一种ROS响应的脑卒中智能药物载体及其制备方法与流程

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种ROS响应的脑卒中智能药物载体及其制备方法。

背景技术：

随着人类社会的不断进步，社会老龄化问题日趋严重，脑血管疾病发生率也在逐年增加，并已成为当前老年人疾病防治的重点。其中脑卒中是严重危害人类健康和生命安全的常见的难治性疾病，存在着明显三高(发病率高、致残率高、死亡率高)现象，被列为人类仅次于心血管疾病和恶性肿瘤的第三大杀手。临床上87％的脑卒中属于缺血性脑卒中，所以，对缺血性脑卒中的药物治疗研究具有重大的临床意义。生物体内活性氧(ROS)包括：羟自由基(OH-)、过氧化氢、过氧亚硝基(ONOO-)等，许多生理反应都会产生一定量的低水平ROS。研究表明：相较于正常生理条件，脑组织在脑卒中条件下会高水平持续性的产生ROS，过量的ROS会导致氧化性应激并且损伤细胞内的DNA、蛋白质和脂质等成分，从而造成局部细胞损伤。ROS水平提高和缺血性脑卒中的局部发病机制密切相关，脑卒中的典型损伤(缺血再灌注损伤)会产生持续大量ROS，并可同时加重最初的缺血性损伤。因此，针对脑缺血病灶部位高水平ROS的特性进行响应敏感智能药物载体的研究具有很大的前景。

NR2B9C是一种目前极有临床前景的治疗缺血性脑卒中的多肽，它由针对NMDA受体亚型NR2B羧基端的9个氨基酸残基组成，可特异性的与PSD-95结合，解除NMDAR/PSD-95偶联，阻断引起神经兴奋性毒性的下游信号传导，但不影响NMDA受体的正常生理功能。目前研究中NR2B9C均由源自HIV的Tat携带进入血液循环才能达到相应的局部治疗效果，但Tat在安全性方面存在很大争议，临床应用前景也不容乐观。所以，研究开发NR2B9C的脑卒中智能药物传递系统，显得非常重要。由于NR2B9C为亲水性极强的小分子多肽，常见的胶束、纳米粒等核-壳型结构的载体对其包封率和载药量都不理想。聚合物囊泡是由两亲性嵌段聚合物构成的具有封闭双层结构的药物递送载体，内部具有良好的亲水环境，对亲水性药物具有很理想的包封作用。

葡聚糖是一种具有较好的生物相容性，生物可降解性，易修饰以及容易获取的聚合物。研究表明，硼酸酯可作为具有ROS响应特性的触发基团，该基团较易响应ROS介导的降解作用。通过可逆性化学修饰，将具有ROS响应特性的疏水性硼酸酯接枝于亲水葡聚糖骨架，使其形成两亲性结构进而可以自主装分散于水相，形成极具应用前景的纳米囊泡药物载体。

技术实现要素：

本发明的目的是，鉴于目前NR2B9C递药效率及安全性等方面存在的缺陷，提供一种ROS响应的脑卒中智能药物载体及制备方法，该载体极易响应ROS介导的降解作用，使药物在脑缺血病灶部位速释同时减少在非病灶区释放，从而更加安全有效的实现药物递送。

本发明通过以下技术方案实现：ROS响应的脑卒中智能药物载体，是由以疏水性硼酸酯接枝于亲水葡聚糖骨架形成的两亲性嵌段共聚物为载体材料制备的纳米囊泡、该纳米囊泡用于包载的神经保护剂NR2B9C。纳米囊泡载体具有规整的球形外观，平均粒径在120-220nm。

所述葡聚糖重均分子量为10000-25000。

所述疏水性硼酸酯为4-羟甲基笨硼酸频哪醇酯(PBAP)、4-羟甲基苯硼一种或多种。所述NR2B9C的氨基酸序列为KLSSIESDV。

纳米囊泡具有规整的球形外观，平均粒径在120-220nm。

所述硼酸酯与葡聚糖的接枝率为30±5％。

将硼酸酯与葡聚糖通过共价接枝，再将接枝反应后的载体材料通过自主装法制备成纳米囊泡载体，并将神经保护剂NR2B9C包载于所述纳米囊泡载体中。

所述的ROS响应的脑卒中智能药物载体的制备方法，先将硼酸酯与葡聚糖通过共价接枝，再将接枝反应后的材料通过自主装法制备成纳米囊泡；硼酸酯与葡聚糖的质量比为10:5～25；

所述硼酸酯与葡聚糖共价接枝方法包括以下步骤：将4-羟甲基苯硼酸频那醇酯(PBAP)与羰基二咪唑(CDI)溶于无水二氯甲烷，反应30±10min后硫酸镁干燥过夜，浓缩并真空干燥得白色固体(PBAP-CDI)；将葡聚糖(dextran，Mw＝10000～25000g/mol)溶于甲酰胺中，随后分别加入PBAP-CDI、4-二甲氨基吡啶DMAP，室温搅拌过夜；将反应液通过透析法除去溶剂及未反应的PBAP-CDI，冷冻干燥所得白色粉末(PHB-Dextran)即为硼酸酯与葡聚糖共价接枝产物。

所述自组装法包括以下步骤：将一定量PHB-Dextran溶于甲醇与甲酰胺的混合溶剂作为有机相，将适量NR2B9C溶于0.2M Tris-HCl缓冲液，加入到上述有机相后分散到0.5％泊洛沙姆188水溶液中，继续搅拌1-2h，然后透析除去有机溶剂及游离NR2B9C，溶液过0.45μm的微孔滤膜即得纳米囊泡载体(NP/NR2B9C)。

制备纳米囊泡时混合有机相中甲醇与甲酰胺的体积比为1:1～5。

NR2B9C与PHB-Dextran载体材料的质量比为1:10～20。

本发明有益效果：

1、本发明合成出的脑卒中智能药物载体，在合成路线与制备工艺上有较大改进：并采用透析法来提纯载体材料及去除有机溶剂，合成出的材料溶解性良好，包封药物能力较强；采用自组装技术来制备纳米载体，方法简单易行，成本低。本发明制备出的ROS响应的脑卒中智能药物载体可将粒径控制在165nm左右，具有较好的稳定性。

2、本发明以ROS为智能释药开关，将神经保护剂NR2B9C包封于具有ROS响应的脑卒中智能药物载体中，可使其在脑缺血病灶部位速释药物同时减少在非病灶区释放，从而更加安全有效地将NR2B9C递送到大脑卒中部位，最大限度发挥药物的治疗作用，同时减少全身毒副作用。

附图说明：

图1为本发明所合成载体材料(PHB-Dextran)的分子式(上)与核磁共振图谱(下)。

图2为本发明ROS响应的脑卒中智能药物载体的透射电镜图。

图3为本发明ROS响应的脑卒中智能药物载体的水解行为图(分别对应0.01M PBS缓冲体系和含有1mM H₂O₂的0.01M PBS缓冲体系拍摄的纳米载体溶液的外观照片；对应0h(AB图)0.25h(CD图),0.5h(EF图)，1h(HI图),2h(JK图),4h(LM图)六个时间段，每个时间段两幅照片。

图4为本发明ROS响应的脑卒中智能药物载体的体外释放图。

图5为本发明ROS响应的脑卒中智能药物载体的体内药效比较照片：分为四个组：假手术组(Sham)、模型组(MCAO)、游离(NR2B9C)组、脑卒中智能药物载体(NP/NR2B9C)组，每组取视交叉前4mm及其后大脑做连续冠状切片各取5片的五幅照片。

图6、7为本发明ROS响应的脑卒中智能药物载体的体内药效学图，(分别对应**P<0.01,***P<0.001)。

具体实施方式：

下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步的阐述，具体实施例是在本发明的优选条件下进行。所述方法如无特别说明均为常规方法，所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径而得。

实施例1

载体材料PHB-Dextran的制备与表征

将4-羟甲基苯硼酸频那醇酯(PBAP,7.37g,31.5mmol)与羰基二咪唑(CDI,10.20g,62.9mmol)溶于无水二氯甲烷，反应30min。纯水洗三次(3×10ml)，盐水洗一次(1×10ml)，硫酸镁干燥过夜，浓缩并真空干燥得白色固体(PBAP-CDI)。将葡聚糖(dextran，Mw＝10000g/mol)溶于4ml甲酰胺中，随后分别加入PBAP-CDI、DMAP，室温搅拌过夜。将反应液用透析袋(截留分子量500Da，透析介质为纯水)透析除去甲酰胺及游离PBAP-CDI，冷冻干燥得白色粉末(PHB-Dextran)。核磁共振仪检测其核磁图谱，见图1。

实施例2

ROS响应脑卒中智能药物载体的制备与表征

采用自组装法制备，称取10mg PHB-Dextran溶于甲酰胺与甲醇的混合溶剂(V:V＝1:1)作为有机相，称取1mg NR2B9C溶于0.2M Tris-HCl缓冲液，与有机相混合后逐滴分散到不断搅拌(500rpm，37℃)的10ml 0.5％泊洛沙姆188水溶液中，继续搅拌1-2h，透析(截留分子量50kDa，透析介质为纯水)24h后，过0.45μm微孔滤膜即得纳米囊泡载体(NP/NR2B9C)，用透射电镜表征其形态见图2。图2中显示透射电镜下观察该纳米囊泡载体具有规整的球形外观，大小均匀，粒径在165nm左右。激光粒度分析表明，所得纳米囊泡载体以170nm为有效直径并呈正态分布，多分散性为0.018。包封率为60％，载药量为2.91％。

实施例3

ROS响应脑卒中智能药物载体的水解行为

将制备好的纳米囊泡载体(NP)分成两份，分别置于0.01M PBS缓冲体系和含有1mM H₂O₂的0.01M PBS缓冲体系中，37℃孵育。数码相机分别于0,0.25,0.5，1,2,4h拍摄相片考察纳米载体溶液的外观变化，见图3。由图3中可见，加入1mM H₂O₂ 15min后纳米囊泡载体的淡蓝色乳光明显减弱，30min后乳光消失变无色澄清，而无H₂O₂的PBS组外观无明显变化，此结果验证了纳米囊泡载体的水解行为具有ROS响应特性。

实施例4

ROS响应脑卒中智能药物载体的体外释放

包载罗丹明标记的NR2B9C(Rhodamine-NR2B9C)纳米囊泡载体制备方式同上。采用超滤离心法考察NP/Rhodamine-NR2B9C的释药行为，用1mM H₂O₂来模拟ROS水平升高的脑缺血病灶部位的微环境。释放介质分别为pH7.4的PBS磷酸盐缓冲液和含有1mM H₂O₂的PBS磷酸盐缓冲液。于37℃恒温水浴，160rpm振荡进行释放实验，平行操作3份。分别于0，0.5，1，2，4，8h时间点定时吸取介质0.5mL，同时补充等量恒温的新鲜释放介质。取出的介质经0.45μm微孔滤膜过滤，置于超滤离心管(MWCO＝30000Da)中并以3500rpm 5min超滤离心，下层清夜稀释适当倍数后，荧光分光光度计(EX:460nm,EM:525nm)测定并计算出累积释放百分率。由图4可知，H₂O₂组释放药物较快，4h时的累计释药量已接近50％。而PBS组释放趋势较平缓，4h时的累计释药量仅为15％左右。从上述结果可知，在H₂O₂存在条件下的累积释放率显著高于无H₂O₂存在的PBS组，验证了纳米囊泡载体释药行为的ROS响应特性，这将有利于其进入脑组织后，在缺血细胞中ROS刺激下响应，迅速释放出药物，修复已经濒临死亡的神经元。

实施例5

ROS响应脑卒中智能药物载体的体内药效学研究

健康雄性SD大鼠，随机分为4组：假手术组(Sham)、模型组(MCAO)、游离NR2B9C组、脑卒中智能药物载体(NP/NR2B9C)组，每组分别于脑损伤后，尾静脉注射相应处方。在脑缺血再灌注24h后，根据Zea-Longa建立的神经功能缺损程度的五级四分法标准系统地评分。缺血再灌注24h后，大鼠腹腔注射水合氯醛麻醉，立刻断头取脑，横断面由前向后，取视交叉前4mm及其后大脑做连续冠状切片(层厚2mm)，共取5片。将切片置于1％(质量浓度)TTC染色液中，干燥箱内37℃避光孵育30min，肉眼观察正常脑组织呈玫红色，梗死区脑组织呈白色。计算梗死灶面积百分比：梗死区面积Sn/梗死区所在半脑面积S’n×100％。Sn表示每单个闹切片上梗死面积之和，S’n表示每单个梗死区所在的半脑面积之和(n＝1～5)。见图5，TTC染色结果脑中玫红色部位为正常脑组织，白色部位为梗死区域。图中可知，假手术组未见梗死区域，模型组有较大程度的损伤，而NP/NR2B9C组的梗死面积可见明显减小，说明NP/NR2B9C对脑损伤的保护作用明显。由大脑梗死灶面积对比图可见，NP/NR2B9C组较MCAO组可以明显减少缺血梗死面积，统计学差异显著(P<0.001)。由神经功能评分结果，可以看出NP/NR2B9C组的大鼠较MCAO组有较轻的神经功能损伤，统计学差异显著(P<0.01)。以上结果均表明本发明的脑卒中智能药物载体(NP/NR2B9C)可以安全有效地将NR2B9C递送到大脑卒中部位，使其发挥治疗作用。