本发明属于生物医学工程领域，具体涉及一种壳聚糖季铵盐猪脱细胞真皮基质敷料及其制备方法。
背景技术：
皮肤是维持内环境稳定和阻止微生物入侵的屏障。皮肤创伤治疗的最终目标是重建或恢复皮肤屏障，一个性能良好的创面敷料可暂时起到屏障作用，提供一个有利创面愈合的环境。理想的创面敷料应具有:①良好的粘附性、通透性，又具有类似正常皮肤的水分蒸发率;②能阻止细菌入侵和限制细菌在创面上定殖;③减轻疼痛;④具有良好的弹性和柔韧性，可随体形覆盖创面，适合于人体不同部位;⑤有效防止移植后引起的瘫痕形成和创面收缩;⑥能诱导细胞生长，促使自体成纤维细胞在异种支架中生长;促进创面愈合，以达外观平整的目的;⑦对组织无刺激性、无毒性、无抗原性、具有良好的生物相容性;⑧能耐受常用消毒方法处理，能在长期保存，并能大量生产。
脱细胞真皮基质去除了皮肤中的表皮层及含抗原成分的细胞仅保留真皮中含胶原网架的细胞外基质，具有抵抗原性、良好的生物学性能和力学性能,是一种理想的生物敷料。异种(猪)脱细胞真皮基质相比于异体脱细胞真皮基质具有来源广泛,价廉质优等优点,并且在胶原含量、结构上与人体皮肤具有很高的组织同源性并且高度相似，已在临床上取得广泛应用。但猪脱细胞真皮基质没有抗菌能力，作为敷料使用时容易受细菌感染而导致创面感染，又具有交叉感染的危险性等缺点，限制了其作为敷料在临床上的应用。
技术实现要素：
本发明针解决猪脱细胞真皮基质作为敷料时容易受细菌感染的缺点，提供一种壳聚糖季铵盐猪脱细胞真皮基质敷料及其制备方法。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：一种壳聚糖季铵盐猪脱细胞真皮基质敷料，由猪脱细胞真皮基质与壳聚糖季铵盐组成，所述的壳聚糖季铵盐为壳聚糖经由缩水甘油基三乙基氯化铵或缩水甘油基三甲基氯化铵改性制得。
一种壳聚糖季铵盐猪脱细胞真皮基质敷料的制备方法，所述制备方法具体步骤如下：
S1、壳聚糖季铵盐的制备：（a）、将壳聚糖溶于冰乙酸溶液中，制成壳聚糖溶液，将所述壳聚糖溶液中加入NaOH溶液，使pH调节至大于9，将壳聚糖絮状物析出；（b）、将所述壳聚糖絮状物加入蒸馏水搅拌后以3000rpm的速度进行离心处理10分钟获取沉淀，再用蒸馏水将所述沉淀洗至中性；（c）、将步骤（b）所述沉淀置于圆底烧瓶中，加入异丙醇，加热至75-80℃反应30-60min，然后加入缩水甘油基三乙基氯化铵或缩水甘油基三甲基氯化铵的水溶液，75-80℃反应6h，旋转蒸发除去多余溶剂，加入乙醇/丙酮混合液，静置10-30min，过滤，得壳聚糖季铵盐；（d）、用蒸馏水将壳聚糖季铵盐配制形成质量浓度为5%的壳聚糖季铵盐溶液以备用；
S2、猪脱细胞真皮基质的处理：将猪脱细胞真皮基质置于乙醇中进行脱水处理，然后再置于-80℃冷冻干燥机中冷冻干燥，最后紫外照射灭菌3-6h；
S3、壳聚糖季铵盐猪脱细胞真皮基质敷料的制备:将步骤（S2）处理所得的猪脱细胞真皮基质，浸泡于步骤（S1）所述壳聚糖季铵盐溶液中，于室温下边搅拌边超声处理1-2h，搅拌速度为1500-2000rpm，然后在无菌环境下，将猪脱细胞真皮基质取出，然后用无水乙醇冲洗，置于-80℃冷冻干燥机中冷冻干燥，即得壳聚糖季铵盐猪脱细胞真皮基质敷料。
优选的，步骤（S1）中所述的冰乙酸的浓度为1%（质量浓度），NaOH溶液的浓度为1mol/L，加入异丙醇的量为壳聚糖絮状物的体积的3-5倍，乙醇/丙酮混合溶液由乙醇和丙酮按体积比1:1混合而成。
优选的，步骤（S1）中所述的缩水甘油基三乙基氯化铵或缩水甘油基三甲基氯化铵的加入量与壳聚糖的加入量的比例为按缩水甘油基三乙基氯化铵或缩水甘油基三甲基氯化铵中所含有的环氧基团物质的量（N1）与壳聚糖的氨基含量（N2）两者之比为1:1或1:2。
优选的，步骤（2）中所述的猪脱细胞真皮基质的脱水处理步骤为：先将猪脱细胞真皮基质依次浸泡于75%、85%、95%的乙醇中各6h，然后置于无水乙醇中超声处理60min。
优选的，步骤（3）中所述猪脱细胞真皮基质浸泡于壳聚糖季铵盐溶液中的量为壳聚糖季铵盐溶液与猪脱细胞真皮基质的体积比为50:1。
本发明的有益效果为：
（1）本发明的壳聚糖季铵盐猪脱细胞真皮基质敷料完整地保留了细胞的形态结构和组成成分，具有抗原性低的特点，同时可诱导具有再生能力的成纤细胞及血管内皮细胞在其中生长。
（2）复合在猪脱细胞真皮基质上的壳聚糖季铵盐具有缓释效果，可以持续作用于再生细菌，能达到持续、高效抗菌的效果，能减少敷料的换药次数，降低交叉感染的风险，同时减少了换药时为患者带来的痛苦。
（3）壳聚糖季铵盐相比于传统的抗菌剂不会产生耐药性，具有持久的抗感染能力和良好的生物相容性，且壳聚糖季铵盐具有促进创面愈合的作用。
（4）通过对猪脱细胞真皮基质进行多次的梯度脱水，超声，冷冻干燥处理，使猪脱细胞真皮基质里残留的可能引起免疫原性的水溶性物质去除，并且使脱细胞真皮基质原有的三维网状结构更加疏松，使得壳聚糖季铵盐能更好地复合到在其中。
（5）本发明中所制得的壳聚糖季铵盐猪脱细胞真皮基质敷料，由于壳聚糖季铵盐具有良好的溶解性，在使用时用无菌生理盐水湿润后会在敷料的表面形成水凝胶，敷料能更好地粘附在创面上，减少创面的水分流失，缓解痛楚。此外，由于壳聚糖季铵盐具有良好的吸液性和具有一定的止血功能，本发明所制得的壳聚糖季铵盐猪脱细胞真皮基质敷料能起到止血效果。
（6）相比于添加其他的抗菌剂（如纳米银、抗生素等），本发明采用的壳聚糖季铵盐具有良好的生物安全性和长效的抗菌性能。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步的说明。
实施例1
一种壳聚糖季铵盐猪脱细胞真皮基质敷料的制备方法，所述制备方法具体步骤如下：
S1、壳聚糖季铵盐的制备：将一定量的壳聚糖（氨基含量为n1）溶于质量浓度为1%的冰乙酸溶液中，制成壳聚糖溶液，再用1mol/L的NaOH溶液调节其pH至大于9，使壳聚糖絮状物析出，加入蒸馏水搅拌1h后，3000rpm离心10 min，得到壳聚糖沉淀，然后加入蒸馏水浸没沉淀搅拌1h，测试水的pH值，再用蒸馏水将沉淀洗至中性。将壳聚糖沉淀置于圆底烧瓶中，加入异丙醇（按异丙醇与壳聚糖沉淀体积比为5：1），加热至80℃，反应60min，然后取含环氧基团物质的量为 n2（n1:n2=1:1）的缩水甘油基三乙基氯化铵溶于蒸馏水中，逐滴加入烧瓶中水溶液，80℃反应6h，旋转蒸发除去多余溶剂，然后加入10倍体积的乙醇/丙酮混合液（乙醇与丙酮的体积比为1:1），静置30min，抽滤，滤出沉淀物其置于 60℃真空干燥箱中干燥，即得壳聚糖季铵盐，最后用蒸馏水将壳聚糖季铵盐配制形成质量浓度为5%的壳聚糖季铵盐溶液以备用；
S2、将猪脱细胞真皮基质浸泡于75%乙醇中6h；取出后置于85%乙醇中6h；取出后再置于95%乙醇中6h，再超声处理10min，无菌操作下从浸泡液中取出，紫外照射3h灭菌；
S3、壳聚糖季铵盐猪脱细胞真皮基质敷料的制备: 将步骤2中处理所得的猪脱细胞真皮基质浸泡于质量浓度为5%的壳聚糖季铵盐溶液中超声处理2h，重复3次，该过程中壳聚糖季铵盐溶液与猪脱细胞真皮基质的体积比为50:1，完成后在4℃下低温放置24h，取出浸泡后的猪脱细胞真皮基质，用PBS缓冲溶液冲洗数遍后，冷冻干燥即得壳聚糖季铵盐猪脱细胞真皮基质敷料。
实施例2
一种壳聚糖季铵盐猪脱细胞真皮基质敷料的制备方法，所述制备方法具体步骤如下：
S1、壳聚糖季铵盐的制备：将一定量的壳聚糖（氨基含量为n1）溶于质量浓度为1%的冰乙酸溶液中，制成壳聚糖溶液，再用1mol/L的NaOH溶液调节其pH大于9，使壳聚糖絮状物析出，加入蒸馏水搅拌1h后，3000rpm离心10 min，得到壳聚糖沉淀，然后加入蒸馏水浸没沉淀搅拌1h，测试水的pH值，再用蒸馏水将沉淀洗至中性。将壳聚糖沉淀置于圆底烧瓶中，加入异丙醇（按异丙醇与壳聚糖沉淀体积比为5：1），加热至75℃，反应30min，然后取含环氧基团物质的量为 n2（n1:n2=1:2）的缩水甘油基三甲基氯化铵溶于蒸馏水中，逐滴加入烧瓶中水溶液，75℃反应6h，旋转蒸发除去多余溶剂，然后加入10倍体积的乙醇/丙酮混合液（乙醇与丙酮的体积比为1:1），静置30min，抽滤，滤出沉淀物其置于 60℃真空干燥箱中干燥，即得壳聚糖季铵盐，最后用蒸馏水将壳聚糖季铵盐配制形成质量浓度为5%的壳聚糖季铵盐溶液以备用；
S2、将猪脱细胞真皮基质浸泡于75%乙醇中12h；取出后置于85%乙醇中12h；取出后再置于95%乙醇中12h，再超声处理10min，无菌操作下从浸泡液中取出，紫外照射3h灭菌；
S3、壳聚糖季铵盐猪脱细胞真皮基质敷料的制备:将步骤2中处理所得的猪脱细胞真皮基质浸泡于质量浓度为5%的壳聚糖季铵盐溶液中超声处理2h，重复3次，该过程中壳聚糖季铵盐溶液与猪脱细胞真皮基质的体积比为50:1，完成后在4℃下低温放置24h，取出浸泡后的猪脱细胞真皮基质，用PBS缓冲溶液冲洗数遍后，冷冻干燥即得壳聚糖季铵盐猪脱细胞真皮基质敷料。
实施例3：动物伤口愈合实验
取雄性新西兰兔，40只，每只2~3kg，随机分为四组，每组10只。各兔子均按照临床动物实验烧伤标准模型制备方法均造成手术留下的深II度伤口，其中A组兔子先对伤口进行缝合然后使用干净纱布进行包扎并每隔三天更换一次纱布，B组兔子先对伤口进行缝合然后使用猪脱细胞真皮基质为敷料包扎伤口，C、D组分别敷用本发明实施例1、2的壳聚糖季铵盐猪脱细胞真皮基质敷料，并试验过程无需更换敷料，直到C、D组的创面愈合便结束本次动物实验。
表1 各组动物创面感染及愈合情况(%)
从上述试验可知，仅仅使用干净纱布进行包扎伤口，伤口感染率高，愈合速度慢，且愈合后留下明显的伤痕；
而使用猪脱细胞真皮基质为敷料包扎伤口，虽然提高了伤口愈合时间与减少疤痕产生，但由于愈合过程中伤口容易出现感染，导致愈合速度慢；
分别敷用本发明实施例1、2的壳聚糖季铵盐猪脱细胞真皮基质敷料的C、D两组并未出现红肿、脓液现象，伤口愈合速度快，并且伤口愈合后无疤痕产生，说明本发明具备有持续抗菌能力，且能诱导细胞生长，提高伤口愈合速度，有效减少疤痕产生。
应当指出的是，具体实施方式只是本发明比较有代表性的例子，显然本发明的技术方案不限于上述实施例，还可以有很多变形。本领域的普通技术人员，以本发明所明确公开的或根据文件的书面描述毫无异议的得到的，均应认为是本专利所要保护的范围。