本发明公开了一种诱骨发育型医用骨水泥的制备方法，属于医用材料制备技术领域。
背景技术：
骨质疏松性骨折是老年人最常见的脊柱疾患之一，因骨质随着年龄的增加而变脆，即使轻度创伤甚至无创伤也可引发骨折。急性骨折及骨折不愈合可引起疼痛，多节段骨折可导致进行性畸形及身高缩短，更为严重的，骨折碎片压迫脊髓可造成下肢瘫痪。
骨水泥是一种用于填充骨与植入物间隙或骨腔并具有自凝特性的生物材料，由于它的部分物理性质以及凝固后外观和性状颇像建筑装修用的白水泥，便有了如此名称。目前，骨水泥在面部整容修复以及脊椎修复成型方面应用广泛，具有重要的应用价值。
目前骨水泥作为骨填充、修复材料已经在临床上大量应用，其主要包括以聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥为代表的第一代骨水泥和第二代磷酸钙骨水泥。第一代骨水泥存在生物相容性差、凝固聚合过程中大量放热、单体的细胞毒性作用、可操作时间有限等问题，而第二代磷酸钙骨水泥克服了第一代骨水泥生物相容性差、凝固聚合过程中大量放热、单体细胞毒性作用、可操作时间有限等问题，但磷酸钙骨水泥的固化是基于磷酸钙盐间的酸碱反应（即水化作用）进行的，在固化过程中发生酸碱反应会引起骨水泥周围体液pH值的改变，同时抗压强度比较低，可注射时间较短、缺乏骨诱导活性。
技术实现要素：
本发明主要解决的技术问题：针对现有的医用骨水泥存在固化过程中，发生酸碱反应会引起骨水泥周围体液pH值的改变，同时抗压强度比较低，可注射时间较短、缺乏骨诱导活性的缺陷，提供了一种通过水解制备的牛骨胶原蛋白多肽负载至珍珠蚌贝壳的粉末孔隙中，通过孔隙结构与珍珠蚌贝壳粉末刺激成骨细胞，扩大孔隙中细胞与牛骨蛋白多肽的接触，再通过珍珠蚌贝壳粉精确调控碳酸钙晶体的成核，有效诱导成骨细胞发育，从而制得诱骨发育型医用骨水泥的方法，本发明先将牛骨碾磨成粉后浸泡除杂得除杂牛骨粉末，随后将其与去离子水、胰蛋白酶加热过滤并收集滤液冷干，再碾磨收集得牛骨胶原蛋白水解粉末，将三角帆蚌贝壳清洗晾干后与氢氧化钠溶液加热过滤，将滤饼晾去除黑皮并干燥，收集所得干燥预处理珍珠蚌贝壳球磨过筛得珍珠蚌贝壳粉末，再将牛骨胶原蛋白水解粉末、壳聚糖等混合后与甘油磷酸钠等改性处理，最后将所得混合改性液与珍珠蚌贝壳粉末超声处理，将所得混合浆液紫外灭菌即可得一种诱骨发育型医用骨水泥，本发明制得的骨水泥具有抗菌、可注射性好、抗压强度高的优点，同时还具有良好的生物相容性、可降解性及生物活性，可以用于多种骨折固定和骨缺损的填充修复，具有广阔的应用前景。
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：
（1）收集新鲜牛骨，将其置于45～50℃下下干燥6～8h，随后碾磨并过300目筛，收集牛骨粉末，按质量比1:10，将牛骨粉末与质量分数0.5%氢氧化钠溶液搅拌混合，在室温下浸泡20～24h后，过滤并收集滤饼，用质量分数10%氯化钠溶液冲洗5～8次后，再用去离子水冲洗3～5次，在45～50℃下干燥6～8h，制备得除杂牛骨粉末；
（2）按重量份数计，分别称量45～50份去离子水、10～15份除杂牛骨粉末和3～5份胰蛋白酶置于烧杯中，在45～50℃下水浴加热2～3h，随后过滤并收集滤液，真空冷冻干燥，碾磨并收集得牛骨胶原蛋白水解粉末，备用；
（3）选取三角帆蚌贝壳，用清水冲洗并自然晾干，得干燥贝壳，按质量比1:8，将干燥贝壳置于质量份数10%氢氧化钠溶液中，在45～50℃下水浴加热6～8h；
（4）待水浴加热完成后，过滤并收集滤饼得碱浸贝壳，用去离子水洗涤至洗涤液呈中性，自然晾干后，用刀将贝壳外层黑皮刮去，在65～70℃下干燥6～8h，收集得干燥预处理贝壳，将干燥预处理贝壳破碎并收集贝壳碎片，将贝壳碎片置于球磨罐中，在250～300r/min下球磨3～5h，随后过300目筛，收集得贝壳粉末，备用；
（5）按质量比1：5：10，将步骤（2）备用的牛骨胶原蛋白水解粉末、壳聚糖与质量分数5%醋酸溶液搅拌混合，在0～5℃下冰水浴处理25～30min，随后静置脱泡6～8h，收集得混合液，按质量比1:10，将甘油磷酸钠添加至混合液中，在室温下搅拌混合10～15min后，分别用质量分数30%醋酸溶液和5%氢氧化钠溶液调节pH至7.0，制备得混合改性液；
（6）按质量比1:5，将步骤（4）备用的贝壳粉末与上述制备的混合改性液搅拌混合，在200～300W下超声分散10～15min，再在0～5℃下静置40～48h，收集得混合浆液，随后将混合浆液紫外灭菌处理15～20min，即可制备得一种诱骨发育型医用骨水泥。
本发明的应用方法是：首先按质量比1:40～1:80，将粉剂抗生素与本发明制得的诱骨发育型医用骨水泥倒入消毒后的器皿中，并用骨水泥搅拌棒以80～100r/min搅拌混合40～50s，随后将搅拌均匀的骨水泥混合物倒入骨水泥注入器中，根据患者骨缺损的形状和大小，将骨水泥材料填充到患者骨缺损部位，在注射完毕后辅以钢板螺钉内固定，待骨水泥静置固化8～10min后，再以医用明胶海绵覆盖患者伤口并进行缝合处理，每天给予患者伤口术后抗炎治疗，定期复查指导康复，了解骨愈合及人工骨吸收情况，直至治愈即可。经检测，骨水泥孔隙率可达10～30%，抗压强度达40～60MPa，同时本发明骨水泥凝固时间为15～30min，可注射时间长，可注射性较好，固化过程放热极低，在21～23℃环境下固化时其最高温度仅为23.5℃，且本发明骨水泥具有较好的生物相容性和骨诱导活性，植入患者体内后，未出现不适症状，能有效促进患者伤口愈合，提高骨水泥与人骨的结合强度，使患者康复周期缩短了30～40天。
本发明的有益效果是：
（1）本发明制得的诱骨发育型医用骨水泥具有较高的抗压强度，同时骨水泥在固化过程不依靠酸碱反应，不会引起周围体液pH值的改变，具有良好的生物相容性及骨诱导活性；
（2）本发明制得的诱骨发育型医用骨水泥初凝时间合理，可注射性好，有利于骨细胞的长入，提高骨水泥与人骨的结合强度，能满足临床应用的要求，可适用于硬组织骨的缺损修复、骨质疏松的治疗及骨折的固定和治疗。
具体实施方式
首先收集新鲜牛骨，将其置于45～50℃下下干燥6～8h，随后碾磨并过300目筛，收集牛骨粉末，按质量比1:10，将牛骨粉末与质量分数0.5%氢氧化钠溶液搅拌混合，在室温下浸泡20～24h后，过滤并收集滤饼，用质量分数10%氯化钠溶液冲洗5～8次后，再用去离子水冲洗3～5次，在45～50℃下干燥6～8h，制备得除杂牛骨粉末；随后按重量份数计，分别称量45～50份去离子水、10～15份除杂牛骨粉末和3～5份胰蛋白酶置于烧杯中，在45～50℃下水浴加热2～3h，随后过滤并收集滤液，真空冷冻干燥，碾磨并收集得牛骨胶原蛋白水解粉末，备用；再选取三角帆蚌贝壳，用清水冲洗并自然晾干，得干燥贝壳，按质量比1:8，将干燥贝壳置于质量份数10%氢氧化钠溶液中，在45～50℃下水浴加热6～8h；待水浴加热完成后，过滤并收集滤饼得碱浸贝壳，用去离子水洗涤至洗涤液呈中性，自然晾干后，用刀将贝壳外层黑皮刮去，在65～70℃下干燥6～8h，收集得干燥预处理贝壳，将干燥预处理贝壳破碎并收集贝壳碎片，将贝壳碎片置于球磨罐中，在250～300r/min下球磨3～5h，随后过300目筛，收集得贝壳粉末，备用；再按质量比1：5：10，将上述步骤备用的牛骨胶原蛋白水解粉末、壳聚糖与质量分数5%醋酸溶液搅拌混合，在0～5℃下冰水浴处理25～30min，随后静置脱泡6～8h，收集得混合液，按质量比1:10，将甘油磷酸钠添加至混合液中，在室温下搅拌混合10～15min后，分别用质量分数30%醋酸溶液和5%氢氧化钠溶液调节pH至7.0，制备得混合改性液；最后按质量比1:5，将步骤（4）备用的贝壳粉末与上述制备的混合改性液搅拌混合，在200～300W下超声分散10～15min，再在0～5℃下静置40～48h，收集得混合浆液，随后将混合浆液紫外灭菌处理15～20min，即可制备得一种诱骨发育型医用骨水泥。
实例1
首先收集新鲜牛骨，将其置于45℃下下干燥6h，随后碾磨并过300目筛，收集牛骨粉末，按质量比1:10，将牛骨粉末与质量分数0.5%氢氧化钠溶液搅拌混合，在室温下浸泡20h后，过滤并收集滤饼，用质量分数10%氯化钠溶液冲洗5次后，再用去离子水冲洗3次，在45℃下干燥6h，制备得除杂牛骨粉末；随后按重量份数计，分别称量45份去离子水、10份除杂牛骨粉末和3份胰蛋白酶置于烧杯中，在45℃下水浴加热2h，随后过滤并收集滤液，真空冷冻干燥，碾磨并收集得牛骨胶原蛋白水解粉末，备用；再选取三角帆蚌贝壳，用清水冲洗并自然晾干，得干燥贝壳，按质量比1:8，将干燥贝壳置于质量份数10%氢氧化钠溶液中，在45℃下水浴加热6h；待水浴加热完成后，过滤并收集滤饼得碱浸贝壳，用去离子水洗涤至洗涤液呈中性，自然晾干后，用刀将贝壳外层黑皮刮去，在65℃下干燥6h，收集得干燥预处理贝壳，将干燥预处理贝壳破碎并收集贝壳碎片，将贝壳碎片置于球磨罐中，在250r/min下球磨3h，随后过300目筛，收集得贝壳粉末，备用；再按质量比1：5：10，将上述步骤备用的牛骨胶原蛋白水解粉末、壳聚糖与质量分数5%醋酸溶液搅拌混合，在0℃下冰水浴处理25min，随后静置脱泡6h，收集得混合液，按质量比1:10，将甘油磷酸钠添加至混合液中，在室温下搅拌混合10min后，分别用质量分数30%醋酸溶液和5%氢氧化钠溶液调节pH至7.0，制备得混合改性液；最后按质量比1:5，将上述备用的贝壳粉末与上述制备的混合改性液搅拌混合，在200W下超声分散10min，再在0℃下静置40h，收集得混合浆液，随后将混合浆液紫外灭菌处理15min，即可制备得一种诱骨发育型医用骨水泥。
本实例操作简便，使用时，首先按质量比1:40，将粉剂抗生素与本发明制得的诱骨发育型医用骨水泥倒入消毒后的器皿中，并用骨水泥搅拌棒以80r/min搅拌混合40s，随后将搅拌均匀的骨水泥混合物倒入骨水泥注入器中，根据患者骨缺损的形状和大小，将骨水泥材料填充到患者骨缺损部位，在注射完毕后辅以钢板螺钉内固定，待骨水泥静置固化8min后，再以医用明胶海绵覆盖患者伤口并进行缝合处理，每天给予患者伤口术后抗炎治疗，定期复查指导康复，了解骨愈合及人工骨吸收情况，直至治愈即可。经检测，骨水泥孔隙率可达10%，抗压强度达40MPa，同时本发明骨水泥凝固时间为15min，可注射时间长，可注射性较好，固化过程放热极低，在21℃环境下固化时其最高温度仅为23.5℃，且本发明骨水泥具有较好的生物相容性和骨诱导活性，植入患者体内后，未出现不适症状，能有效促进患者伤口愈合，提高骨水泥与人骨的结合强度，使患者康复周期缩短了30天。
实例2
首先收集新鲜牛骨，将其置于48℃下下干燥7h，随后碾磨并过300目筛，收集牛骨粉末，按质量比1:10，将牛骨粉末与质量分数0.5%氢氧化钠溶液搅拌混合，在室温下浸泡22h后，过滤并收集滤饼，用质量分数10%氯化钠溶液冲洗6次后，再用去离子水冲洗4次，在48℃下干燥7h，制备得除杂牛骨粉末；随后按重量份数计，分别称量48份去离子水、13份除杂牛骨粉末和4份胰蛋白酶置于烧杯中，在48℃下水浴加热2h，随后过滤并收集滤液，真空冷冻干燥，碾磨并收集得牛骨胶原蛋白水解粉末，备用；再选取三角帆蚌贝壳，用清水冲洗并自然晾干，得干燥贝壳，按质量比1:8，将干燥贝壳置于质量份数10%氢氧化钠溶液中，在48℃下水浴加热7h；待水浴加热完成后，过滤并收集滤饼得碱浸贝壳，用去离子水洗涤至洗涤液呈中性，自然晾干后，用刀将贝壳外层黑皮刮去，在68℃下干燥7h，收集得干燥预处理贝壳，将干燥预处理贝壳破碎并收集贝壳碎片，将贝壳碎片置于球磨罐中，在275r/min下球磨4h，随后过300目筛，收集得贝壳粉末，备用；再按质量比1：5：10，将上述步骤备用的牛骨胶原蛋白水解粉末、壳聚糖与质量分数5%醋酸溶液搅拌混合，在3℃下冰水浴处理28min，随后静置脱泡7h，收集得混合液，按质量比1:10，将甘油磷酸钠添加至混合液中，在室温下搅拌混合13min后，分别用质量分数30%醋酸溶液和5%氢氧化钠溶液调节pH至7.0，制备得混合改性液；最后按质量比1:5，将上述备用的贝壳粉末与上述制备的混合改性液搅拌混合，在200W下超声分散10min，再在0℃下静置40h，收集得混合浆液，随后将混合浆液紫外灭菌处理15min，即可制备得一种诱骨发育型医用骨水泥。
本实例操作简便，使用时，首先按质量比1:60，将粉剂抗生素与本发明制得的诱骨发育型医用骨水泥倒入消毒后的器皿中，并用骨水泥搅拌棒以90r/min搅拌混合45s，随后将搅拌均匀的骨水泥混合物倒入骨水泥注入器中，根据患者骨缺损的形状和大小，将骨水泥材料填充到患者骨缺损部位，在注射完毕后辅以钢板螺钉内固定，待骨水泥静置固化9min后，再以医用明胶海绵覆盖患者伤口并进行缝合处理，每天给予患者伤口术后抗炎治疗，定期复查指导康复，了解骨愈合及人工骨吸收情况，直至治愈即可。经检测，骨水泥孔隙率可达20%，抗压强度达50MPa，同时本发明骨水泥凝固时间为23min，可注射时间长，可注射性较好，固化过程放热极低，在22℃环境下固化时其最高温度仅为23.5℃，且本发明骨水泥具有较好的生物相容性和骨诱导活性，植入患者体内后，未出现不适症状，能有效促进患者伤口愈合，提高骨水泥与人骨的结合强度，使患者康复周期缩短了35天。
实例3
首先收集新鲜牛骨，将其置于50℃下下干燥8h，随后碾磨并过300目筛，收集牛骨粉末，按质量比1:10，将牛骨粉末与质量分数0.5%氢氧化钠溶液搅拌混合，在室温下浸泡24h后，过滤并收集滤饼，用质量分数10%氯化钠溶液冲洗8次后，再用去离子水冲洗5次，在50℃下干燥8h，制备得除杂牛骨粉末；随后按重量份数计，分别称量50份去离子水、15份除杂牛骨粉末和5份胰蛋白酶置于烧杯中，在50℃下水浴加热3h，随后过滤并收集滤液，真空冷冻干燥，碾磨并收集得牛骨胶原蛋白水解粉末，备用；再选取三角帆蚌贝壳，用清水冲洗并自然晾干，得干燥贝壳，按质量比1:8，将干燥贝壳置于质量份数10%氢氧化钠溶液中，在50℃下水浴加热8h；待水浴加热完成后，过滤并收集滤饼得碱浸贝壳，用去离子水洗涤至洗涤液呈中性，自然晾干后，用刀将贝壳外层黑皮刮去，在70℃下干燥8h，收集得干燥预处理贝壳，将干燥预处理贝壳破碎并收集贝壳碎片，将贝壳碎片置于球磨罐中，在300r/min下球磨5h，随后过300目筛，收集得贝壳粉末，备用；再按质量比1：5：10，将上述步骤备用的牛骨胶原蛋白水解粉末、壳聚糖与质量分数5%醋酸溶液搅拌混合，在5℃下冰水浴处理30min，随后静置脱泡8h，收集得混合液，按质量比1:10，将甘油磷酸钠添加至混合液中，在室温下搅拌混合15min后，分别用质量分数30%醋酸溶液和5%氢氧化钠溶液调节pH至7.0，制备得混合改性液；最后按质量比1:5，将上述备用的贝壳粉末与上述制备的混合改性液搅拌混合，在300W下超声分散15min，再在5℃下静置48h，收集得混合浆液，随后将混合浆液紫外灭菌处理20min，即可制备得一种诱骨发育型医用骨水泥。
本实例操作简便，使用时，首先按质量比1:80，将粉剂抗生素与本发明制得的诱骨发育型医用骨水泥倒入消毒后的器皿中，并用骨水泥搅拌棒以100r/min搅拌混合50s，随后将搅拌均匀的骨水泥混合物倒入骨水泥注入器中，根据患者骨缺损的形状和大小，将骨水泥材料填充到患者骨缺损部位，在注射完毕后辅以钢板螺钉内固定，待骨水泥静置固化10min后，再以医用明胶海绵覆盖患者伤口并进行缝合处理，每天给予患者伤口术后抗炎治疗，定期复查指导康复，了解骨愈合及人工骨吸收情况，直至治愈即可。经检测，骨水泥孔隙率可达30%，抗压强度达60MPa，同时本发明骨水泥凝固时间为30min，可注射时间长，可注射性较好，固化过程放热极低，在23℃环境下固化时其最高温度仅为23.5℃，且本发明骨水泥具有较好的生物相容性和骨诱导活性，植入患者体内后，未出现不适症状，能有效促进患者伤口愈合，提高骨水泥与人骨的结合强度，使患者康复周期缩短了40天。