一种修复骨软骨双相多孔复合支架及其制备方法与流程

本发明涉及生物材料技术领域，具体涉及一种纳米羟基磷灰石、丝素蛋白和壳聚糖复合，双相多孔结构的复合支架及其制备方法。

技术背景

随着人类预期寿命的延长及人口学结构变化，创伤骨软骨已经成为全球密切关注的公共健康问题。关节软骨虽然有代谢活动，但由于缺乏血供及可迁移、增殖的未分化细胞，因而自身修复和再生能力极为有限，无论是生物化学还是生物力学因素引起的关节软骨破坏均不能恢复到正常状态。通常一旦发生病变，损害就会不断累积，直至关节面完全丧失，暴露出下方的骨组织。伴随着软骨改变的是骨赘形成，严重地破坏关节的形态和一致性。

关节内损伤引起的软骨损伤或缺损，多表现为包括全层关节软骨及软骨下骨的复合型骨软骨缺损。由于成人软骨几乎不能够依赖自身修复，特别是大面积的骨软骨缺损，从而造成骨性关节炎发生，甚至导致关节功能障碍的严重后果，给病人及家庭造成了很大的负担。因此，如何实现大面积骨软骨修复成为21世纪临床面临的巨大挑战。临床上大量的骨不连和骨缺损的患者已使骨移植成为最常用的移植术之一，而骨移植术有其很难克服的缺点”。这就促使骨组织工程学的出现和发展。目前，临床上的骨移植(包括人工骨移植)正在逐步地向骨组织工程过渡。

软骨缺损的修复技术包括打磨成型术、软骨下钻孔术、微骨折术、自体软骨细胞移植术及骨软骨镶嵌移植术(Mosaicplasty)，其治疗目标均是恢复平整、光滑的软骨面、充分的力学强度以及足够的关节无痛活动范围，其中以Mosaicplasty术治疗效果比较有优势，但在大面积骨软骨缺损中由于骨软骨柱供体来源有限，使其临床应用受到了较大限制。能否找到较理想的支架材料替代骨软骨柱重建骨软骨缺损是本发明中心所在。同时，将组织工程技术与Mosaicplasty技术相结合，使骨软骨组织缺损的完全再生成为可能。

组织工程技术的基本思路是用高密度细胞接种在可降解的支架材料上，在体外预先构建一个有生命的种植体，然后植入体内修复缺损的骨软骨组织。良好的种植体取决于理想的支架材料和优秀的种子细胞，支架材料作为种子细胞的暂时细胞外基质替代物，对细胞的黏附、增殖和分化等均有不可低估的影响。理想的支架材料应具有下列特点：(1)良好的生物相容性。(2)降解速率的可调控性。(3)具有一定生物力学。(4)良好的可塑性。(5)诱导软骨的再生性。(6)易于消毒和保存。尽管目前支架材料研究很多、发展很快，但至今尚未研制出一种理想的适合于修复骨软骨缺损的支架材料；因此，支架材料的研究仍然是组织工程研究的一个重要方面。

目前已有的动物实验可知，丝素蛋白(silk fibroin，SF)和壳聚糖(Chitosan，CS)均是天然高分子材料，有良好的生物活性和理化特性，且价廉易得，作为人体组织工程材料的应用研究已取得了一定的成果。研究发现将两者混合可以制备成SF-CS复合三维支架材料，有良好的生物相容性和理化特性。然而，我们发现软骨缺损往往存在部分软骨下骨缺损，且缺损面积较大时，单纯应用SF-CS三维支架于修复骨软骨缺损，存在软骨与骨交界处出现分层、整合欠佳等不足。

纳米羟基磷灰石(Nano HydroxyaPatite，nHA)是人体和动物骨骼、牙齿的重要无机成分，在骨质中，HA大约占60％。人工合成的nHA与人体正骨的磷灰石结晶相似，具有良好的生物活性和生物相容性，植入人后能在短时间内与人体的软硬组织形成紧密结合，为新骨的沉积与再生提供优良的生理支架，因此，nHA作为一种生物性能优越的骨替代料被广泛应用于临床。目前研究发现：将SF、CS及nHA三者混合可以制备成SF-CS-nHA复合三维支架材料，有良好的生物相容性和理化特性。

于是我们构想：制备骨软骨双相支架，以SF-CS作为软骨细胞的细胞外基质，用于构建双相支架的软骨相；以SF-CS-nHA作为成骨细胞的细胞外基质，构建双相支架的成骨相，增强组织工程骨种植体修复骨软骨缺损。

我们制作新型双相复合支架材料(双相支架)，再将其与单纯双相支架分别植入膝关节骨软骨缺损动物模型，观察在骨软骨修复过程中的差异，通过体内外组织工程有效地引导软骨和骨的形成和实现骨软骨的重建为制备与骨软骨的重建更匹配，更接近生理代谢特征，为骨软骨修复材料提供一定的理论依据。

技术实现要素：

本发明涉及生物材料技术领域，公开了一种修复骨软骨双相多孔复合支架及其制备方法。该复合支架由上下两层架构构成，下层支架为成骨相，是纳米羟基磷灰石、丝素蛋白和基壳聚糖复合制成，上层支架为成软骨相，是丝素蛋白和壳聚糖复合制成。在骨软骨新西兰大白兔模型中实验验证，和单相支架(单纯修复骨或软骨)相比较，本发明支架能够同时很好的修复骨与软骨组织，在组织工程研究中具有重要的意义。

本发明公开的修复骨软骨双相多孔复合支架，其特征在于，该双相多孔复合支架由下层成骨相和上层软骨相组成，下层成骨相和上层软骨相一体铸成。

上述的修复骨软骨双相多孔复合支架，其特征在于该支架是按照以下步骤制备的：

1)分别配置2％(m/M)的纳米羟基磷灰石、丝素蛋白和壳聚糖溶液。

2)配制下层成骨相：其中纳米羟基磷灰石、丝素蛋白和壳聚糖溶液比例为(15％-45％)∶(15％-45％)∶(15％-45％)；配制上层成软骨相：其中丝素蛋白和壳聚糖溶液比例为(40-60％)∶(40-60％)。

3)将步骤2)配制的下层成骨相溶液混匀加入模具中，随后放入-80℃冰箱中放置30min，彻底冷冻。

4)取出步骤3)的冷冻模具放置干冰上，再加入步骤2)配制的上层成软骨相溶液，放置-80℃中冷冻1小时。

5)将步骤4)冷冻好的支架用封口膜迅速密封，在封口膜上制作细孔后放入真空干燥机抽吸36h。

6)将步骤5)干燥后的支架浸入75％的甲醇和1mol/L氢氧化钠混合液中预处理15h，超纯水反复洗净后再次真空干燥。

7))将步骤6)干燥后的支架在碳化二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺混合的交联剂中浸泡10h后洗净。

8)将步骤7)的复合支架-80℃冷冻24h，真空干燥后即得到修复骨软骨双相多孔复合支架。

上述述的修复骨软骨双相多孔复合支架，其特征在于，该双相多孔复合支架能很好的修复骨软骨缺损模型。

本发明公开的修复骨软骨双相多孔复合支架具有以下特点：

该复合支架由上下两层架构构成，下层支架为成骨相，是纳米羟基磷灰石、丝素蛋白和基壳聚糖复合制成，上层支架为成软骨相，是丝素蛋白和壳聚糖复合制成。在骨软骨新西兰大白兔模型中实验验证，和单相支架(单纯修复骨或软骨)相比较，本发明支架能够同时很好的修复骨与软骨组织，在组织工程研究中具有重要的意义。

附图说明

附图1为双相多孔复合支架扫描电镜观察结果；

附图2为CT检测新西兰大白兔骨软骨的修复情况。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1 制备双相多孔复合支架

一种修复骨软骨双相多孔复合支架，由上下两层架构构成，下层为成骨相，纳米羟基磷灰石-丝素蛋白-基壳聚糖复合支架，上层为成软骨相，丝素蛋白-壳聚糖复合支架构成。其中，下层成骨相为纳米羟基磷灰石、丝素蛋白和壳聚糖溶液混合，各组分比例为(15％-45％)∶(15％-45％)∶(15％-45％)，上层成软骨相为丝素蛋白和壳聚糖溶液混合各组分为(40-60％)∶(40-60％)。

上述复合支架的制备方法，包括以下步骤：

将丝素蛋白、壳聚糖、纳米羟基磷灰石分别配制成为2％(m/M)溶液。

然后分别以体积比(15％-45％)∶(15％-45％)∶(15％-45％)三种比例混合，在磁力加热搅拌器中以55℃恒温搅拌直到3种液体中没有汽包，充分混合均匀，迅速吸取50ul加入96孔板中，迅速放入-80℃冰箱中静止1h，然后取出冷冻的96孔板。

将丝素蛋白、壳聚糖分别以体积比(40-60％)∶(40-60％)比例混合，在磁力加热搅拌器中以55℃恒温搅拌直到液体中没有汽包，充分混合均匀。

取出冷冻好的96孔板，放在冰袋上面，吸取50ul迅速加入冷冻的上层，再将96孔板放置-80℃冰箱中充分冷冻。

将冷冻好的支架用封口膜迅速密封，在支架相应区域制作细孔后放入真空干燥机抽吸36h。将干燥后的支架浸入含有体积分数75％甲醇和1mol/L氢氧化钠的混合液中预处理15h，超纯水反复洗净后再次真空干燥。然后将所得支架在以碳化二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺混合的交联剂中浸泡10h后洗净。

再将染湿的复合支架-80℃冷冻24h后真空干燥，即得到修复骨软骨双相多孔复合支架，扫描电镜观察结果如附图1所示。

实施例2 制备单相多孔复合支架

制备单相支架丝素蛋白、壳聚糖复合支架(具体方法参照佘荣峰，探讨丝素蛋白/壳聚糖三维支架材料制备方法[J]，中国组织工程研究与临床康复，2011，15(47)：8821-8824)。

将实施例1中配制好的溶液，分别以体积比丝素蛋白、壳聚糖，1∶1混合，在磁力加热搅拌器中以55℃恒温搅拌直到3种液体中没有汽包，充分混合均匀，迅速吸取50ul加入96孔板中，迅速放入-80℃冰箱中静止1h，然后取出冷冻的96孔板。

将冷冻好的支架用封口膜迅速密封，在支架相应区域制作细孔后放入真空干燥机抽吸36h。将干燥后的支架浸入含有体积分数75％甲醇和1mol/L氢氧化钠的混合液中预处理15h，超纯水反复洗净后再次真空干燥。

然后将所得支架在以碳化二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺混合的交联剂中浸泡10h后洗净。再将染湿的复合支架-80℃冷冻24h，然后真空干燥。

脱模即可得到支架丝素蛋白、壳聚糖复合支架。

实施例3 单相多孔复合支架的其制备

制备单相支架丝素蛋白、壳聚糖、纳米羟基磷灰石复合支架(具体方法参照叶鹏，丝素/壳聚糖/纳米羟基磷灰石构建的骨组织工程支架[J]，中国组织工程研究，2013(29)：5269-5274)。

将实施例1中配制好的溶液，然后分别以丝素蛋白、壳聚糖、纳米羟基磷灰石体积比1∶1∶1三种比例混合，在磁力加热搅拌器中以55℃恒温搅拌直到3种液体中没有汽包，充分混合均匀，迅速吸取50ul加入96孔板中，迅速放入-80℃冰箱中静止1h，然后取出冷冻的96孔板。

将冷冻好的支架用封口膜迅速密封，在支架相应区域制作细孔后放入真空干燥机抽吸36h。将干燥后的支架浸入含有体积分数75％甲醇和1mol/L氢氧化钠的混合液中预处理15h，超纯水反复洗净后再次真空干燥，

然后将所得支架在以碳化二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺混合的交联剂中浸泡10h后洗净，再将染湿的复合支架-80℃冷冻24h，然后真空干燥。脱模即可得到支架将丝素蛋白、壳聚糖、纳米羟基磷灰石复合支架。将制备的三维复合支架密封后备用。

实施例4 新西兰大白兔骨软骨缺损模型修复实验

动物模型的建立：取新西兰大白兔40只，手术前6h禁食禁饮。以2.5％戊巴比妥钠耳缘静脉注射麻醉。麻醉妥当后，妥善固定其四肢，以免术中挣扎损伤血管或神经，并注意充分暴露其右后肢。备皮，常规碘伏、乙醇消毒后用电钻在股骨髁上打孔，形成直径为6mm深度为4mm的小孔。

按照实验设计实验组，分为4组每组10只。A组植入预先制备好的双相丝素蛋白/壳聚糖/纳米羟基磷灰石复合支架，B组植入预先制备好的丝素蛋白/壳聚糖/纳米羟基磷灰石复合支架，C组植入预先制备好的丝素蛋白/壳聚糖复合支架，D组为空白对照组未植入任何材料。逐层缝合伤口，术后碘伏消毒伤口，纱布包扎后不用外固定，肌注青链霉素双抗预防感染。术后单笼喂养，术后8、12、16周各组分别进行CT检查，观察骨软骨的修复情况。

经CT观察鉴定，发现A组新西兰大白兔缺损的骨软骨修复均得到了修复，B组骨缺损修复较快，C组软骨组织修复较快，D组中缺损的骨软骨均得到了较少的修复。而且，A组中骨软骨的修复效果均超过了B组与C组修复效果。实验证明，双相复合支架可以同时促进修复骨软骨缺损大白兔模型，促进修复能力远远超过单纯修复骨缺损或者软骨缺损的单相支架。