可注射温敏磁性纳米乳凝胶、其制备方法及其应用与流程

本发明属于生物与医学纳米材料及技术领域，具体涉及一种可注射温敏磁性纳米乳凝胶的制备方法及其应用。

背景技术：

纳米乳，是由水、油、表面活性剂和助表面活性剂按适当比例形成的粒径为10-100nm的热力学稳定体系，主要分型为油包水型、水包油型及双连续型。其乳滴多为球形，尺寸均一，外观为透明或者略带乳光的液体。纳米乳主要制备方法有剪切搅拌法、高压均质机匀浆法、超声法和相转变法等，易于制备，操作简便，久置不分层、不破乳，可过滤灭菌。作为新型药物载体，纳米乳尺寸较小，易于躲避网状内皮系统的吞噬，延长在血液中的循环时间，通过抗体、配体等的修饰，可以使其具备主动靶向功能；其特定结构可大幅度提高难溶性药物的包封率，可作为脂溶性药物的载体。纳米乳技术在药剂研发、药物载体、缓释和靶向给药等领域显示出其诱人的应用前景。

水凝胶是具有亲水基团，在水中溶胀却不溶于水的三维网络聚合物。水凝胶材料用于人体组织后，可防止体外微生物的感染，有效的防止体液的损失，能够维持控制释放包埋在水凝胶中的药物，从而发挥疗效，促进伤口的愈合。近年来，水凝胶作为一种具有巨大潜力的药物传送系统在全世界范围内得到大力研究开发。智能水凝胶是能对外界温度、pH、光、特定生物分子等微小的变化或刺激有显著响应的具有三维网络结构的亲水性聚合物。此特点使其具有一系列传统材料所不具有的杰出性能，对生理环境敏感的药物控制释放智能水凝胶更是一类极具研究价值的载体。其中温敏凝胶是通过温度升高改变分子间作用力，使聚合物之间相互作用发生改变而得以凝胶化的一类凝胶。温敏凝胶可以以溶液状态给药，利用高分子材料对外界温度的响应发生相转变，转化为非化学交联凝胶，以增加药物的溶解性、保护药物的活性、促进药物吸收、提高药物的溶解度和稳定性，在人体内产生控释、缓释、靶向、降低毒性等特点，在药学领域中发挥着重要的作用，成为近年来的研究热点。

肿瘤热疗是一个古老而又新鲜的话题,它是一种利用各种致热源的热效应使人体全身或局部加热，使肿瘤组织温度上升到有效治疗温度范围，并维持一定时间，使肿瘤组织发生即时性的代谢反应,引起肿瘤细胞线粒体膜、溶酶体膜、内质网膜等结构的破坏，溶酶体酸性水解酶大量释放,从而达到杀灭肿瘤细胞,治疗肿瘤的目的。常用的热疗方法有射频、微波、激光、隔离灌注、磁感应热疗等。近20年来，随着临床热疗设备的不断革新和技术的不断进步，热疗发展迅速。在众多的热疗技术中，磁感应热疗为肿瘤治疗带来了新突破,尤其是基于磁性纳米材料的磁感应热疗，它利用磁性纳米颗粒进入肿瘤组织后，在外加交变磁场的作用下，磁介质由于尼尔弛豫(Néel Relaxation)和布朗弛豫(Brownian Relaxation)效应而发热，使肿瘤组织快速达到一定的温度而杀灭或诱导肿瘤细胞凋亡。同时还能激发主动免疫，远位效应使得免疫系统攻击远端的肿瘤区域，从而达到治疗恶性肿瘤的效果，磁感应热疗因其特有的靶向、微创、无毒副作用、疗效明显等优点受到了众多研究者的青睐并开始进入临床试验。

基于磁性纳米材料的磁感应热疗主要给药方式为静脉注射和瘤内注射两种。静脉注射是通过在体内长循环，利用肿瘤增强渗透滞留效应(EPR效应)富集在瘤区，然而纳米颗粒到达肿瘤的剂量很少，大部分被肝脾所截留，加上部分磁性纳米材料升温性能欠缺，通常需要通过施加高频磁场、多次磁热疗方式才能得到一定效果，这就使得肿瘤热疗效果下降，同时也对正常组织有伤害；瘤内注射使得肿瘤组织内纳米颗粒含量提高，治疗效果得以提升，然而它带来的问题是肿瘤组织的瘤内压使得注入的磁性纳米颗粒容易通过注射器的针孔泄漏，并且容易从肿瘤组织弥散到周围正常组织，使得正常组织在治疗过程中受到损伤，手术中影像引导的缺乏也使得注射位置容易出现偏差而影响治疗效果。

因此，急需开发一种方法，此方法既可使得磁性纳米颗粒在肿瘤组织得以大量累积而能快速达到肿瘤有效治疗温度，又可避免伤害到正常组织，同时多模态影像引导使得肿瘤磁感应热疗更加精准且取得更好的效果。

技术实现要素：

本发明的目的是为了克服上述现有肿瘤磁感应热疗中的不足，提供一种在多模态影像引导下，能快速达到肿瘤有效治疗温度，又可避免伤害到正常组织，使肿瘤磁感应热疗取得更加良好效果的方法。

本发明通过以下技术方案予以实现：一种可注射温敏磁性纳米乳凝胶的制备方法，

步骤1、将油溶性ZnFe₂O₄纳米颗粒与硅油混合，使ZnFe₂O₄纳米颗粒分散于硅油中，形成的混合物作为油相；

步骤2、将作为油相的混合物在搅拌状态下滴加到溶有表面活性剂的沸水中，获得初乳，然后超声乳化，得到稳定的水包油磁性纳米乳；

步骤3、把液态的PEG-DA滴加到水包油磁性纳米乳中，超声分散，使得PEG-DA分子充分分散于水包油磁性纳米乳之间，即得到磁性纳米乳凝胶，在4℃下保存。

优选的：步骤1中，所述作为油相的混合物中，ZnFe₂O₄纳米颗粒的尺寸为10～20纳米，铁元素含量1～6mg/ml，其分散的溶剂为三氯甲烷。

步骤1中，硅油粘度为5～20cp，其用量为混合物总体积的10％～30％。

优选的：所述的水相中表面活性剂为十二烷基硫酸钠，十二烷基硫酸钠的浓度为100～300mM。

优选的：所述的初乳制备过程中，搅拌速度为400～800r/min，加热时间为30～60min。

优选的：所述的水包油磁性纳米乳制备过程中，超声波细胞破碎仪的功率为额定功率的30％～70％，超声时间30～60min。

优选的：所述的滴加到磁性纳米乳中的液态PEG-DA的体积百分数为10％～30％。

一种通过上述任一实施例所述的可注射温敏磁性纳米乳凝胶的制备方法得到的可注射温敏磁性纳米乳凝胶。

上述可注射温敏磁性纳米乳凝胶在作为抗肿瘤药物或制备抗肿瘤药物中的应用。

所述的可注射温敏磁性纳米乳凝胶，其平均水动力尺寸小于100纳米，当温度低于25度时，磁性纳米乳凝胶呈现为液体状态，流动性良好；当温度达到37度时，出现凝胶化而不再流动。

所述的可注射温敏磁性纳米乳凝胶可实现小鼠皮下瘤原位注射并在体温作用下凝胶化而固定于肿瘤部位，不从注射孔泄漏也不弥散到周围正常组织和血管；超声成像系统和磁共振成像精确定位注射位置；施加交变磁场，ZnFe₂O₄纳米颗粒产热达到肿瘤热消融所需温度60度以上，可使肿瘤组织凝固坏死脱落，延长小鼠生存期。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明中制备的ZnFe₂O₄纳米颗粒形貌良好，尺寸均一，升温性能优良；磁性纳米乳凝胶具有温敏特性，在室温25度时处于液态具有良好流动性且可注射，体温37度时PEG-DA分子两端的亲油基团插入相邻纳米乳油滴的油层之中，亲水PEG链作为桥连部分在水中相互交错，即出现凝胶化，当磁性纳米乳凝胶被注射到小鼠皮下瘤组织时，体温诱导其凝胶化并固定于肿瘤部位，不从注射孔泄漏也不弥散到周围正常组织和血管，保证热疗前后的安全性。纳米乳对超声信号的反射使得可以用快速超声成像系统来指导注射位置，ZnFe₂O₄纳米颗粒作为优良的磁共振造影剂用来评测磁性纳米乳凝胶在瘤内的分布情况。施加交变磁场，ZnFe₂O₄纳米颗粒在凝胶中产热达到肿瘤热消融所需温度60度以上，维持5分钟，单次治疗即可使肿瘤组织凝固坏死脱落，提高生存小鼠质量，延长小鼠生存期。

附图说明

图1为磁性纳米乳凝胶机制及应用过程说明图。

图2a至图2d是ZnFe₂O₄纳米颗粒的表征示意图。其中，图2a为透射电镜图，图2b为透射电镜高分辨图，图2c为电子衍射图，图2d是饱和磁化强度图。

图3a至图3d是磁性纳米乳凝胶的表征示意图。其中，图3a为凝胶前透射电镜图及实物图；图3b为凝胶后扫描电镜图及实物图；图3c为凝胶前水动力尺寸图；图3d为不同铁浓度磁性纳米乳凝胶交变磁场升温图。

图4a至图4c是多模态影像引导的肿瘤磁感应热疗图像。

图5a至图5c是小鼠术后情况监测示意图。

具体实施方式

本发明可注射温敏磁性纳米乳凝胶的制备方法的主要步骤是：将油溶性ZnFe₂O₄纳米颗粒加入到硅油中，使纳米颗粒充分分散于其中，形成的混合物作为油相。将油相在搅拌状态下逐滴加入到溶有表面活性剂十二烷基硫酸钠的沸水中，获得初乳，再用超声波细胞破碎仪超声乳化得到稳定的水包油磁性纳米乳。然后把液态的PEG-DA(聚乙二醇双丙稀酸酯)在低温条件下逐滴加入到磁性纳米乳中，超声分散使得PEG-DA分子充分分散于磁性纳米乳之间即得到磁性纳米乳凝胶，四度低温保存。

其中，油相中ZnFe₂O₄纳米颗粒尺寸在10～20纳米之间，铁元素含量1～6mg/ml，其分散的溶剂为三氯甲烷；硅油粘度为5～20cp，其用量为体积百分数占10％～30％。的水相中表面活性剂为十二烷基硫酸钠，其浓度为100～300mM(m mol/L)。初乳制备过程中，搅拌速度为400～800r/min，加热时间为30～60min。水包油磁性纳米乳制备过程中，超声波细胞破碎仪的功率为30％～70％，超声时间30～60min。滴加到磁性纳米乳中的液态PEG-DA的体积百分数为10％～30％。

图1中，液态流动性良好的磁性纳米乳凝胶，用注射器将其注入肿瘤组织，遇到37度体温，PEG-DA分子亲油端插入相邻纳米乳油滴的油层之中，相互交错形成凝胶网络，液态磁性纳米乳凝胶凝固于肿瘤组织内部，外部施加交变磁场，ZnFe₂O₄纳米颗粒在凝胶中取向排列产热使得肿瘤组织热消融。

以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。

实施例1

高温热分解法制备ZnFe₂O₄纳米颗粒

在100毫升斜口三颈烧瓶中加入2mmol的乙酰丙酮铁，1mmol的乙酰丙酮锌，以及反应溶剂二苄醚20mL，表面活性剂油酸和油胺共12mmol，持续通入氮气以去除体系中的氧气并起到搅拌作用，同时冷凝回流。通过程序控温装置以3.3℃/min的加热速率加热反应体系到220℃成核温度，保持该温度1h，此阶段为磁性氧化铁纳米颗粒的成核阶段，该过程中溶液由棕红色转变为透亮的黑色。接着，仍然以3.3℃/min的加热速率加热反应体系到290℃生长温度，于该温度下维持反应体系30min，结束反应。反应结束后，移去热源，待反应物自然冷却至室温后转移至烧杯中，加入无水乙醇，磁分离进行洗涤三次,充分去除溶液中残留的油酸、油胺、二苄醚和未反应完全的前驱物，最后将磁性氧化铁纳米颗粒定容于三氯甲烷中保存。

图2a为透射电镜图，纳米颗粒平均尺寸为十五纳米。图2b为透射电镜高分辨图，晶格条纹间距均为0.295nm，对应于[220]晶格类型。图2c为电子衍射图，具有比较明显电子衍射光环，结晶度良好。图2d是饱和磁化强度图，其饱和磁化强度值达到了98.7emu/g，具备良好的磁感应升温能力。

实施例2

磁性纳米乳凝胶制备

将实施例1中制得的油溶性ZnFe₂O₄纳米颗粒以铁元素计10mg加入到2ml硅油中，用涡旋仪使纳米颗粒和硅油充分混匀，形成的混合物作为油相。将油相在转速为600r/min的搅拌状态下逐滴加入到溶有200mM表面活性剂十二烷基硫酸钠的沸水中,继续搅拌30min，用超纯水定容至4ml获得初乳，再用功率为300w的超声波细胞破碎仪超声乳化分散30min得到稳定的水包油磁性纳米乳。然后把2ml液态的PEG-DA在低温条件下逐滴加入到磁性纳米乳中，100w功率超声分散使得PEG-DA分子充分分散于磁性纳米乳之间即得到磁性纳米乳凝胶，220nm滤膜过滤后，四度低温下保存。

实施例3

磁性纳米乳凝胶制备

将实施例1中制得的油溶性ZnFe₂O₄纳米颗粒以铁元素计8mg加入到2ml硅油中，用涡旋仪使纳米颗粒和硅油充分混匀，形成的混合物作为油相。将油相在转速为550r/min的搅拌状态下逐滴加入到溶有100mM表面活性剂十二烷基硫酸钠的沸水中,继续搅拌25min，用超纯水定容至5ml获得初乳，再用功率为500w的超声波细胞破碎仪超声乳化分散25min得到稳定的水包油磁性纳米乳。然后把2ml液态的PEG-DA在低温条件下逐滴加入到磁性纳米乳中，120w功率超声分散使得PEG-DA分子充分分散于磁性纳米乳之间即得到磁性纳米乳凝胶，220nm滤膜过滤后，四度低温下保存。

实施例4

磁性纳米乳凝胶制备

将实施例1中制得的油溶性ZnFe₂O₄纳米颗粒以铁元素计12mg加入到2ml硅油中，用涡旋仪使纳米颗粒和硅油充分混匀，形成的混合物作为油相。将油相在转速为650r/min的搅拌状态下逐滴加入到溶有250mM表面活性剂十二烷基硫酸钠的沸水中,继续搅拌35min，用超纯水定容至4.5ml获得初乳，再用功率为300w的超声波细胞破碎仪超声乳化分散30min得到稳定的水包油磁性纳米乳。然后把2ml液态的PEG-DA在低温条件下逐滴加入到磁性纳米乳中，150w功率超声分散使得PEG-DA分子充分分散于磁性纳米乳之间即得到磁性纳米乳凝胶，220nm滤膜过滤后，四度低温下保存。

实施例5

磁性纳米乳凝胶制备

将实施例1中制得的油溶性ZnFe₂O₄纳米颗粒以铁元素计6mg加入到2ml硅油中，用涡旋仪使纳米颗粒和硅油充分混匀，形成的混合物作为油相。将油相在转速为500r/min的搅拌状态下逐滴加入到溶有150mM表面活性剂十二烷基硫酸钠的沸水中,继续搅拌20min，用超纯水定容至4ml获得初乳，再用功率为250w的超声波细胞破碎仪超声乳化分散25min得到稳定的水包油磁性纳米乳。然后把2ml液态的PEG-DA在低温条件下逐滴加入到磁性纳米乳中，120w功率超声分散使得PEG-DA分子充分分散于磁性纳米乳之间即得到磁性纳米乳凝胶，220nm滤膜过滤后，四度低温下保存。

图3a是凝胶前透射电镜图及实物图，可以看到纳米乳呈球形，电镜尺寸小于一百纳米，ZnFe₂O₄纳米颗粒分散于纳米颗粒之间，更偏向存在于纳米乳边缘。图3b是凝胶后扫描电镜图及实物图，凝胶后纳米乳之间互相交联，随着加热时间和温度提升，纳米乳之间会融合，ZnFe₂O₄纳米颗粒稳定分布于其间。图3c是凝胶前水动力尺寸图，处于液态的磁性纳米乳凝胶其平均水动力尺寸约为55nm，放置数周尺寸无明显变化。图3d是不同铁浓度磁性纳米乳凝胶交变磁场升温图，铁元素浓度分别为1,2,3mg/ml时，磁性纳米乳凝胶相应的磁感应升温曲线。

实施例6

多模态影像引导下的肿瘤磁感应热消融

选取肿瘤体积约为60立方毫米的4T1荷瘤小鼠，在超声定位下用胰岛素注射器将30uL磁性纳米乳凝胶准确注入小鼠瘤体，5min后，将小鼠置于交变磁场线圈中，确保小鼠肿瘤在线圈中部，施加条件为410kHz，1.8kA/m的交变磁场，对小鼠进行磁感应热疗5min，热疗过程中用红外热成像仪随时监测肿瘤部位温度，根据需要可随时调节交变磁场强度，以免过热造成周围组织损伤。磁共振成像观察热疗前后磁性纳米乳凝胶在瘤内的分布及状态，确定磁性纳米乳凝胶固定于肿瘤组织内部且并未扩散至周围组织。对照组包括未接受任何治疗的4T1荷瘤小鼠，瘤内注射生理盐水并且交变磁场作用的4T1荷瘤小鼠，只注射磁性纳米乳凝胶无交变磁场作用的4T1荷瘤小鼠，每组7-8只小鼠。治疗结束后，每天监测治疗后小鼠的生命体征，体重，肿瘤体积，并记录生存期，观察治疗效果及愈后情况。

图4a是磁性纳米乳凝胶注射过程中肿瘤部位超声成像，纳米乳对超声信号一定的反射能力使得超声成像可以快速监测磁性纳米乳凝胶的注射过程，以指导瘤内注射使得磁性纳米乳凝胶更好地注射到肿瘤组织里；快速超声成像系统记录了一分钟之内肿瘤组织内信号的变化，发现在2s时信号达到了最高值，注射结束后信号并无明显变化。图4b是磁感应热疗过程中温度监测，红外热成像仪记录了磁感应热疗五分钟之内的肿瘤组织温度变化，肿瘤温度不断升高，120s之后肿瘤温度即上升到60度之上并扩散至整个瘤区，周围组织并无明显升温情况；图4c是热疗前后小鼠瘤区磁共振成像，T2和T2^*清晰显示了肿瘤热疗前后不同时间点磁性纳米乳凝胶在肿瘤内的分布情况，说明了磁性纳米乳凝胶始终固定于肿瘤组织内部，并无扩散。

图5a为热疗后小鼠肿瘤观察，小鼠热疗后四周内观察其生存状态并拍照记录，发现瘤区先结痂后逐渐脱落，伤口愈合，四周后伤口愈合完全，留有小伤疤。图5b为小鼠肿瘤体积变化，热疗后三天左右，肿瘤组织不再凸起并变黑变硬，对照组肿瘤体积不断变大。图5c为生存率监测，注射磁性纳米乳凝胶并予以交变磁场作用后的小鼠肿瘤完全治愈，并在半年内无复发，对照组在两个月内全部死亡。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种等同变换，这些等同变换均属于本发明的保护范围。另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。