具有荧光示踪性能的壳聚糖‑聚乙二醇单甲醚嵌段共聚物聚合物点的制备方法与流程

本发明属于碳纳米材料的制备技术领域，更具体地是涉及一种壳聚糖接枝柠檬酸的衍生物在水热条件下合成具有荧光性质的聚合物点的制备方法。

背景技术：

纳米材料因其形貌大小可控，易于修饰、多功能化和高载药量等优点被广泛应用于肿瘤成像、药物递送等领域。尤其在药物递送方面应用较多，如金纳米粒、氧化硅纳米粒和碳纳米材料等无机纳米粒子，以及胶束、脂质体和树状分子等有机纳米材料。然而，大多数药物递送系统不具有可示踪性，进入细胞后，很难确定其在细胞内的真正位置。壳聚糖接枝聚乙二醇分子链可通过超声等方法制备成纳米微球用于药物载体已有大量文献报道，但一般不具有示踪性能。

碳纳米荧光材料受到人们越来越多的关注，碳点通常是指尺寸粒径小于10nm的碳粒子，主要包括碳点、石墨烯量子点、纳米金刚石等，与传统的有机染料和半导体量子点相比，碳点具有化学稳定性、低毒性、生物相容性、易修饰性等诸多优点。所以碳点有望取代重金属的半导体量子点，在材料科学、生物化学、电子器件以及生物医学等方面具有广阔的应用前景。壳聚糖是由自然界中广泛存在的甲壳素经过脱乙酰作用得到的一种生物多糖类天然高分子，具有很好的成膜性、生物相容性和生物可降解性，被广泛应用于生物医学领域。因此，需要将具有药物载体功能的壳聚糖接枝聚乙二醇聚合物制备成具有荧光示踪性能的聚合物点材料。

技术实现要素：

本发明的一个目的是解决传统的壳聚糖接枝聚乙二醇聚合物不具有示踪性能的问题，并提供一种无毒且有较好的荧光性能的药物载体材料的制备方法。

为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种具有荧光示踪性能的壳聚糖-聚乙二醇单甲醚嵌段共聚物聚合物点的制备方法，取N-柠檬酸化壳聚糖-g-聚乙二醇单甲醚、无水柠檬酸、N-2-羟基乙二胺，均分散于聚乙二醇400和去离子水的混合溶液中，进行反应，将反应后的产物用水透析，然后干燥，得到N-柠檬酸化壳聚糖-g-聚乙二醇单甲醚聚合物点。

优选的是，反应温度为180-230℃。

优选的是，反应时间为3-6h。

优选的是，每克N-柠檬酸化壳聚糖-g-聚乙二醇单甲醚需要的柠檬酸质量为0.2-1g，需要的N-2-羟基乙二胺的体积为1-5ml，需要的聚乙二醇400的体积为2-5ml，需要的去离子水的体积为5-10ml。

优选的是，所述N-柠檬酸化壳聚糖-g-聚乙二醇单甲醚的制备方法为：取壳聚糖-g-聚乙二醇单甲醚、柠檬酸、水搅拌6-12h，再加入等摩尔量的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC与N-羟基丁二酰亚胺NHS，避光搅拌反应24-48h，将反应后的产物用水透析，干燥得到N-柠檬酸化壳聚糖-g-聚乙二醇单甲醚。

优选的是，每克壳聚糖-g-聚乙二醇单甲醚需要的柠檬酸质量为1-5g，需要的EDC摩尔量为0.01-0.05mol，需要的NHS的摩尔量为0.01-0.05mol，需要的去离子水的体积为50-100ml。

优选的是，所述壳聚糖-g-聚乙二醇单甲醚的制备方法为：将壳聚糖溶于醋酸溶液中，加入聚乙二醇单甲醚甲基丙烯酸酯后，通入氮气，再加入硝酸铈铵引发剂单体，在氮气保护下于50-70℃反应8-12h，过滤，将滤液用氨水调节至中性，最后将滤液于水中透析，透析后干燥得到壳聚糖-g-聚乙二醇单甲醚。

优选的是，每克壳聚糖需要的聚乙二醇单甲醚甲基丙烯酸酯为0.5-1.5g，需要的硝酸铈铵引发剂单体为0.004-0.06g。

优选的是，干燥方法为冷冻干燥或者真空干燥，透析袋截留分子量为8000-14000Da。

优选的是，分散后，加入银粉、锑粉、镉粉和锌粉的混合物，其中银粉、锑粉、镉粉和锌粉均为80-110目粉末，且所述银粉、锑粉、镉粉和锌粉质量比为1:1:1:2。

本发明至少包括以下有益效果：

(1)本发明利用壳聚糖同时作为合成碳点的碳源和钝化剂制备荧光碳点材料，壳聚糖是由一种生物多糖类天然高分子，具有很好的生物相容性和生物可降解性，因此由此制备出来的碳点荧光材料生物相容性好，毒性低；

(2)本发明制备出的壳聚糖聚合物点具有荧光示踪性能，且本身的水溶性较好，适于用于荧光成像，特别适合用于药物载体材料；

(3)本发明发明的原料来源广泛，价格低廉，制备方法简单。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1是本发明实施例1制备的聚合物的X射线衍射图，其中a为壳聚糖的X射线衍射图，b为N-柠檬酸化壳聚糖-g-聚乙二醇单甲醚的X射线衍射图，c为N-柠檬酸化壳聚糖-g-聚乙二醇单甲醚聚合物点的X射线衍射图；

图2是本发明实施例1制备的N-柠檬酸化壳聚糖-g-聚乙二醇单甲醚聚合物点的荧光激发与发射光谱；

图3是本发明实施例1制备的N-柠檬酸化壳聚糖-g-聚乙二醇单甲醚聚合物点在不同激发波长下的发射光谱。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1：

(1)壳聚糖-g-聚乙二醇单甲醚(CS-g-mPEG)的合成

将1g壳聚糖和50ml质量分数为2％的醋酸溶液中置于250ml三口瓶中，搅拌使壳聚糖溶于醋酸溶液中，再加入1.0g的聚乙二醇单甲醚甲基丙烯酸酯，通入氮气15min后加入0.008g的硝酸铈铵引发剂，在氮气保护下于60℃下反应8h，趁热过滤，将滤液用氨水调节至中性，再将中和后的滤液转移到透析袋(截留分子量为8000-14000Da)中在去离子水中透析3天，所得产物冷冻干燥即得壳聚糖-g-聚乙二醇单甲醚(CS-g-mPEG)。

(2)N-柠檬酸化壳聚糖-g-聚乙二醇单甲醚(CS-g-mPEG-CA)的合成

在三口瓶中加入1.0g CS-g-mPEG、1.0g柠檬酸和50ml去离子水中，机械搅拌6h，再加入0.04mol EDC与0.04mol NHS，避光搅拌反应24h，将反应后的产物转移至透析袋(所选用透析袋截留分子量为8000-14000Da)中用去离子水透析3天，将透析后的产物冷冻干燥得到N-柠檬酸化壳聚糖-g-聚乙二醇单甲醚(CS-g-mPEG-CA)。

(3)N-柠檬酸化壳聚糖-g-聚乙二醇单甲醚聚合物点P(CS-g-mPEG-CA)Ds的合成

取1g上述CS-g-mPEG-CA、0.5g无水柠檬酸和1ml N-(2羟乙基)乙二胺于高压反应釜的聚四氟乙烯内胆中混合均匀，再将其分散于2ml聚乙二醇400和10ml去离子水的混合溶液中，于180℃反应6h，将反应后的产物用透析袋(所选用透析袋截留分子量为8000-14000Da)于去离子水中透析4天，所得产物置于冷冻干燥机中冷冻干燥即得N-柠檬酸化壳聚糖-g-聚乙二醇单甲醚聚合物点P(CS-g-mPEG-CA)Ds。

实施例2：

(1)壳聚糖-g-聚乙二醇单甲醚(CS-g-mPEG)的合成

将1g壳聚糖和50ml质量分数为2％的醋酸溶液置于250ml三口瓶中，搅拌使壳聚糖溶于醋酸溶液中，加入0.8g的聚乙二醇单甲醚甲基丙烯酸酯，通入氮气15min后加入0.01g硝酸铈铵引发剂，在氮气保护下60℃反应8h，趁热过滤，将滤液用氨水调节至中性，再将中和后的滤液转移到透析袋(截留分子量为8000-14000Da)中在去离子水中透析3天，所得产物冷冻干燥即得壳聚糖-g-聚乙二醇单甲醚(CS-g-mPEG)。

(2)N-柠檬酸化壳聚糖-g-聚乙二醇单甲醚(CS-g-mPEG-CA)的合成

在三口瓶中加入1.0g上述合成的CS-g-mPEG、5g柠檬酸以及50mL去离子水，机械搅拌6h，之后加入0.02mol EDC与0.02mol NHS等摩尔，避光搅拌反应24h，将反应后的产物转移至透析袋(所选用透析袋截留分子量为8000-14000Da)中用去离子水透析3天，将透析后的产物真空干燥得到N-柠檬酸化壳聚糖-g-聚乙二醇单甲醚(CS-g-mPEG-CA)。

(3)N-柠檬酸化壳聚糖-g-聚乙二醇单甲醚聚合物点P(CS-g-mPEG-CA)Ds的合成

取1g上述CS-g-mPEG-CA、0.5g无水柠檬酸和1ml N-(2羟乙基)乙二胺于高压反应釜的聚四氟乙烯内胆中混合均匀，并将其分散于2ml聚乙二醇400和10ml去离子水的混合溶液中，于180℃下反应6h，将反应后的产物用透析袋(所选用透析袋截留分子量为8000-14000Da)于去离子水中透析4天，所得产物置于冷冻干燥机中冷冻干燥即得N-柠檬酸化壳聚糖-g-聚乙二醇单甲醚聚合物点P(CS-g-mPEG-CA)Ds。

实施例3：

(1)壳聚糖-g-聚乙二醇单甲醚(CS-g-mPEG)的合成

将1g壳聚糖和50ml质量分数为2％的醋酸溶液置于250ml三口瓶中，搅拌使壳聚糖溶于醋酸溶液中，加入1.2g的聚乙二醇单甲醚甲基丙烯酸酯，通入氮气15min后，加入0.048g硝酸铈铵引发剂，在氮气保护下于60℃下反应8h，趁热过滤，将滤液用氨水调节至中性，再将中和后的滤液转移到透析袋(截留分子量为8000-14000Da)中在去离子水中透析3天，所得产物冷冻干燥即得壳聚糖-g-聚乙二醇单甲醚(CS-g-mPEG)。

(2)N-柠檬酸化壳聚糖-g-聚乙二醇单甲醚(CS-g-mPEG-CA)的合成

在三口瓶中加入上述合成的CS-g-mPEG 1.0g、5g柠檬酸和50mL去离子水，机械搅拌6h后，加入0.02mol EDC与0.02mol NHS，避光搅拌反应24h，将反应后的产物转移至透析袋(所选用透析袋截留分子量为8000-14000Da)中用去离子水透析3天，将透析后的产物真空干燥得到N-柠檬酸化壳聚糖-g-聚乙二醇单甲醚(CS-g-mPEG-CA)。

(3)N-柠檬酸化壳聚糖-g-聚乙二醇单甲醚聚合物点P(CS-g-mPEG-CA)Ds的合成

取1g上述CS-g-mPEG-CA、0.8g无水柠檬酸和1ml N-(2羟乙基)乙二胺于高压反应釜的聚四氟乙烯内胆中混合均匀，并将其分散于2ml聚乙二醇400和10ml去离子水的混合溶液中，在180℃下反应6h，将反应后的产物用透析袋(所选用透析袋截留分子量为8000-14000Da)于去离子水中透析3天，所得产物置于冷冻干燥机中冷冻干燥即得N-柠檬酸化壳聚糖-g-聚乙二醇单甲醚聚合物点P(CS-g-mPEG-CA)Ds。

实施例4：

(1)壳聚糖-g-聚乙二醇单甲醚(CS-g-mPEG)的合成

将1g壳聚糖和50ml质量分数为2％的醋酸溶液置于250ml三口瓶中，搅拌使壳聚糖溶于醋酸溶液中，加入0.6g的聚乙二醇单甲醚甲基丙烯酸酯，通入氮气15min后，加入0.003g硝酸铈铵引发剂，在氮气保护下于60℃下反应8h，趁热过滤，将滤液用氨水调节至中性，再将中和后的滤液转移到透析袋(截留分子量为8000-14000Da)中在去离子水中透析3天，所得产物真空干燥即得壳聚糖-g-聚乙二醇单甲醚(CS-g-mPEG)。

(2)N-柠檬酸化壳聚糖-g-聚乙二醇单甲醚(CS-g-mPEG-CA)的合成

在三口瓶中加入上述合成的CS-g-mPEG 1.0g、3.5g柠檬酸和60mL去离子水，机械搅拌6h后，加入0.01mol EDC与0.01mol NHS，避光搅拌反应24h，将反应后的产物转移至透析袋(所选用透析袋截留分子量为8000-14000Da)中用去离子水透析3天，将透析后的产物真空干燥得到N-柠檬酸化壳聚糖-g-聚乙二醇单甲醚(CS-g-mPEG-CA)。

(3)N-柠檬酸化壳聚糖-g-聚乙二醇单甲醚聚合物点P(CS-g-mPEG-CA)Ds的合成

取1g上述CS-g-mPEG-CA、0.3g无水柠檬酸和1ml N-(2羟乙基)乙二胺于高压反应釜的聚四氟乙烯内胆中混合均匀，并将其分散于3ml聚乙二醇400和6ml去离子水的混合溶液中，再加入0.1g银粉、0.1g锑粉、0.1g镉粉和0.2g锌粉的混合物，其中银粉、锑粉、镉粉和锌粉均为80-110目的粉末，开始升温至200℃反应，在反应过程中每隔1h加入一次0.1g银粉、0.1g锑粉、0.1g镉粉和0.2g锌粉的混合物，反应4h，反应完后离心过滤，将过滤得到的清夜用透析袋(所选用透析袋截留分子量为8000-14000Da)于去离子水中透析3天，所得产物置于冷冻干燥机中冷冻干燥即得N-柠檬酸化壳聚糖-g-聚乙二醇单甲醚聚合物点P(CS-g-mPEG-CA)Ds。

实施例5：

(1)壳聚糖-g-聚乙二醇单甲醚(CS-g-mPEG)的合成

将1g壳聚糖和50ml质量分数为2％的醋酸溶液置于250ml三口瓶中，搅拌使壳聚糖溶于醋酸溶液中，加入1.4g的聚乙二醇单甲醚甲基丙烯酸酯，通入氮气15min后，加入0.028g硝酸铈铵引发剂，在氮气保护下于60℃下反应8h，趁热过滤，将滤液用氨水调节至中性，再将中和后的滤液转移到透析袋(截留分子量为8000-14000Da)中在去离子水中透析3天，所得产物冷冻干燥即得壳聚糖-g-聚乙二醇单甲醚(CS-g-mPEG)。

(2)N-柠檬酸化壳聚糖-g-聚乙二醇单甲醚(CS-g-mPEG-CA)的合成

在三口瓶中加入上述合成的CS-g-mPEG 1.0g、2g柠檬酸和100mL去离子水，机械搅拌12h后，加入0.05mol EDC与0.05mol NHS，避光搅拌反应48h，将反应后的产物转移至透析袋(所选用透析袋截留分子量为8000-14000Da)中用去离子水透析3天，将透析后的产物真空干燥得到N-柠檬酸化壳聚糖-g-聚乙二醇单甲醚(CS-g-mPEG-CA)。

(3)N-柠檬酸化壳聚糖-g-聚乙二醇单甲醚聚合物点P(CS-g-mPEG-CA)Ds的合成

取1g上述CS-g-mPEG-CA、1g无水柠檬酸和5ml N-(2羟乙基)乙二胺于高压反应釜的聚四氟乙烯内胆中混合均匀，并将其分散于5ml聚乙二醇400和9ml去离子水的混合溶液中，再加入0.1g银粉、0.1g锑粉、0.1g镉粉和0.2g锌粉的混合物，其中银粉、锑粉、镉粉、锌粉均为80-110目的粉末，开始升温至230℃反应，在反应过程中每隔1h加入一次0.1g银粉、0.1g锑粉、0.1g镉粉和0.2g锌粉的混合物，反应3h，反应完后离心过滤，将过滤得到的清夜用透析袋(所选用透析袋截留分子量为8000-14000Da)于去离子水中透析3天，所得产物置于真空干燥机中真空干燥即得N-柠檬酸化壳聚糖-g-聚乙二醇单甲醚聚合物点P(CS-g-mPEG-CA)Ds。

N-柠檬酸化壳聚糖-g-聚乙二醇单甲醚聚合物点的表征：

图1是本发明实施例1制备的聚合物的X射线衍射图，其中a为壳聚糖(CS)的X射线衍射图，b为N-柠檬酸化壳聚糖-g-聚乙二醇单甲醚(CS-g-mPEG-CA)的X射线衍射图，c为N-柠檬酸化壳聚糖-g-聚乙二醇单甲醚聚合物点(P(CS-g-mPEG-CA)Ds)的X射线衍射图。由图1可以看出，壳聚糖在20°时出现了一个明显的结晶峰，当柠檬酸化壳聚糖与聚乙二醇单甲醚丙烯酸酯发生接枝聚合反应后，产物在18°和24°处出现了两个结晶峰，为聚乙二醇单甲醚聚合物所形成的结晶峰，这说明壳聚糖原有氨基氢原子被取代，聚乙二醇单甲醚和柠檬酸成功接枝到壳聚糖上，经碳化处理后在18°和24°处的结晶峰峰仍然保留完整，这说明碳化处理后未破坏产物分子链的规整性，从而使结晶峰未发生变化。

图2为N-柠檬酸化壳聚糖-g-聚乙二醇单甲醚聚合物点P(CS-g-mPEG-CA)Ds的荧光激发和发射光谱。图3是通过在不同波长(280～420nm，间隔为20nm)的光激发P(CS-g-mPEG-CA)Ds得到的荧光发射图谱，可以发现发射光谱范围大致在400～550nm之间，表现为蓝紫色的荧光，其中激发波长为360～380nm时荧光发射强度最强，在280～360nm时发射强度随激发波长增长而增强，当激发波长超过380nm时荧光发射强度随激发波长增加而减弱。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。