一种盐致相变制备外周神经导管的方法与流程

本发明涉及一种盐致相变制备外周神经导管的方法，具体地说，涉及一种用于外周神经缺损修复导管的制备方法，属于生物医学材料领域。

背景技术：

神经移植是修复周围神经损伤的有效方法。目前较常采用的是自体神经移植，但由于自体神经移植需要对供体进行手术切取、供区易形成神经瘤、疤痕以及神经来源有限等原因，其临床使用受到限制。随着材料学的发展，各种可降解的生物材料被用于制作人工神经导管，以弥补自体神经用于神经移植的不足。其中较常使用的材料包括聚乳酸、聚丙交酯、聚羟基脂肪酸酯及它的共聚物等合成高分子材料；壳聚糖及其衍生物、胶原、丝胶等天然生物材料。合成高分子材料一般具有较好的力学性能，但由于其降解产物呈酸性等原因，会造成移植体周围无菌性感染或炎症。

相比而言，天然大分子材料较合成高分子材料生物相容性更加优良，尤其地，壳聚糖类材料被证实其降解产物壳寡糖具有促进神经干细胞分化的作用(杨宇民等，《壳寡糖对神经干细胞分化的影响》，交通医学,2007,21(6))；但单一的天然可降解高分子材料如壳聚糖或胶原蛋白无法解决本身的力学强度差的弊端，解决的办法主要是与其他合成高分子材料复合或对壳聚糖及其衍生物进行化学交联，如发明专利《一种神经导管支架及其制备方法》(发明专利授权号：CN101474423B)便采用了添加聚乙醇酸来提高导管材料的力学强度；而发明专利《一种可降解的羧甲基壳聚糖复合神经导管的制备方法及应用》(发明专利授权号：ZL201010594628)则对羧甲基壳聚糖通过1，4-丁二醇双缩水甘油醚(BDDE)进行化学交联同时添加聚乙烯醇(PVA)来提高导管的力学强度。因此如何既保留天然可降解高分子的生物学特性同时又保证成分单一、无需引入交联剂等化学物质最终还能提供优良的力学性能便成为神经导管制备方法的发展趋势。

温敏性几丁糖凝胶是一种新型的几丁糖衍生物(专利号ZL200810033699.6)，其主要特点是对温度的高度智能响应，即低温下为流动的液体，当温度升高时则 转变为不流动的凝胶，该特点使其易于注模成型、操作方便；同时还具有其他几丁糖及其衍生物所不具有的特点—盐致相变：(专利申请号：201410007429.3)，即当浸泡于一定离子强度盐溶液时凝胶发生相转变，整个过程凝胶的力学强度发生非常大的提高，该特点可以提高单一天然高分子的力学强度。

基于上述两种特点，本发明提供了一种单一天然可降解高分子组分且具有良好力学强度的神经导管的制备方法，该方法在国内外未见相关报道，且方法操作简便，导管力学强度优良且成分单一无需添加任何的交联剂等化学物质。

创新点

1.本发明采用温敏性几丁糖为原料，且已通过第三方的生物学评价，生物相容性良好；

2.利用盐致相变的物理方法增强单一天然组分神经导管的力学强度，全程不引入任何的有机溶剂；

3.管壁为多孔结构，利于雪旺细胞的黏附和增殖；

4.工艺简单，生产成本较低，利于产品质量控制，易于产业转化。

附图说明

图1导管截面SEM图

图2导管内表面SEM图

图3神经导管拉伸伸长曲线

图4为神经导管压缩性能曲线

图5神经导管内壁雪旺细胞培养3天后SEM图

图6 8周后再生神经甲苯胺蓝染色结果

图7 8周后字体移植神经甲苯胺蓝染色结果

技术实现要素：

本发明为目前神经导管制备中存在的技术问题，采用的技术方案是提供一种盐致相变制备外周神经导管的方法，所述方法包括：制备温敏性几丁糖溶液；低温下将温敏性几丁糖溶液灌装于带芯棒的定型装置中；将所述溶液和定型装置在一定温度下放置，为溶液赋形并进一步形成具有管状结构凝胶；将所述形成凝胶的溶液连同芯棒从定型装置中取出，利用盐致相变原理，置于具有离子强度的盐 溶液中进一步形成具有一定强度的弹性凝胶体；使用纯水清洗所述的弹性凝胶体；将所述的弹性凝胶体真空冷冻干燥，去除芯棒，得到外周神经导管。

本发明为实现神经导管制备，采用一种带芯棒的定型装置，所述芯棒与定型装置连接；所述芯棒采用相变材料涂层、ePTFE涂层或硅油涂层，以方便冷冻干燥后将神经导管与芯棒分离，且不对神经导管内壁结构造成破坏；所述神经导管经冷冻干燥后，其管壁呈现多孔结构，神经导管内径0.5-3mm，长度0.5-40mm。大体步骤如下：

第一步温敏性几丁糖溶液的注模

将所浓度为0.4％-1％(w/v)的温敏性几丁糖溶液低温下灌至带芯棒的定型装置中。

第二步温敏性几丁糖溶液凝胶化赋形

将灌注好的温敏性几丁糖溶液在温度为20-60℃的环境下放置10-60min进行凝胶化和赋形。

第三步盐致相转变

将凝胶化赋形好的凝胶放入浓度为0.5％-5％的CH₃COONa、CH₃COONH₄、NaCl、Na₂HPO₄、NaH₂PO₄、Na₂SO₄、Na₂CO₃或NaHCO₃、等的一种或一种以上混合盐溶液中浸泡12-48h后得到弹性凝胶体。

第四步神经导管的清洗

将弹性凝胶转入纯化水中，采用采用静态浸洗、超声波清洗或机械振动方式清洗10-60分钟，得到神经导管中间品。

第五步冷冻干燥和灭菌

将神经导管中间品放入冷冻干燥机中进行干燥，得到几丁糖神经导管，最后通过⁶⁰Co辐照灭菌得到神经导管成品。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步的描述。

实施例一：

以浓度为0.4％的温敏性几丁糖溶液为原料，制备内径为0.5mm，长度为1mm的神经导管，具体步骤为：将羟丁基原料置入特制模具中，40℃放置10min，待溶液形成凝胶并具有一定强度后，将芯棒与凝胶一起取出置于0.5％(w/v)NaCl溶液中收缩12h。将样品取出-20℃预冻后，冷冻干燥12h。去除芯棒⁶⁰Co辐照灭菌即成温敏性几丁糖神经导管。

实施例二：

以浓度为0.8％的温敏性几丁糖溶液为原料，制备内径为1mm，长度为10mm的神经导管，具体步骤为：将羟丁基原料置入特制模具中，20℃放置60min，待溶液形成凝胶并具有一定强度后，将芯棒与凝胶一起取出置于2.5％(w/v)CH₃COONH₄溶液中收缩48h。将样品取出-30℃预冻后，冷冻干燥18h。去除芯棒⁶⁰Co辐照灭菌即成温敏性几丁糖神经导管。

实施例三：

以浓度为1％的温敏性几丁糖溶液为原料，制备内径为3mm，长度为40mm的神经导管，具体步骤为：将羟丁基原料置入特制模具中，60℃放置40min，待溶液形成凝胶并具有一定强度后，将芯棒与凝胶一起取出置于5％(w/v)Na₂HPO₄和CH₃COONa溶液中收缩24h。将样品取出-40℃预冻后，冷冻干燥24h。去除芯棒60Co辐照灭菌即成温敏性几丁糖神经导管。

实施例四

将实施例三中制备的样品，进行液氮脆断，通过扫描电镜进行断面和内表面的SEM观察，结果现实本发明制备的神经导管具有丰富的多孔结构(图1)，有利于神经损伤修复过程中营养物质和氧气的交换，更好地促进神经的再生和功能修复，同时内表面也具有丰富的多孔结构(图2)，粗糙的表面有利于雪旺细胞的黏附和增殖。

将实施例三中制备的样品上截取3cm样品进行测试。将样品固定在拉力测试机上，调整预加张力使样品恰好伸直但无拉伸。以20mm/min的速度进行拉伸直至样品断裂。记录神经导管的拉伸伸长率(结果见图3)；结果显示本发明制 备的神经导管具有良好的力学强度，弹性性能优良，断裂时伸长率可达到300％以上，该特性确保了临床使用过程中良好的操作性，同时良好的弹性张力有利于雪旺细胞的增殖和神经损伤的修复。

实施例五

从实施例三制备的样品上截取2cm样品进行测试。将样品置于下测试平台，调整上测试平台恰好与样品接触。上测试平台以2mm/min速度匀速下降，下降距离为样品直径50％时上夹持平台返回原位，重复测试5次(图4)；结果显示本发明制备的神经导管具有良好的压缩回复性能，多次重复压缩后仍能回复，保证了使用过程中不被周围组织所压瘪，有利于神经的修复和功能恢复。

实施例六

从实施例二制备的样品中任取样品，沿纵向剖开、裁剪尺寸并置于96孔板中，导管内壁向上。酒精浸泡4h后PBS洗涤3次，紫外灯照射。雪旺细胞以1500/孔的密度种植于导管内壁上。培养3天后，SEM观察雪旺细胞在神经导管内壁的生长情况。(图5)，结果现实本发明制备的神经导管能够促进雪旺细胞的黏附和增殖。

实施例七

选用20只雄性SD大鼠(180～220g),采用1％戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔注射麻醉。大鼠左股后外侧行纵形切口,自肌间隙进入显露坐骨神经约2.5cm。于坐骨神经中段切取12mm，任其回缩到15mm，采用实施例三中制得的神经导管桥接神经缺损，二端分别套入1mm，10-0尼龙线3针固定。手术均在显微镜下完成，术后常规饲养。分别于术后4、8、12、16周取材检测(再生神经的甲苯胺蓝染色结果如图6所示)。

实验发现，在术后8周，缺损部位已经有新生神经，甲苯胺蓝染色结果显示再生的神经纤维均一有序，与自体移植神经相似(图7)，表明本发明制备的神经导管能很好地促进神经的损伤修复。

虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，当可做些许的修改和完善，因此本发明的保护范围以权利要求书所界定的为准。