松果菊苷和麦角甾苷的新用途的制作方法

本发明涉及松果菊苷和麦角甾苷的新用途。

背景技术：

血管生成(angiogenesis)是指在原有微血管的基础上，通过内皮细胞迁移、增殖、分化及细胞外基质的降解，并在相关信号通路的调控下，以芽生、桥联、或者套叠方式形成新生血管的调控过程，分为生理性血管生成和病理性血管生成。生理性血管生成是一个有序的调控过程，只发生在机体胚胎发育、组织损伤修复等特定的时期和部位。病理性血管生成则与肿瘤、糖尿病视网膜病、类风湿性关节炎、前列腺增生和银屑病等一系列血管生成依赖性疾病相关。

例如，肿瘤的生长和转移依赖于新生血管生成。在前血管期，肿瘤主要依靠弥散的方式获得营养和排泄废物，当其生长到一定体积时，弥散方式不能满足其生长所需，肿瘤细胞会通过分泌多种促血管生成因子，促进内皮细胞增殖、迁移，以形成新生血管为其提供营养和排除代谢产物。同时，内皮细胞也能通过旁分泌的方式直接促进肿瘤细胞的生长。因此，血管生成抑制剂是除细胞毒药物之外，抗肿瘤药物研究的重要领域。

根据肿瘤血管生成抑制剂的作用机制和靶点不同，可分为间接血管生成抑制剂和直接血管生成抑制剂。间接血管生成抑制剂主要通过选择性地抑制一种或几种促血管生成因子，或通过阻断促血管生成因子的下游信号通路而发挥作用。直接血管生成抑制剂则通过作用于肿瘤血管内皮细胞，抑制其增殖、迁移和形成新生血管。由于这类药物直接作用于基因遗传稳定的内皮细胞而非肿瘤细胞，其产生耐药性的可能性也较小。

松果菊苷和麦角甾苷具有抗氧化、清除自由基的作用，但目前尚无松果菊苷和麦角甾苷作为血管生成抑制剂的相关报道。

技术实现要素：

本发明提供了松果菊苷或麦角甾苷在制备血管生成抑制剂类药物中的用途。

进一步地，所述的药物是治疗肿瘤、糖尿病视网膜病、类风湿性关节炎、前列腺增生和银屑病等血管生成依赖性疾病的药物。

本发明还提供了一种血管生成抑制剂，它是以松果菊苷或麦角甾苷，或其药学上可接受的盐为活性成分，加上药学上可接受的辅料制备而成的制剂。

进一步地，所述制剂是注射制剂或口服制剂。

进一步地，所述血管生成抑制剂是治疗肿瘤、糖尿病视网膜病、类风湿性关节炎、前列腺增生和银屑病等血管生成依赖性疾病的药物。

本发明还提供了一种治疗肿瘤的药物，它是以松果菊苷或麦角甾苷为活性成分，加上药学上常用的辅料制备而成的制剂。

本发明还提供了一种治疗糖尿病视网膜病的药物，它是以松果菊苷或麦角甾苷为活性成分，加上药学上常用的辅料制备而成的制剂。

本发明还提供了一种治疗类风湿性关节炎的药物，它是以松果菊苷或麦角甾苷为活性成分，加上药学上常用的辅料制备而成的制剂。

本发明还提供了一种治疗前列腺增生的药物，它是以松果菊苷或麦角甾苷为活性成分，加上药学上常用的辅料制备而成的制剂。

本发明还提供了一种治疗银屑病的药物，它是以松果菊苷或麦角甾苷为活性成分，加上药学上常用的辅料制备而成的制剂。

经试验证明，松果菊苷和麦角甾苷均可以有效抑制血管内皮细胞的增殖，可以作为血管生成抑制剂，用于治疗肿瘤、糖尿病视网膜病、类风湿性关节炎、前列腺增生或银屑病等血管生成依赖性疾病，具有广阔的市场前景。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1：Hoechst33342染色法检测凋亡细胞的形态(200×)。

图2：Annexin V-FITC/PI双染法检测EA.hy926细胞凋亡率(n＝3)。

具体实施方式

实施例1松果菊苷和麦角甾苷对血管内皮细胞EA.hy926的增殖抑制和凋亡诱导作用

1材料与方法

1.1药物与试剂

RPMI 1640培养基(Gibco公司)；胎牛血清(MDgenics公司)；胰酶(Hyclone公司)；DMSO(sigma公司)；CCK-8试剂盒(Dojindo公司)；Hoechst33342染色液、Annexin V-FITC细胞凋亡试剂盒；松果菊苷(批号：PS0004-0020)、麦角甾苷(批号：PS0001-0020)。

1.2仪器

细胞培养箱(Nuaire公司)；荧光显微镜(Olympus公司)；5810R型台式离心机(Eppendorf公司)；多功能酶标仪(Synergy HT公司)；FACScalibur流式细胞仪(Becton Dickinson公司)。

1.3细胞培养

人脐静脉内皮细胞EA.hy926(美国模式菌种保藏中心ATCC)。细胞接种于含完全培养基的培养瓶中，置37℃，5％CO₂培养箱中培养，2～3天换液1次，当细胞密度为70～80％时，以1:6传代。

1.4药物制备

分别精密称取松果菊苷和麦角甾苷，加DMSO和0.1mol/LPBS的混合溶剂(1:7)溶解，过滤除菌，实验前用10％培养基稀释成浓度为3.125、6.25、12.5、25、50μmol/L的含药培养基(培养基中DMSO的浓度<0.1％)。

1.5CCK-8法测定细胞增殖抑制率

取对数生长期的EA.hy926细胞，消化后调整浓度为4×10⁴个/mL，每孔100μL接种于96孔板中。细胞贴壁后，吸弃培养基，药物组分别加浓度为3.125、6.25、12.5、25、50μmol/L的含药培养基，另设对照组(不加药物)和空白组(不加细胞和药物)，每组6个复孔。处理24h后，吸弃培养基，并用PBS洗涤两次。每孔分别加入含有CCK-8的培养基100μL(CCK-8试剂加培养基稀释成10％浓度)，37℃培养2h，在450nm测定吸光度(A)。细胞生长抑制率(％)＝(A_对照-A_药物)/(A_对照-A_空白)×100％，以Bliss法计算半数抑制浓度(IC₅₀)。

1.6Hoechst33342法检测细胞凋亡形态

EA.hy926细胞以2×10⁴个/孔接种于48孔板，细胞贴壁后，分别加入浓度为6.25、12.5、25、50μmol/L的含药培养基作用48h后，加PBS洗涤两次；4％多聚甲醛室温固定15min后，再加PBS洗涤两次；加10μg/mL的Hoechst33342染色，室温避光处理5min；再用PBS洗涤两次；置荧光显微镜下观察，将亮蓝色，细胞核固缩的细胞判断为Hoechst33342阳性细胞。

1.7Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率

取对数生长期的EA.hy926细胞，分别以浓度为6.25、12.5、25、50μmol/L的含药培养基处理，并设对照组(不加药物)，每组3个平行，处理48h后收集各组细胞，调整细胞数为1×10⁵个/mL，2000r/min离心5min，弃上清，加PBS重悬，2000r/min离心5min，弃上清，加入195μL Annexin V-FITC结合液重悬细胞，加5μL Annexin V-FITC混匀，避光孵育10min，再次2000r/min离心5min，弃上清，加190μL Annexin V-FITC结合液重悬细胞，测定前加10μL PI，混匀后于0.5h内测定。同时分别以只加Annexin V-FITC或PI作为单标对照，只加PBS作为空白对照。在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限为活细胞(Annexin V^-/PI^-)，右下象限为早期凋亡(Annexin V⁺/PI^-)，右上象限为晚期凋亡和坏死细胞(Annexin V⁺/PI⁺)。本发明中，将右下象限和右上象限之和作为总的细胞凋亡率。

2统计学分析

采用SPSS13.0统计软件进行单因素方差分析，数据以均数±标准差表示，P<0.05表示组间差异有统计学意义。

3结果

3.1松果菊苷和麦角甾苷对EA.hy926细胞增殖的抑制作用

与对照组相比，12.5、25和50μmol/L的松果菊苷和麦角甾苷能够显著抑制细胞增殖(P<0.01)，细胞活力分别下降为84.70％、47.78％、39.77％(松果菊苷)和82.10％、45.51％、38.87％(麦角甾苷)，呈现一定的量效关系。细胞经药物作用24h后，松果菊苷的IC₅₀为32.37μmol/L、麦角甾苷的IC₅₀为31.00μmol/L，结果如表1所示。

表1松果菊苷和麦角甾苷对EA.hy926细胞增殖的抑制作用(n＝3)

注：与对照组比较：^*P<0.05^**P<0.01

3.2松果菊苷和麦角甾苷对EA.hy926细胞凋亡的形态学研究

松果菊苷、麦角甾苷作用于EA.hy926细胞48h后，细胞经Hoechst33342染色，荧光显微镜下可见细胞核形态出现了明显改变。与对照组相比，药物组出现细胞核浓染和固缩现象，形成新月形细胞核。对照组无明显凋亡细胞。随着药物浓度的增加，细胞核皱缩更明显，结果如图1所示。

3.3松果菊苷和麦角甾苷对细胞凋亡率的影响

结果表明，对照组细胞的总凋亡率为4.27％，经不同浓度的松果菊苷和麦角甾苷作用于内皮细胞48h后，细胞凋亡率逐渐增加，分别为4.40％、5.30％、8.67％和13.63％(松果菊苷)和4.95％、6.99％、10.54％和14.93％(麦角甾苷)，呈现一定的量效关系。与对照组相比，当松果菊苷和麦角甾苷的浓度为25、50μmol/L时，细胞凋亡率显著增加(P<0.01)，结果如图2所示。

试验显示，内皮细胞增殖抑制率与松果菊苷、麦角甾苷的浓度呈正相关，两者的IC₅₀分别为32.37和31.00μmol/L。Hoechst33342染色显示，经松果菊苷和麦角甾苷作用后，EA.hy926细胞呈现细胞核固缩和浓染等凋亡特征，Annexin V-FITC/PI双染法进一步证实细胞凋亡率随着药物浓度的增加逐渐增加，表明松果菊苷和麦角甾苷对内皮细胞的增殖抑制与其促凋亡作用有关。

综上所述，松果菊苷和麦角甾苷均可以有效抑制血管内皮细胞的增殖，可以作为血管生成抑制剂，可用于治疗肿瘤、糖尿病视网膜病、类风湿性关节炎、前列腺增生或银屑病等血管生成依赖性疾病，具有广阔的市场前景。