人参皂苷C‑K在制备抗癫痫药物中的应用的制作方法

本发明属于医药技术领域，涉及人参皂苷C-K在制备治疗抗癫痫药物中的新用途。

背景技术：

癫痫是一种脑部疾患，其特点是持续存在能产生癫痫发作的脑部持久性改变，并出现相应的神经生物学、认知、心理学以及社会学等方面的后果。全球约有7000万癫痫患者，其中90％以上位于中低收入国家，以儿童和老年人居多。据中国抗癫痫协会统计，我国约有600万活动性癫痫患者，且每年约有40万新发癫痫患者，已成为第二大常见神经系统疾病。临床上已有30多种抗癫痫药物，其发挥抗癫痫作用的机制主要包括通过调控离子通道功能、抑制谷氨酸介导的兴奋效应、增强γ-氨基丁酸介导的抑制效应、以及调节突触小泡蛋白2A等。然而，现有抗癫痫药物仅能控制癫痫发作症状，患者长期服药后容易出现肝损伤、认知功能障碍、情绪障碍、皮疹如Stevens-Johnson综合征等严重不良反应。此外，仍有近三分之一的癫痫患者未能得到有效控制、进而发展为难治性癫痫，严重威胁患者的生命和生活质量，给家庭和社会带来沉重负担。因此，开发药物效应强、副作用较小的抗癫痫药物已成为防治癫痫疾病的重要目标。

人参皂苷C-K是一种四环三萜达玛烷型人参皂苷。其化学名为：20(S)-O-β-D-吡喃葡萄糖基原人参二醇，分子式：C₃₆H₆₁O₈，分子量：621.88，脂溶性较强，水溶性低。该化合物是人参皂苷Rb1、Rb2和Rc在机体肠道的主要降解产物，是天然二醇型人参皂苷在体内真正吸收和发挥活性的实体。人参皂苷C-K在天然人参中含量极少，无法直接大量分离，且未见有合成报道。现有人参皂苷C-K的制备方法主要是微生物转化和酶转化法。研究人员发现人参皂苷C-K具有抗癌、抗炎、保肝、降糖和延缓衰老作用。近年来有研究发现，人参皂苷C-K能防治脑缺血再灌注发挥保护神经作用。此外，人参皂苷C-K可能调节大脑NMDA受体和GABA受体活性。然而迄今为止，目前国内外尚无人参皂苷C-K抗癫痫作用的研究报道。

人参皂苷C-K的化学结构式

中国专利200910144925.2公开了“原人参三醇、原人参二醇在神经系统疾病的医疗应用”，主要为人参皂苷元原人参三醇(PPT)、原人参二醇(PPD)通过调控离子通道、GABA受体、谷氨酸受体活性，进而稳定细胞膜、抑制神经过度兴奋发挥抗癫痫作用。中国专利201210242927.7公开了“人参二醇皂苷组分在制备防治癫痫药物中的用途”，主要为人参皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc和Rd组分用于治疗和防治癫痫及癫痫并发症、并对现有抗癫痫药物的增效和减毒作用。但以上专利内容中涉及人参二醇皂苷组分为混合物且人参二醇皂苷的总含量低于98％，五种单体化合物含量低于50％，均未涉及到人参皂苷C-K的抗癫痫作用。

技术实现要素：

本发明旨在克服现有技术的问题，提供了一种人参皂苷C-K在制备抗癫痫药物中的应用。所述人参皂苷C-K是经常规的微生物转化或酶转化制备而成，纯度要求达98％以上。所述癫痫为癫痫发作及癫痫疾病的发生和发展，同时还包括癫痫相关并发症如认知功能障碍等。所述抗癫痫药物是防治癫痫患者癫痫发作及癫痫疾病发生和发展的药物。所述抗癫痫药物以人参皂苷C-K为活性成分，可以是人参皂苷C-K单体或人参皂苷C-K单体与药学赋形剂或载体组成的药物，还可以是人参皂苷C-K与其他抗癫痫药物的组合物，所述其他抗癫痫药物苯妥英钠、苯巴比妥、卡马西平、奥卡西平、左乙拉西坦、托吡酯中的至少一种。其剂型可以是任何剂型，包括注射剂、溶液剂、乳剂、口服液、混悬剂、栓剂、膏剂、霜剂、喷雾剂、滴剂、冻干粉针剂、散剂、颗粒剂、冲剂、胶囊剂、丸剂、片剂、贴剂，需要时可制成缓释制剂。给药方式可以是口服、注射、口鼻喷雾、肠腔或经皮给药。所述药学上可接受的载体包括包括抗氧化剂、螯合剂、表面活性剂、填充剂、崩解剂、润湿剂、分散剂、润滑剂、肠溶材料、pH调节剂、矫味剂、色素等。

本发明采用人参皂苷C-K进行动物实验，测定人参皂苷C-K低、中、高剂量对癫痫模型实验动物行为学的影响，结果显示人参皂苷C-K中、高剂量能显著延长癫痫全面性发作、癫痫肌阵挛发作的潜伏期，并降低或减轻癫痫发作的严重程度。因此，人参皂苷C-K可以抗癫痫发作，可用于防治癫痫全面性发作、癫痫持续状态、肌阵挛癫痫发作、失神性发作、难治性癫痫状态等，且不仅限于这些类型的癫痫发作。

总之，本发明所述人参皂苷C-K为经微生物转化制备而成的单体化合物，纯度达98％以上，结构上比五种人参二醇皂苷更少糖基，脂溶性更高，有益于透过血脑屏障。药效学研究结果表明，人参皂苷C-K的抗癫痫药理活性明显优于人参皂苷Rb1和PPD。

附图说明

图1.人参皂苷C-K对氯化锂-匹罗卡品诱导的大鼠癫痫发作级别、发作潜伏期的影响；B、C、D、E分别为癫痫模型组，丙戊酸钠(400mg/kg)组，人皂苷C-K低剂量(80mg/kg)组，人皂苷C-K中剂量(160mg/kg)组，人皂苷C-K高剂量(320mg/kg)组，*,**表示与癫痫模型组比较，P<0.05,0.01，NS表示无显著差异；

图2.人参皂苷C-K减少氯化锂-匹罗卡品诱导的大鼠癫痫发作后的体重丢失；B、C、D、E分别为癫痫模型组，丙戊酸钠(400mg/kg)组，人皂苷C-K低剂量(80mg/kg)组，人皂苷C-K中剂量(160mg/kg)组，人皂苷C-K高剂量(320mg/kg)组，*表示与癫痫模型组比较，P<0.05；

图3.人参皂苷C-K对戊四氮诱导的急性癫痫发作级别、潜伏期、发作持续时间的影响。B、C、D、E分别为癫痫模型组，丙戊酸钠(400mg/kg)组，人皂苷C-K低剂量(80mg/kg)组，人皂苷C-K中剂量(160mg/kg)组，人皂苷C-K高剂量(320mg/kg)组，*表示与癫痫模型组比较，P<0.05，NS表示无显著差异。

具体实施方式

实施例1人参皂苷C-K干预氯化锂-匹罗卡品诱导的急性癫痫模型

1.实验方法

1.1剂量设计和分组

实验分为正常对照组、癫痫模型组、丙戊酸钠阳性对照组(400mg/kg)、人参皂苷C-K低剂量组(80mg/kg)、人参皂苷C-K中剂量组(160mg/kg)。(见表1)。

表1实验分组和剂量设计

1.2实验步骤

SPF级健康雄性SD大鼠60只(体重180-220g)，随机分为正常对照组(A组)、癫痫模型组(B组)、丙戊酸钠阳性对照组(C组)、人参皂苷C-K低、中、高剂量组(D、E、F组)，每组10只。每日实验前将丙戊酸钠用生理盐水按剂量配制成相应浓度，人参皂苷C-K用0.5％CMC-Na按剂量配制成相应浓度，现配现用。每天给药前称量大鼠体重，按10ml/kg灌胃给药，2次/日，连续4天且每天给药时间相同。A组给予相同体积生理盐水，B组给予相同体积0.5％CMC-Na。第4天下午4：00左右腹腔注射氯化锂溶液(127mg/kg，i.p.)。第5天给药后30min进行腹腔注射溴甲基东莨菪碱溶液(1mg/kg，i.p.)以减轻匹罗卡品引起的外周不良反应。随后30min腹腔注射盐酸匹罗卡品溶液(30mg/kg，i.p.)，使氯化锂与匹罗卡品给药间隔在18-20h之间。利用视频监控系统监测给予匹罗卡品致痫后的大鼠行为学变化，观察2h，按Racine分级标准评估癫痫发作强度，记录癫痫发作潜伏期(自给完盐酸匹罗卡品开始计时至首次出现前肢阵挛为止)、发作强度(以发作级别最高为准)。大鼠发作持续1h后利用10％水合氯醛(3ml/kg，i.p.)进行终止发作。大鼠发作24小时后进行称重，记录大鼠体重变化。(分级标准见表2)。

表2 Racine分级标准

1.3检测指标

按照表2的Racine分级标准评估大鼠行为学变化，记录大鼠癫痫发作强度、发作潜伏期。

1.4统计方法

采用SPSS19.0进行统计分析，统计学意义的水平设定为P<0.05。采用均数±标准差(mean±SD)。用Leven’s test方法检验正态性和方差齐性。如果符合正态性和方差齐性，用单因素方差分析(One-way ANOVA)和post Hoc LSD进行统计分析；如果不符合正态性和方差不齐，则用Kruskal-Wallis检验。如果Kruskal-Wallis检验有统计学意义(P<0.05)，则用Dunnett’s Test(非参数方法)进行比较分析。评价时考虑统计学差异和生物学意义。

2.结果

2.1人参皂苷C-K延长氯化锂-匹罗卡品诱导的癫痫大鼠发作潜伏期(结果见图1和图2)

与模型组相比，人参皂苷C-K显著延长癫痫发作潜伏期，降低发作级别。此外，与丙戊酸钠相比，人参皂苷C-K延长癫痫发作潜伏期的数值无显著差异，表明人参皂苷C-K具有一定的抗癫痫作用，其效应与丙戊酸钠的抗癫痫作用相当。

实施例2人参皂苷C-K干预戊四氮诱导的急性癫痫模型

1.实验方法

1.1剂量设计和分组

实验分为正常对照组、癫痫模型组、丙戊酸钠阳性对照组(400mg/kg)、人参皂苷C-K低剂量组(80mg/kg)、人参皂苷C-K中剂量组(160mg/kg)、人参皂苷C-K高剂量组(320mg/kg)。(见表3)

表3实验分组和剂量设计

1.2实验步骤

SPF级健康雄性SD大鼠60只(体重180-220g)，随机分为正常对照组(A组)、癫痫模型组(B组)、丙戊酸钠阳性对照组(C组)、人参皂苷C-K低、中、高剂量组(D、E、F组)，每组10只。每日实验前将丙戊酸钠用生理盐水按剂量配制成相应浓度，人参皂苷C-K用0.5％CMC-Na按剂量配制成相应浓度，现配现用。每天给药前称量大鼠体重，按10ml/kg灌胃给药，2次/日，连续4天且每天给药时间相同。A组给予相同体积生理盐水，B组给予相同体积0.5％CMC-Na。第5天上午给药后1h进行腹腔注射戊四氮溶液(60mg/kg，i.p.)随后视频监控系统密切观察大鼠行为变化30min，按Racine分级标准评估癫痫发作强度，记录癫痫发作潜伏期(自戊四氮给药完毕开始计时、直至首次出现肌阵挛为止)、发作级别(以最高级别为准)、发作持续时间。观察2h后进行称重，记录大鼠体重变化。

1.3检测指标

按照表2的Racine分级标准评估大鼠行为学变化，记录大鼠癫痫发作强度、发作潜伏期、发作持续时间。

1.4统计方法

采用SPSS19.0进行统计分析，统计学意义的水平设定为P<0.05。采用均数±标准差(mean±SD)。用Leven’s test方法检验正态性和方差齐性。如果符合正态性和方差齐性，用单因素方差分析(One-way ANOVA)和post Hoc LSD进行统计分析；如果不符合正态性和方差不齐，则用Kruskal-Wallis检验。如果Kruskal-Wallis检验有统计学意义(P<0.05)，则用Dunnett’s Test(非参数方法)进行比较分析。评价时考虑统计学差异和生物学意义。

2.结果

2.1人参皂苷C-K显著改善戊四氮诱导的癫痫大鼠行为学(见图3)

与癫痫模型组相比较，人参皂苷C-K能显著延长癫痫发作潜伏期，且同时具有减轻发作强度、延长发作持续时间的作用。与阳性对照组相比较，人参皂苷C-K抗癫痫作用无显著差异。

3.实验小结

人参皂苷C-K延长癫痫发作潜伏期，降低癫痫发作强度，缩短癫痫发作持续时间。因此，人参皂苷C-K具有显著的抗癫痫作用且与丙戊酸钠疗效相当。