多层结构;优选地,每一个层结构各自由一层或多层生物砖构建;优选地,所述构建体为微型组织块;例如,所述微型组织块的尺寸为微米至厘米级别,例如1μm-50cm,例如,10μm-10cm,50μm-1cm,100μm-800μm,300μm-600μm;优选地,所述构建体被进行进一步的培养,例如被培养至少0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、25、或30天;优选地,所述构建体的生物砖中的细胞能够生长,增殖,分化、分泌和/或迁移;优选地,所述构建体具有片状结构(例如长方形,正方形,圆形,椭圆形,六角形或不规则形状的片状结构),或中空管状结构,或中空三维结构(例如中空立方体,中空球体,中空的矩形棱柱体,中空圆柱体,或中空的不规则形状的三维结构),或实心三维结构(例如实心立方体,实心球体,实心矩形棱柱体,实心圆柱体,或实心不规则形状的三维结构),或其任何组合;优选地,所述构建体模拟天然组织或器官的形状;优选地,所述构建体包括三层结构,即,内皮细胞层,平滑肌细胞层和成纤维细胞层。13.权利要求12的构建体的用途,其用于研究干细胞分化,用于药物发现,用于药物筛选,用于体内或体外测定,用于植入宿主体内,用于组织工程,用于组织再生,用于分析细胞在体内响应刺激或试剂而产生的变化(例如形态变化或功能变化),用于研究体内微环境的影响,用于治疗有此需要的受试者,用于评估因子(例如,化学试剂,例如化合物;物理刺激,例如辐射或加热)对组织或组织中的细胞的作用,用于三维组织培养,或用于修复受试者中损伤组织;或者,其用于制备试剂盒,所述试剂盒用于研究干细胞分化,用于药物发现,用于药物筛选,用于体内或体外测定,用于植入宿主体内,用于组织工程,用于组织再生,用于分析细胞在体内响应刺激或试剂而产生的变化(例如形态变化或功能变化),用于研究体内微环境的影响,用于治疗有此需要的受试者,用于评估因子(例如,化学试剂,例如化合物;物理刺激,例如辐射或加热)对组织或组织中的细胞的作用,用于三维组织培养,或用于修复受试者中损伤组织。14.一种试剂盒,其包含权利要求12的构建体(例如三维构建体,组织前体,组织或器官)。15.一种评估因子(例如,化学试剂,例如化合物;物理刺激,例\t如辐射或加热)对组织或组织中的细胞的作用的方法,其包括,将权利要求12的构建体(例如三维构建体,组织前体,组织或器官)暴露于所述因子,和,评估所述构建体中的细胞响应所述因子的变化(例如形态变化或功能变化),从而确定所述因子对组织或组织中的细胞的作用。
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