本发明涉及一种水稻育秧土的灭菌方法。
背景技术：
随着东北地区稻区连年种植水稻，每年春季都在相同的区域培育水稻秧苗，在土壤中生存一些镰刀菌、丝核菌、藻菌等容易引起立枯病等病害的病菌，为防止发生立枯病等苗床疾病，必须通过土壤消毒才能将它们抑制，达到抗病的目的。
土壤消毒剂是一种低毒广谱性杀菌农药，具有内吸和传导性，通过对病原菌的侵蚀作用达到杀菌防病的目的。在苗床土壤中混拌杀菌剂，由于连年相同区域施用杀菌剂，土壤中病菌产生抗药性，杀菌剂越施越多，即使这样每年春季不同稻区都有大量水稻苗床由于病菌感染，产生大面积染病，甚至水稻秧苗死亡。施用杀菌剂后，很大一部分残留在土壤中，造成土壤的污染，土壤养分随污染程度的加重而减小，土壤孔隙度变小，从而造成土壤板结。
保证水稻秧苗存活，提高水稻秧苗素质，是广大农业科技工作者不懈努力的目标，这也是稻区种植水稻农民的最大要求和期盼。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种水稻育秧土的微波灭菌方法。该方法属于物理杀菌方法，微波杀菌穿透性好，可以抑制及杀灭病菌，处理时间短，杀菌效果好，能够保证水稻秧苗存活，提高水稻秧苗素质。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种水稻育秧土的微波灭菌方法，具体实施步骤如下：
水稻育秧土进行播种之前，对土壤进行微波灭菌处理，控制微波功率为500～1000W，波长为100～150mm，时间为2.5～50min。
本发明具有如下优点：
1、本发明采用物理方法(微波杀菌)，利用微波将水稻苗床土壤中病菌杀死，取代传统的化学杀菌剂预防水稻苗床疾病的发生。根据试验微波杀菌效果远好于杀菌剂效果，有很好的推广空间。
2、本发明符合国家提出的在农业种植中“三减”要求，此方法减少了农药(杀菌剂)的使用。
3、此方法对种植绿色有机水稻，从源头上防止水稻种植过程中农药的使用，也是生产绿色有机大米的重要保障。
4、此方法非常有利于提高稻区农民在苗床培育水稻壮苗，是预防苗床秧苗疾病发生的一种最新方式。
具体实施方式
下面对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。
本发明提供了一种水稻育秧土的微波灭菌方法，具体包括以下内容：
第一阶段实验
一、实验原理：
由于微生物营养类型不同，应提供不同种类的培养基。在分离、培养异养微生物时，对一般细菌常用牛肉膏蛋白胨培养基、对放线菌常用高氏1号培养基，培养酵母菌、霉菌则用麦芽汁或豆芽汁葡萄糖培养基、马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基，有时也常用马丁培养基分离霉菌。
本实验用到PDA、高氏1号和牛肉膏-蛋白胨培养基，把经过微波、灭菌处理的土壤分别接种到三种培养基上，通过观察可得出微波灭菌的效果。
二、培养基的配制：
1、PDA培养基
(1)实验试剂
马铃薯(去皮)200g、葡萄糖20g、水1000ml、琼脂20g、纱布、玻璃棒、1000ml烧杯、万用电子炉、立式压力蒸汽灭菌器、电磁搅拌器。
(2)实验步骤
将马铃薯去皮，切成2cm厚片，加水1000ml煮沸30min(马铃薯软化不碎，用玻璃棒可戳破)，趁热两层纱布过滤，收集滤液于1000ml烧杯，继续加热，依次加入葡萄糖20g和琼脂20g(边加边搅拌)，充分溶解后稍冷却再补水至1000ml，分装试管，每支试管约5～10ml(视试管大小而定)，加塞，高温高压蒸汽灭菌30min后取出试管摆斜面静置12h后备用。
2、高氏1号培养基
(1)实验试剂
可溶性淀粉20g、NaCl0.5g、KNO31g、K2HPO40.5g、MgSO40.5g、FeSO40.01g、琼脂20g、水1000ml、电磁搅拌器、万用电子炉、立式压力蒸汽灭菌器
(2)实验步骤
按配方准确称取可溶性淀粉20g，加水1000ml加热至淀粉完全溶解。再称取其他各成分依次逐一溶化。FeSO4可先配制成高浓度溶液再加入(在100ml水中加入1gFeSO4配制成0.01g/ml)加入1ml于培养基溶液中。待所有试剂完全溶解后，补水至1000ml，分装试管，每支试管约5～10ml(视试管大小而定)，加塞，高温高压蒸汽灭菌30min后取出试管摆斜面静置12h后备用。
3、牛肉膏蛋白胨培养基
(1)实验试剂
牛肉膏3、蛋白胨10g、氯化钠5g、琼脂20g、水1000ml、万用电子炉、立式压力蒸汽灭菌器、电磁搅拌器。
(2)实验步骤
准确称取牛肉膏、蛋白胨、氯化钠放入烧杯中(牛肉膏常用玻璃棒挑取，放在称量纸上一同放入烧杯中，受热分离后用玻璃棒挑出称 量纸)。上述烧杯中可先加入少于所需要的水量，用玻璃棒搅匀，在石棉网上加热使其溶解，待完全溶解后，补水至1000ml，分装试管，每支试管约5～10ml(视试管大小而定)，加塞，高温高压蒸汽灭菌30min后取出试管摆斜面静置12h后备用。
三、土壤微波处理
1、将细土装到聚丙烯塑料袋中(10cm高)，分装5份，经微波灭菌1min、1.5min、2.0min、2.5min、3.0min。
2、按时间梯度，每样培养基分别做4个重复实验。
四、菌种转接
1、实验器材
(1)菌种
微波处理土壤
(2)培养基
PDA培养基、高氏1号培养基、牛肉膏蛋白胨培养基。
(3)其他
接种针(环)、酒精灯、火柴、记号笔、标签纸。
2、实验方法与步骤
(1)斜面接种技术
①贴标签
接种前在试管上贴上标签，注明菌种、接种日期、接种人姓名等，贴在距试管口2～3cm的位置。
②清理无菌净化台
用酒精棉(78％酒精)擦拭台面及净化台两侧，将接种针(环)、酒精灯、火柴、记号笔、标签纸和带有培养基的试管放入净化台内，关闭净化台拉窗，接通电源，开启紫外线杀菌20min。双手进入净化台操作前要立即用酒精棉擦拭杀菌，微波灭菌处理后的土样移放到净化台内后，要立即用酒精棉全方位擦拭。
③点燃酒精灯
根据操作规范点燃酒精灯。
④接种
用接种环将少许土样移接到贴好标签的试管斜面上。必须按无菌操作法进行。
(a)手持试管
将待接斜面试管握在左手中，斜面向上。
(b)旋松管塞
先用右手松动棉塞或胶塞，以便接种时拔出。
(c)取接种环
右手拿接种环，在火焰上将环端灼烧灭菌，然后将有可能伸入试管的其余部分灼烧灭菌，重复此操作，再灼烧一次。
(d)拔管塞
用右手的无名指、小手指和手掌边取下试管塞，然后让试管口缓缓过火灭菌(切勿烧得过烫)。
(e)取菌
待接种环冷却后，插入土样中心处(下插5cm)，挑取少量土样，取出后不可使带菌接种环通过火焰。
(f)接种
在火焰旁迅速将沾有土样的接种环伸入待接斜面试管。从斜面培养基的底部向上作Z形来回密集划线，切勿划破培养基。有时也可用接种环仅在斜面培养基的中央拉一条直线作斜面接种，直线接种可观察不同菌种的生长特点。
(g)塞管塞
取出接种环，灼烧试管口，并在火焰旁将管塞旋上。塞棉塞时，不要用试管去迎接棉塞，以免试管在移动时纳入不洁空气。
(h)灼烧灭菌
将接种环灼烧灭菌，放下接种环，再将棉花棉花塞旋紧。
⑤培养
将接种好的培养基在室温下培养(也可在生化培养箱28℃或37℃培养)。
五、观察记录
1、培养基接种时间：2016年7月6日15:40。
2、观察数据：
表1
地点：实验室 观察时间：2016.07.07 09:00
表2
地点：实验室 观察时间：2016.07.07 15:00
表3
地点：实验室 观察时间：2016.07.08 09:52
表4
地点：实验室 观察时间：2016.07.09 15:20
表5
地点：实验室 观察时间：2016.07.09 09:17
表6
地点：实验室 观察时间：2016.07.09 09:17
注：2016.07.07.15:00，在高氏1号培养基中，培养基斜面与试管壁除出现气泡。
六、实验总结
(一)结果分析
1、根据表1～5的实验数据分析，微波杀菌很难彻底杀灭细菌，对霉菌等真菌杀灭效果明显。
2、微波处理土样在2.5min、3.0min时，对细菌有较大杀伤效果。
3、除细菌外没有发现真菌、放线菌的存在。
4、微波处理3min后12h出现细菌，但后来有出现细菌感染的情况可能是由于微波无法杀死细菌芽孢，芽孢经一段时间后成活的原因。
(二)改进意见
1、上一步实验所需改进的方面：
(1)用电磁搅拌器代替玻璃棒搅拌；
(2)PDA培养基全部用胶塞用以区分牛肉膏蛋白胨培养基。
2、下一步实验需要的东西：
土样、电磁搅拌器、聚丙烯塑料袋(大小规格都要)。
第二阶段实验
1、根据第一阶段实验数据分析，第二阶段的实验依然是对土样进行微波处理，时间1min内，依次取10s、20s、30s、40s、50s。
2、培养基的配制及接种操作同第一阶段。
3、接种时间2016年7月14日17:15。
一、微波灭菌处理土样
表7
地点：实验室 观察时间：2016.07.15 08:57
表8
地点：实验室 观察时间：2016.07.15 15:07
表9
地点：实验室 观察时间：2016.07.16 09:26
表10
地点：实验室 观察时间：2016.07.16 15:02
表11
地点：实验室 观察时间：2016.07.17 09:00
表12
地点：实验室 观察时间：2016.07.17 15:45
表13
地点：实验室 观察时间：2016.07.18 09:10
表14
地点：实验室 观察时间：2016.07.18 14:56
表15
地点：实验室 观察时间：2016.07.19 09:15
表16
地点：实验室 观察时间：2016.07.19 15:09
二、结果分析
1、2016.07.15 08:57，PDA与牛肉膏蛋白胨培养基全部出现细菌，2016.07.16 09:26出现真菌。
2、2016.07.16 09:26，高氏1号培养基出现细菌，同天下午15:02出现真菌。
3、随微波灭菌时间的增加，对细菌和真菌的灭菌效果越好。