a.发明领域
本发明涉及包含多糖-蛋白缀合物的免疫原性组合物。在一实施方案中，所述缀合物包含荚膜多糖，例如，制备自猪链球菌(streptococcussuis)血清型，包括但不限于血清型1、2、7和/或9，缀合至载体蛋白。所述免疫原性组合物可用于猪中猪链球菌(s.suis)相关疾病的保护。
b.相关技术的描述
猪链球菌是革兰氏阳性荚膜细菌和养猪业中最重要的细菌性病原体之一，造成重大经济损失(gottschalk.diseasesofswine.10thed.；2012.p.841-55)。感染这种病原体的最初报道在荷兰(1951)和英格兰(1954)发表，然后在1956-1963年demoor表征败血性猪分离株为新lancefield组(fieldetal.vetrec.1954；66:453-5；jansenanddorssen.tijdschrdiergeneeskd.1951；76:815-32；demoorce.antonievanleeuwenhoek.1963；29:272-80)。在接下来的几年中，该物种命名为猪链球菌(elliottsd.jhyg(lond).1966；64:205-12；windsorandelliottjhyg(lond).1975；75:69-78)。
到目前为止，基于荚膜多糖(cps)抗原多样性已描述超过30种猪链球菌血清型，并且认为猪链球菌血清型2是最致命的，最常分离自临床样品且与猪中的疾病有关(goyette-desjardinsetal.emergmicrobes.infect2014；3:e45)。猪链球菌，主要是血清型2，还是一种重要的新出现的与猪或猪衍生产品密切接触的人的人畜共患病原体。
猪链球菌的自然生境是猪的上呼吸道，更特别是扁桃体和鼻腔，以及生殖器和消化道(higginsandgottschalkdiseasesofswine.2006.p.769-83)。据认为猪链球菌在动物间的传播主要是通过呼吸途径。在疾病的各种表现中，败血症和脑膜炎到目前为止是最显著的特征，但是也可以观察到心内膜炎、肺炎、关节炎和其他临床结果(sanfordandtilkerjamvetmedassoc.1982；181:673-6)。然而，在急性感染病例中，常发现猪死亡，没有疾病的先兆体征。虽然猪中的发病率随时间变化且一般少于5％，但是在没有治疗的情况下死亡率可以达到20％(cloutieretal.vetmicrobiol.2003；97:135-51)。受影响的动物一般为5-10周龄，但是还已报道新生仔猪至32周龄猪的感染(higginsandgottschalk,2006)。
厚表面相关的猪链球菌cps赋予细菌抗免疫系统保护，特别是通过抗吞噬作用(seguram.canjmicrobiol2012；58:249-60)。与大多数胞外荚膜细菌一样，针对猪链球菌的保护因此可能是由调理抗体介导的，其通过调理吞噬诱导细菌清除。研究已进行多年，希望开发有效疫苗以预防猪链球菌疾病。然而，没有这样的疫苗可用。将商业或自体灭活全细胞疫苗(菌苗)用于该领域效果不佳(gottschalk.diseasesofswine.2012.p.841-55；lapointeetal.canjvetres.2002；66:8-14；baumsetal.clinvaccineimmunol.2010；17:1589-97；wisselinkhj,etal.vetmicrobiol.2002；84:155-68)。已实验测试其他策略如活菌株和亚单位疫苗。使用活的无毒菌株给出不一致结果，并且可能出现一些安全问题(人畜共患病)(baumsetal.,2010；busqueetal.canjvetres.1997；275-9；fittipaldietal.vaccine.2007；25:3524-35)。研究几年之后，仍没有利用良好表征的毒力因子和/或保护性抗原的已证实和可商购的基于蛋白的亚单位疫苗(fittipaldietal.vaccine.2007；25:3524-35)。作为具有多因子毒力机制并表现出较高表型异质性的病原体，在某种程度上，这些发现是预期的(goyette-desjardinsetal.,2014；fittipaldietal.futuremicrobiol.2012；7:259-79)。此外，虽然已显示菌苗在与强效佐剂组合时有效，但是已显示这些组合是高度反应性的。由此产生的副作用使得这样的组合在商业上是不可取的。
已报道抗cps抗体在抗猪链球菌感染中具有很高的保护潜力，然而这种细菌组分免疫原性很差(calzasetal.infectimmun.2015；83:441-53；charlandetal.microbiology.1997；143:3607-14)。
不像蛋白和肽，一般认为多糖/碳水化合物是t细胞非依赖性抗原，解释了它们天生不能通过mhcii类信号传导刺激辅助t细胞，导致低免疫细胞增殖，没有抗体种类转换或亲和力/特异性成熟，以及更重要的，没有免疫记忆(royandshiao.chimia.2011；65:24-9)。然而，一些纯化的细菌cps，如来自肺炎链球菌(s.pneumoniae)(
需要与有效的菌苗疫苗相比反应性减少的高度保护和有效的疫苗。目前没有可商购的针对猪中猪链球菌感染的有效疫苗。虽然有效的血清型2疫苗会提供大量益处，但是优选针对猪链球菌的最重要血清型提供保护的交叉保护性疫苗。
发明概述
本发明提供克服技术缺陷的免疫原性组合物、疫苗和相关方法。所述组合物和方法为猪提供对不同血清型引起的猪链球菌感染引起的疾病的保护，包括但不限于血清型1、2、7和/或9，特别是猪链球菌感染的临床表现，包括例如脑膜炎、败血症、心内膜炎、关节炎和感染性休克。
本发明提供单价(一种血清型)免疫原性组合物，包含多糖-蛋白缀合物，连同生理上可接受的媒介物，其中猪链球菌荚膜多糖(cps)选自猪链球菌血清型1、2、7和9，或者任何其他血清型，其中cps偶联至蛋白载体。
本发明的免疫原性组合物和疫苗包含缀合至蛋白载体的细菌荚膜多糖，例如，在一非限制性实施方案中破伤风类毒素蛋白。
在另一方面，免疫原性组合物可以是多价(多种血清型)免疫原性组合物，包含多糖-蛋白缀合物，连同生理上可接受的媒介物，其中每种缀合物包含缀合至载体蛋白的来自不同血清型的猪链球菌的荚膜多糖，并且荚膜多糖制备自1、2、7和9，或者任何其他血清型，以及它们的任何组合。
本发明还提供猪链球菌的单价和多价缀合疫苗，赋予针对血清型2和/或1、7和9或者任何其他血清型的交叉保护。
本领域技术人员会理解本文使用的组合物可以加入已知的可注射的生理上可接受的无菌溶液。为了制备即用溶液用于肠胃外注射或输注，水性等渗溶液如盐水或血浆蛋白溶液可容易地获得。此外，本发明的免疫原性和疫苗组合物可以包括兽医学可接受的载体、稀释剂、等渗剂、稳定剂或佐剂。
本发明的方法包括但不限于在对象中引起针对猪链球菌感染的免疫应答的方法，所述方法包括向所述对象施用如本文定义的包含缀合至蛋白载体的一种或多种细菌荚膜多糖的免疫原性组合物。优选地，针对猪链球菌的一种以上血清型或菌株引起免疫应答。本发明的组合物可以用来预防猪链球菌感染。优选地，这样的免疫应答减少与感染一种或多种猪链球菌血清型相关或者由感染一种或多种猪链球菌血清型引起的一种或多种临床表现的发生率或严重程度。
在本文中，可以施用本发明的组合物的合适对象和有需要的对象包括需要预防猪链球菌感染的猪和猪群。
本发明还提供一种减少与猪链球菌感染相关或由猪链球菌感染引起的一种或多种临床表现的发生率或严重程度的方法，所述方法包括施用本发明的免疫原性组合物的步骤，本发明的免疫原性组合物包含一种或多种多糖-蛋白缀合物，其包含猪链球菌血清型1、2、7和9，或者任何其他血清型，或者它们的组合，如本文提供的，从而猪链球菌感染的临床表现的发生率或严重程度相对于未接受本文提供的免疫原性组合物的对象减少至少10％，优选至少20％，甚至更优选至少30％，甚至更优选至少50％，甚至更优选至少70％，最优选至少100％。这类临床表现可以包括例如行为改变、跛行、死亡、脑膜炎、败血症、心内膜炎、关节炎和感染性休克。并且，任何这些临床表现可以由感染猪链球菌所致，由于感染血清型1、2、7和9或者任何其他血清型的猪链球菌。
制备本发明的免疫原性组合物的方法可以进一步包括混合猪链球菌多糖-蛋白缀合物与生理上可接受的媒介物如药学或兽医学可接受的载体、佐剂或它们的组合。本领域技术人员会认识到媒介物、佐剂或组合的选择是由递送途径、个人偏好和动物物种等决定的。
本发明还提供试剂盒，其包含：包含一种或多种猪链球菌多糖-蛋白缀合物的免疫原性组合物；包装免疫原性组合物的容器；一套印刷说明书；以及能够将免疫原性组合物施用至动物的分配器。本发明还提供免疫接种动物的试剂盒，其包含：一套印刷说明书；能够将本文提供的包含一种或多种猪链球菌多糖-蛋白缀合物的免疫原性组合物施用至动物的分配器；并且其中至少一种猪链球菌多糖-蛋白缀合物有效免疫动物对抗至少一种与猪链球菌感染相关的临床表现。本发明的试剂盒可以进一步包含兽医学可接受的载体、佐剂或它们的组合。
本领域技术人员会理解本文使用的组合物可以加入已知的可注射的生理上可接受的无菌溶液。为了制备即用溶液用于肠胃外注射或输注，水性等渗溶液如盐水或血浆蛋白溶液可容易地获得。此外，本发明的免疫原性和疫苗组合物可以包括药学或兽医学可接受的载体、稀释剂、等渗剂、稳定剂或佐剂。
本发明的方法还可以包括混合本发明的组合物与兽医学可接受的载体、佐剂或它们的组合。本领域技术人员会认识到载体、佐剂或组合的选择是由递送途径、个人偏好和动物物种等决定的。
本发明的其他目的、特征和优点由下文的详细描述会变得清楚。但是，应当理解详细描述和具体实例虽然表明本发明的优选实施方案，但是仅以说明的方式给出，因为本发明的精神和范围内的各种改变和修改由这种详细描述对于本领域技术人员会变得清楚。
附图说明
以下图片形成本说明书的部分，并且包括以下图片以进一步证实本发明的某些方面。参考这些图片中的一个或多个结合本文出现的具体实施方案的详细描述可以更好地理解本发明。
图1a-1e：通过凝胶迁移和蛋白印迹实验证实的不同制品中缀合物的存在。图1a：凝胶迁移实验，考马斯蓝，以及图1b：凝胶迁移实验，银染，证实从150kda的纯化的tt单体(泳道2)至缀合物中超过250kda的厚条带(泳道3-4)的相当大的迁移，由共价添加随机数量的115kdacps链至蛋白所致。图1c：利用抗cpsmab的蛋白印迹。在所有凝胶中包括解聚的cps作为对照(泳道5)。图1d：利用抗ttmab对照染色显示在缀合物中保留tt的抗原性。应当注意2:1和1:1缀合物制品之间信号强度的差异(图1a-d，泳道3-4)可能与10μg装载样品/泳道内蛋白含量的总量(分别为4.5μgvs.6.3μg)有关。图1e：通过超声辐照解聚猪链球菌2型荚膜多糖(cps)。在不同时间点采集cps样品并通过大小排阻色谱加上多角度光散射(sec-mals)分析以确定分子量(mw)。60min之后，mw进入平台期，如虚线所示。
图2：hplc分析证实缀合物(＞250kda)的洗脱，游离cps(100kda)和游离tt(150kda)的洗脱。
图3a-3c：用25μg的cpg(fig3a)；
图4a-4h：分别用1μg、2.5μg、5.0μg或25μg的游离解聚荚膜多糖(cps)(图4a-4d)；或者分别用1μg、2.5μg、5.0μg或25μg的
图5a-5f：用
图6a-6c：图6a：在第42天猪链球菌2型菌株s735的调理吞噬杀死-来自用
图7a-7b：猪中的免疫原性和保护研究。将动物按窝分隔，然后随机分配至4组之一：第1组，n＝14；第2组，n＝10，第3组，n＝15；以及第4组，n＝5。将第1-4组混合直至在研究第35天去除第4组(严格对照)。在研究第0、21和34天收集血液样品用于确定血清抗体水平。将小猪用2ml的
发明详述
本发明提供一种免疫原性组合物，其包含：荚膜多糖-蛋白缀合物，连同生理上可接受的媒介物，其中所述缀合物包含缀合至载体蛋白的来自猪链球菌的荚膜多糖，其中所述荚膜多糖制备自猪链球菌血清型1、2、7或9，或者任何其他血清型，或者它们的组合。
在另一实施方案中，所述免疫原性组合物包含选自以下的载体蛋白：天然或灭活的细菌毒素、细菌外膜蛋白、卵清蛋白、匙孔血蓝蛋白(klh)、牛血清白蛋白(bsa)、结核菌素。
在另一实施方案中，所述载体蛋白是选自以下的灭活的细菌毒素：破伤风类毒素、白喉类毒素、白喉毒素的无毒性交叉反应性物质(crm197)、百日咳类毒素、霍乱类毒素、大肠杆菌(e.coli)lt、大肠杆菌st和来自铜绿假单胞菌(pseudomonaaeruginosa)的外毒素a，人中使用的任何其他典型蛋白载体，或者衍生自上述的任何免疫原性肽/片段。
在另一实施方案中，所述载体蛋白是猪链球菌衍生的免疫原性菌体蛋白和/或分泌蛋白，其选自但不限于溶血素、mrp、ef、烯醇化酶、枯草杆菌蛋白酶和dnase。
在一优选实施方案中，来自猪链球菌的荚膜多糖缀合至载体蛋白破伤风类毒素，所述荚膜多糖制备自猪链球菌血清型1、2、7或9，或者任何其他血清型，或者它们的组合。
本发明的一实施方案是多价免疫原性组合物，其包含：制备自至少两种不同猪链球菌血清型的多糖-蛋白缀合物，连同生理上可接受的媒介物，其中每种缀合物包含缀合至载体蛋白的来自猪链球菌的荚膜多糖，其中所述荚膜多糖制备自猪链球菌血清型1、2、7和/或9或者任何其他血清型。
在另一实施方案中，制备自至少两种不同猪链球菌血清型的多价免疫原性组合物缀合至载体蛋白，其中所述载体蛋白选自破伤风类毒素、白喉类毒素、白喉毒素的无毒性交叉反应性物质(crm197)、百日咳类毒素、霍乱类毒素、大肠杆菌lt、大肠杆菌st和来自铜绿假单胞菌的外毒素a，人中使用的任何其他典型蛋白载体，或者衍生自上述的任何免疫原性肽/片段。
在另一实施方案中，制备自至少两种不同猪链球菌血清型的多价免疫原性组合物缀合至载体蛋白，其中所述载体蛋白选自猪链球菌衍生的免疫原性菌体蛋白和/或分泌蛋白，所述猪链球菌衍生的免疫原性菌体蛋白和/或分泌蛋白选自但不限于溶血素、mrp、ef、烯醇化酶、枯草杆菌蛋白酶和dnase。
在另一实施方案中，制备自至少两种不同猪链球菌血清型的多价免疫原性组合物缀合至载体蛋白，其中每种荚膜多糖单独缀合至破伤风类毒素载体蛋白。
本发明的另一实施方案包括一种减少猪链球菌相关感染的临床表现的方法，包括但不限于猪中的受损的行为、跛行、脑部病变和中枢神经系统相关临床表现的频率、菌血症、细菌从内部组织的恢复和/或定殖、胸腔和腹腔中的炎症以及死亡率，所述方法包括向有此需要的动物施用免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含：荚膜多糖-蛋白缀合物，连同生理上可接受的媒介物，其中所述缀合物包含缀合至载体蛋白的来自猪链球菌的荚膜多糖，其中所述荚膜多糖制备自猪链球菌血清型1、2、7或9，或者任何其他血清型或它们的组合。
在一优选实施方案中，一种减少猪链球菌相关感染的临床表现(包括但不限于猪中的受损的行为、跛行、脑部病变和中枢神经系统相关临床表现的频率、菌血症、细菌从内部组织的恢复和/或定殖、胸腔和腹腔中的炎症以及死亡率)的方法包括向有此需要的动物施用免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含来自猪链球菌的荚膜多糖，其制备自猪链球菌血清型1、2、7或9，或者任何其他血清型或它们的组合，缀合至载体蛋白破伤风类毒素。
在另一实施方案中，一种减少猪链球菌相关感染的临床表现(包括但不限于猪中的受损的行为、跛行、脑部病变和中枢神经系统相关临床表现的频率、菌血症、细菌从内部组织的恢复和/或定殖、胸腔和腹腔中的炎症以及死亡率)的方法包括向有此需要的动物施用包含多价免疫原性组合物的免疫原性组合物，其包含：制备自至少两种不同猪链球菌血清型的多糖-蛋白缀合物，连同生理上可接受的媒介物，其中每种缀合物包含缀合至载体蛋白的来自猪链球菌的荚膜多糖，其中所述荚膜多糖制备自猪链球菌血清型1、2、7或9，或者任何其他血清型。
本发明的实施方案还包括一种制备免疫原性缀合物的方法，所述免疫原性缀合物包含：猪链球菌血清型1、2、7和/或9或者任何其他血清型荚膜多糖，或者它们的组合，共价连接至载体蛋白，所述方法包括：(a)通过超声处理或噬菌体降解、温和酸水解或臭氧化解聚猪链球菌血清型1、2、7和/或9或者任何其他血清型的荚膜多糖；(b)使步骤(a)的解聚的荚膜多糖(cps)与高碘酸钠反应以通过化学或酶促氧化产生＜10％氧化水平(或任何其他氧化水平而不损失免疫原性)的唾液酸残基或任何其他靶糖残基，如能够特异性地修饰cps的一部分的特定糖的半乳糖氧化酶和相关的酶；(c)通过cps-蛋白缀合物疫苗领域中已知的还原氨基化或任何其他缀合方法将步骤(b)的高碘酸盐处理的荚膜多糖(cps)共价偶联至载体蛋白，导致多糖:载体蛋白缀合物；以及(d)使多糖:载体蛋白缀合物反应以减少游离醛基团；其中所得的cps:载体蛋白比例为2:1或1:1或者允许保留cps或载体蛋白的免疫原性的任何其他比例。
在一实施方案中，制备免疫原性缀合物的方法包含猪链球菌血清型1、2、7和/或9或者任何其他血清型荚膜多糖，或者它们的组合，共价连接至载体蛋白，其中所述载体蛋白选自灭活的细菌毒素、细菌外膜蛋白、卵清蛋白、匙孔血蓝蛋白(klh)、牛血清白蛋白(bsa)或结核菌素。
在另一实施方案中，制备免疫原性缀合物的方法包含猪链球菌血清型1、2、7和/或9或者任何其他血清型荚膜多糖，或者它们的组合，共价连接至载体蛋白，其中所述载体蛋白是灭活的细菌毒素，选自破伤风类毒素、白喉类毒素、白喉毒素的无毒性交叉反应性物质(crm197)、百日咳类毒素、霍乱类毒素、大肠杆菌lt、大肠杆菌st和来自铜绿假单胞菌的外毒素a，人中使用的任何其他典型蛋白载体，或者衍生自上述载体蛋白的任何免疫原性肽/片段。
在另一实施方案中，制备免疫原性缀合物的方法包括猪链球菌血清型1、2、7和/或9荚膜多糖，或者任何其他血清型，或者它们的组合，共价连接至载体蛋白，其中所述载体蛋白是猪链球菌衍生的免疫原性菌体蛋白和/或分泌蛋白，其选自但不限于溶血素、mrp、ef、烯醇化酶、枯草杆菌蛋白酶和dnase。
在一优选实施方案中，制备免疫原性缀合物的方法包括猪链球菌血清型1、2、7和/或9或者任何其他血清型荚膜多糖，或者它们的组合，共价连接至载体蛋白，其中所述载体蛋白是破伤风类毒素。
除非另有说明，本发明的实施会采用本领域技术内的分子生物学、微生物学、重组dna技术、蛋白和多糖化学以及免疫学的常规技术。这类技术在文献中充分解释。参见，例如，sambrook,fritsch&maniatis,molecularcloning:alaboratorymanual,vols.i,iiandiii,secondedition(1989)；dnacloning,vols.iandii(d.n.glovered.1985)；oligonucleotidesynthesis(m.j.gaited.1984)；nucleicacidhybridization(b.d.hames&s.j.higginseds.1984)；animalcellculture(r.k.freshneyed.1986)；immobilizedcellsandenzymes(irlpress,1986)；perbal,b.,apracticalguidetomolecularcloning(1984)；theseries,methodsinenzymology(s.colowickandn.kaplaneds.,academicpress,inc.)；proteinpurificationmethods–apracticalapproach(e.l.v.harrisands.angal,eds.,irlpressatoxforduniversitypress)；andhandbookofexperimentalimmunology,vols.i-iv(d.m.weirandc.c.blackwelleds.,1986,blackwellscientificpublications)；r.royin:carbohydrate-basedvaccines,acssymposiumseries,989,2008。
在详细描述本发明之前，应当理解本发明并不限于特定dna、多肽序列或过程参数，因此当然可以变化。还应当理解本文中使用的术语仅仅是为了描述本发明的特定实施方案的目的，并不是为了限制。必须注意，当用于本说明书和所附权利要求时，除非内容另有明确指定，单数形式“一个(a)”、“一个(an)”和“这个”包括复数指称。因此，例如，提到“抗原”包括两种或更多种抗原的混合物，提到“赋形剂”包括两种或更多种赋形剂的混合物等。
a.定义
除非另有定义，在提交时本文使用的所有技术和科学术语具有如本发明所属领域技术人员通常理解的相同意义。术语的含义和范围应当是清楚的；但是，在任何潜在歧义的情况下，本文提供的定义优先于任何词典或外在定义。而且，除非上下文另有要求，单数术语应当包括复数，并且复数术语应当包括单数。在本文中，除非另有说明，使用“或者”表示“和/或”。此外，术语“包括(including)”以及其他形式如包括“(includes)”和“包括(includes)”和“包括(included)”的使用不是限制。本文提到的所有专利和出版物均援引加入本文。
“疾病防护”、“保护性免疫”、“功能性免疫”和相似短语表示通过施用本发明的一种或多种治疗组合物或者它们的组合产生的针对疾病或疾病状况的应答，其导致比已暴露于疾病或感染的未免疫的对象中预期的少的有害效应。即，感染的有害效应的严重程度在免疫接种的对象中减轻。在免疫接种的对象中可以减少、减缓或可能完全预防感染。在本文中，当表示完全预防感染时，其具体说明。如果未说明完全预防，则该术语包括部分预防。
在本文中，“临床表现的发生率和/或严重程度减少”或者“临床症状减少”表示但不限于与野生型感染相比，减少组中感染对象的数量，减少或消除表现出感染的临床表现的对象数量，或者减少一个或多个对象中存在的任何临床表现的严重程度。例如，其应当指病原体负荷的任何减少、病原体脱落、病原体传播减少或猪链球菌感染的任何临床表现症状的减少。优选地，与未接受所述组合物并感染的对象相比，在接受本发明的治疗组合物的一个或多个对象中这些临床表现减少至少10％。更优选地，在接受本发明的组合物的对象中临床表现减少至少20％、优选至少30％、更优选至少40％、甚至更优选至少50％、并且甚至更优选70％。
术语“增加的保护”在本文中表示但不限于在免疫接种的对象组对未免疫接种的对象对照组中，与感染性物质感染相关的一种或多种临床症状分别统计上显著减少。术语“临床症状的统计上显著减少”表示但不限于用感染性物质攻击之后，免疫接种的对象组中至少一种临床症状的发生频率比未免疫接种的对照组低至少10％、优选20％、更优选30％、甚至更优选50％、并且甚至更优选70％。
“长期保护”应当是指持续至少3周，但是更优选至少3个月，更优选至少6个月的“提高的效力”。在家畜的情况下，最优选长期保护应当持续直至将动物出售肉类的平均年龄。
“免疫原性或免疫组合物”是指包含至少一种在宿主中引发对所述组合物的细胞或抗体介导的免疫应答的细菌荚膜多糖-蛋白缀合物的物质组合物。在本发明的一优选实施方案中，免疫原性组合物诱导免疫应答，并且更优选地，赋予针对猪链球菌感染的一种或多种临床表现的保护性免疫。
如本文所用的“免疫原性”细菌荚膜多糖-蛋白缀合物或“抗原”是指如本文所述引发免疫学应答的偶联至蛋白载体的多糖。“免疫原性”细菌荚膜多糖-蛋白缀合物包括衍生自猪链球菌血清型1、2、7和9或者任何其他血清型的多糖，其中所述(多)糖通过本领域技术人员已知的合成方法获得，或者在缀合至蛋白载体之前解聚至100-400kda的分子量。例如，在一方面，分子量范围为100-350kda、100-300kda、100-250kda、100-200kda、100-150kda、200-400kda、200-350kda、200-300kda、200-250kda、300-400kda、或300-350kda、或5-400kda或者如其合成的寡糖片段。在一实施方案中，共价偶联至多糖的载体蛋白是来自破伤风、白喉、百日咳、假单胞菌(pseudomonas)、大肠杆菌、葡萄球菌(staphylococcus)、链球菌(streptococcus)、产气荚膜梭菌(clostridiumperfringens)或沙门氏菌(salmonella)的类毒素，或者衍生自以上的任何免疫原性肽/片段。为最佳免疫原性组合物优化的cps或其合成片段的大小连同蛋白比例通常由5kda或更高的cps以及4-5cps(片段):1蛋白(或肽片段)的比例组成。
如本文所用的术语“缀合物”是指共价缀合至载体蛋白的多糖。本公开的缀合物和包含它们的免疫原性组合物可以包含一定量的游离(未共价连接的)多糖和游离载体蛋白。
如本文所用，“缀合(toconjugate)”、“缀合(conjugated)”和“缀合(conjugating)”是指将多糖或细菌荚膜多糖共价连接至载体分子或载体蛋白的过程。缀合可以根据下文描述的方法或通过本领域已知的其他过程进行。缀合增强荚膜多糖的免疫原性。
如本文所用的术语“糖”可与“多糖”或“寡糖”交换使用，是指细菌荚膜多糖，在一优选实施方案中分离自猪链球菌。
“免疫应答”或“免疫学应答”表示但不限于发展对所关注的组合物或疫苗的细胞和/或抗体介导的免疫应答。通常，免疫或免疫学应答包括但不限于一种或多种以下效应：产生抗体，激活b细胞、辅助性t细胞和/或细胞毒性t细胞，特异性地针对所关注的组合物或疫苗中包括的抗原或多种抗原。优选地，宿主会表现出治疗性或保护性免疫学(记忆)应答，从而对新感染的抗性会增强和/或疾病的临床严重程度降低。这样的保护会通过以下证实：症状的数量、症状的严重程度减少，或者缺少与病原体感染相关的一种或多种症状，猪链球菌相关感染的临床表现发生的延迟，包括但不限于受损的行为、跛行、脑部病变和中枢神经系统相关临床表现的频率、菌血症、细菌从内部组织的恢复和/或定殖、胸腔和腹腔中的炎症以及死亡率。
如本文所用，“药学或兽医学可接受的载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、佐剂、稳定剂、稀释剂、防腐剂、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂、吸收延迟剂等。在一些优选实施方案中，特别是那些包括冻干免疫原性组合物的实施方案，本发明中使用的稳定剂包括用于冻干或冷冻-干燥的稳定剂。
“稀释剂”可以包括水、盐水、葡萄糖、乙醇、甘油等。等渗剂可以包括氯化钠、葡萄糖、甘露醇、山梨醇和乳糖等。稳定剂包括白蛋白和乙二胺四乙酸的碱金属盐等。
“分离的”表示“人工”使其自天然状态改变，即，如果其天然存在，则将其自原始环境改变或移除，或者二者。例如，在本文中采用该术语时，天然存在于活生物体中的细菌荚膜多糖是未“分离的”，但是自其天然状态的共存物质分离的相同荚膜多糖是“分离的”。
如本文所用，术语“免疫接种(vaccination)”或“免疫接种(vaccinating)”或其变体表示但不限于一个过程，其包括施用本发明的免疫原性组合物，当施用至动物时，所述免疫原性组合物引发或能够引发—直接或间接地—动物中针对猪链球菌的免疫应答。
在本发明的上下文中，“死亡率”是指由猪链球菌感染引起的死亡，并且包括感染如此严重以至于将动物安乐死以防止痛苦和为其生命提供人道结局的情况。
在本文中，“有效剂量”表示但不限于引发或能够引发免疫应答的抗原量，其减少施用抗原的动物中的临床症状。
如本文所用，在组合物的上下文中，术语“有效量”表示能够诱导免疫应答的免疫原性组合物的量，所述免疫应答减少动物中感染或疾病事件的发生率或者减轻其严重程度。或者，在治疗的上下文中，术语“有效量”是指治疗的量，其足以减少或改善疾病或病症的严重程度或持续时间，或者其一种或多种症状，防止疾病或病症的发展，引起疾病或病症的消退，防止与疾病或病症相关的一种或多种症状的复发、发展、发生或进展，或者增强或提高另一疗法或治疗剂的预防或治疗。
b.载体分子
本发明的猪链球菌荚膜多糖可以缀合或共价连接的载体分子优选上文描述的那些。优选的载体包括但不限于灭活的细菌毒素，如来自破伤风、白喉、百日咳、假单胞菌、大肠杆菌、葡萄球菌、链球菌、产气荚膜梭菌或沙门氏菌的类毒素；或者细菌外膜蛋白、卵清蛋白、匙孔血蓝蛋白(klh)、牛血清白蛋白(bsa)或结核菌素；或者猪链球菌衍生的免疫原性菌体蛋白和/或分泌蛋白，选自但不限于溶血素、mrp、ef、烯醇化酶、枯草杆菌蛋白酶、dnase；或者衍生自以上但不限于以上的任何免疫原性肽/片段(如
本发明的猪链球菌荚膜多糖可以通过本领域技术人员已知的标准技术制备。例如，荚膜多糖可以制备自各种猪链球菌血清型，包括但不限于血清型1、2、7和9。单独多糖通过离心、沉淀、超滤和凝胶过滤/大小排阻色谱纯化；然后通过超声处理或噬菌体降解、温和酸水解或臭氧化解聚；或者，单独寡糖可以通过本领域技术人员已知的合成方法获得。将纯化/解聚/合成的多(寡)糖化学活化以使它们可与载体蛋白反应。一旦活化，将每种荚膜多糖缀合至载体蛋白以形成“猪链球菌荚膜多糖-蛋白缀合物”。
猪链球菌荚膜多糖可以通过本领域已知的任何方便方法共价偶联至载体(r.roy,carbohydrate-basedvaccines,acssymp.ser,989,2008)。例如，本公开提供方法，其包括(1)分离荚膜多糖；(2)解聚多糖；(3)活化多糖；(4)使活化的多糖与载体蛋白反应，其中终产物是稳定的多糖-蛋白缀合物。在一实施方案中，荚膜多糖通过超声处理或者通过噬菌体降解、温和酸水解或臭氧化解聚，其中通过大小排阻色谱确定解聚后的分子量。然后将解聚的多糖在氧化剂的存在下活化，在非限制性实例中，氧化剂是高碘酸钠或常用碱金属高碘酸盐，或者任何靶糖残基的任何其他化学或酶促氧化。通过气相色谱/hplc-ms评价唾液酸或其他糖残基的氧化程度。将处理的多糖在氰基硼氢钠(但不限于此)的存在下在控制缓冲液中通过还原氨基化偶联，2:1或1:1缀合比例，或者对最佳免疫原性组合物优化的任何比例，通常由5kda或更高的cps以及4-5cps(片段):1蛋白(或肽片段)的比例组成。
如通过平均分子量定义的，免疫原性组合物的大小可变并取决于所选的衍生自猪链球菌血清型1、2、7或9或者任何其他血清型的细菌荚膜多糖，蛋白载体，以及解聚的方法和将细菌荚膜多糖偶联至载体的方法。因此，其可以小到1,000道尔顿(103)或大于106道尔顿。
这类分子的毒性和治疗效力可以通过细胞培养或实验动物中例如确定ld50(对群体的50％致死的剂量)的标准制药方法来确定。
本发明的疫苗可以是多价或单价的。多价疫苗制备自多种衍生自猪链球菌血清型1、2、7或9或者任何其他血清型的细菌荚膜多糖与载体分子的免疫缀合。
在另一方面，细菌荚膜多糖-蛋白缀合物组合物包含有效免疫量的免疫原性缀合物，与额外的免疫刺激剂组合；以及生理上可接受的媒介物。如本文的上下文中所用，“免疫刺激剂”意图涵盖能够增强免疫系统活性的任何化合物或组合物，无论其是与特异性抗原组合的特异性增强作用，或者简单地对免疫应答的一个或多个元素活性的独立影响。免疫刺激剂化合物包括但不限于矿物胶，例如，氢氧化铝；表面活性物质如溶血卵磷脂、普流尼克(pluronic)多元醇；聚阴离子；肽；油乳剂；以及mdp。利用这些材料的方法是本领域已知的，并且确定用于给定疫苗的刺激剂的最佳量在技术人员的能力之内。一种以上免疫刺激剂可以用于给定制剂。还可以将免疫原(cps)非共价并入胶束或脂质体组合物用于疫苗制剂。
如果期望，组合物可以存在于包装或分配器装置中，其可以包含一个或多个单位剂型，所述单位剂型包含活性成分。例如，所述包装可以包含金属或塑料薄膜，如透明包装。所述包装或分配器装置可以附有施用的说明书，优选施用至哺乳动物，特别是猪。与这类容器相关的可以是管理药物或生物产品的生产、使用或销售的政府机构所规定形式的提示，该提示反映用于人施用的生产、使用或销售的机构的批准。
c.佐剂
为了进一步增加本文提供的免疫原性组合物的免疫原性，其包含一种或多种猪链球菌荚膜多糖-蛋白缀合物，还可以包含一种或多种佐剂。
在一些实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含佐剂。如本文所用，“佐剂”可以包括例如氢氧化铝和磷酸铝，皂草苷[例如quila、qs-21(cambridgebiotechinc.,cambridgema)]，gpi-0100(galenicapharmaceuticals,inc.,birmingham,al)，油包水乳剂，水包油乳剂，水包油包水乳剂[例如，油包水制剂，包括
佐剂的另一实例是选自丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物以及马来酸酐和烯基衍生物的共聚物的化合物。有利的佐剂化合物是丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物，特别是与糖类或多元醇的聚烯基醚交联。已知这些化合物为术语卡波姆(phameuropavol.8,no.2,june1996)。本领域技术人员还可以参考美国专利第2,909,462号，其描述了与聚羟基化化合物交联的这类丙烯酸聚合物，所述聚羟基化化合物具有至少3个(优选不多于8个)羟基，至少3个羟基的氢原子被具有至少2个碳原子的不饱和脂肪族基团代替。优选基团是包含2-4个碳原子的那些基团，例如乙烯基、烯丙基和其它烯化的(ethylenically)不饱和基团。不饱和基团本身可以包含其他取代基如甲基。以名称卡巴普(carbopol)(bfgoodrich,ohio,usa)出售的产品特别适合。它们可以与烯丙基蔗糖或与烯丙基季戊四醇交联。其中可以提到卡巴普974p、934p和971p。最优选使用卡巴普971p。在马来酸酐和烯基衍生物的共聚物中是共聚物ema(monsanto)，其是马来酸酐和乙烯的共聚物。这些聚合物溶解于水中导致酸溶液，优选将其中和至生理ph，以便给出佐剂溶液，将免疫原性、免疫学或疫苗组合物本身加入其中。
其他合适的佐剂包括但不限于ribi佐剂系统(ribiinc.)、嵌段共聚物(cytrx,atlantaga)、saf-m(chiron,emeryvilleca)、单磷酰脂质a、阿夫立定(avridine)脂质-胺佐剂、来自大肠杆菌的不耐热肠毒素(重组或其他方式)、霍乱毒素、ims1314或胞壁酰二肽、cpgodn细菌寡核苷酸的合成版本[例如，odn1826vaccigradetm(invivogen,sandiego,ca)]或者天然存在或重组的细胞因子或其类似物或者内源细胞因子释放的刺激剂等。
预期可以以约100μg-约10mg/剂量的量，优选以约100μg-约10mg/剂量的量，更优选以约500μg-约5mg/剂量的量，甚至更优选以约750μg-约2.5mg/剂量的量，并且最优选以约1mg/剂量的量添加佐剂。或者，佐剂可以浓度为最终产物体积的约0.01-65％，优选浓度为最终产物体积的约2％-30％，更优选浓度为最终产物体积的约5％-25％，更优选浓度为最终产物体积的约7％-22％，并且最优选浓度为最终产物体积的10％-20％。通过按照已知技术在适当的无菌条件下物理混合佐剂与猪链球菌荚膜多糖-蛋白缀合物制备本发明的疫苗组合物，产生佐剂组合物。
预期可以以约100μg-约10mg/剂量的量，优选以约100μg-约10mg/剂量的量，更优选以约500μg-约5mg/剂量的量，甚至更优选以约750μg-约2.5mg/剂量的量，并且最优选以约1mg/剂量的量添加佐剂。或者，佐剂可以浓度为最终产物体积的约20％-65％，优选浓度为最终产物体积的约20％-30％，更优选浓度为最终产物体积的约5％-25％，更优选浓度为最终产物体积的约7％-22％，并且最优选浓度为最终产物体积的10％-20％。
d.生理上可接受的媒介物
可以利用与用于其他药物多肽组合物的那些相似的技术配制本发明的疫苗组合物。因此，佐剂和猪链球菌荚膜多糖-蛋白缀合物可以以冻干形式储存并在生理上可接受的媒介物中重组以在施用之前形成悬浮液。或者，佐剂和缀合物可以储存在媒介物中。优选的媒介物是无菌溶液，特别是无菌缓冲液溶液，如磷酸缓冲盐水。在媒介物中组合佐剂和缀合物从而提高免疫原性组合物的免疫效果的任何方法都是适当的。
本发明的疫苗的单一剂量的体积可以变化，但是一般在常规疫苗通常采用的范围内。单一剂量的体积优选约0.1ml-约3ml，优选约1.0ml-约3.0ml，并且更优选约1.0ml-约2.0ml，在上文提到的缀合物和佐剂浓度下。
本发明的疫苗组合物可以通过任何方便的方式施用。
e.制剂
包含偶联至载体分子的猪链球菌荚膜多糖的免疫原性缀合物可以用作疫苗用于针对一种或多种血清型的猪链球菌免疫，包括但不限于血清型1、2、7和9。包含生理上可接受的媒介物中的免疫原性缀合物的疫苗可用于免疫动物的方法，优选免疫猪，用于预防猪链球菌感染。
通过用免疫原性缀合物免疫针对本发明的免疫原性缀合物产生的抗体可以用于预防猪链球菌感染的被动免疫疗法。
组合物的施用对象优选是猪。在另一实施方案中，所述对象是人。
本发明的制剂包含有效免疫量的一种或多种免疫原性组合物或其抗体以及生理上可接受的媒介物。疫苗包含有效免疫量的一种或多种免疫原性组合物以及生理上可接受的媒介物。所述制剂应当适合施用模式。
如果期望，免疫原性组合物还可以包含最小量的湿润剂或乳化剂，或者ph缓冲剂。免疫原性组合物可以是液体溶液、悬浮液、乳液、胶囊、缓释制剂。
f.有效剂量
本文描述的化合物可以以治疗有效剂量施用至对象以预防猪链球菌相关疾病。剂量取决于接受疫苗的宿主以及诸如宿主年龄的因素。
制剂中采用的本发明的免疫原性缀合物或抗体的精确量取决于施用途径和对象性质(例如，物种、年龄、大小)，并且会在如政府监管机构要求的效力研究中证实。
化合物的毒性和治疗效力可以在实验动物中确定。虽然可以使用表现出毒性副作用的化合物，但是应当小心设计递送系统，将这类化合物靶向至受影响的组织位点，以便最小化对未感染细胞的潜在损害，从而减少副作用。
获得自动物研究的数据可以用于制定在猪中使用的剂量范围。剂量可以在这个范围内变化，取决于采用的剂型和利用的施用途径。
组合物的免疫原性可以通过使用本领域已知的任何免疫测定在用组合物免疫之后监测受试对象的免疫应答确定。体液(抗体)应答和/或细胞介导的免疫的产生可以用作免疫应答的指征。受试对象可以包括动物如猪、小鼠、仓鼠、狗、猫、兔、牛、马、羊、家禽(例如鸡、鸭、鹅和火鸡)和人。
受试对象的免疫应答可以通过各种方法分析，如：所得免疫血清对免疫原性缀合物的反应性，如通过已知技术测定的，例如，酶联免疫吸附测定(elisa)、免疫印迹、免疫沉淀等；或者，通过保护免疫宿主免于病原体感染和/或减弱免疫宿主中由于病原体感染的症状，如通过本领域已知的任何方法确定的，用于测定传染病物质的水平，例如，细菌水平(例如，通过培养来自对象的样品)，或者本领域已知的其他技术。传染病物质的水平还可以通过测量免疫球蛋白针对的抗原水平确定。传染病物质的水平降低或传染病症状改善表示组合物是有效的。
在猪中体内使用之前，可以体外测试本发明的治疗剂的期望的治疗或预防活性。
g.向对象施用
优选的施用途径包括但不限于鼻内、口服、皮内和肌肉内。在饮用水中施用，最优选以单一剂量施用是可取的。技术人员会认识到本发明的组合物还可以以一个、两个或更多个剂量施用，以及通过其他施用途径施用。例如，这类其他途径包括皮下、皮内、静脉内、血管内和心内。根据预防所期望的持续时间和有效性，本发明的组合物可以施用一次或数次，还可以间歇施用，例如以每日计施用数天、数周或数月，一年两次，或者每年间隔和以不同剂量。
包括以下实施例以证明本发明的优选实施方案。本领域技术人员应当理解下文实施例中公开的技术代表发明人发现在本发明的实施中运作良好的技术，并且因此可以认为构成其实施的优选模式。然而，鉴于本公开，本领域技术人员应当理解在公开的具体实施方案中可以进行许多变化，并且仍获得类似或相似的结果，不会背离本发明的精神和范围。
实施例
细菌菌株和生长条件：将猪链球菌血清型2参考菌株s735(atcc43765)用作2型cps的来源(vancalsterenetal.biochemcellbiol.2010；88:513-25)，作为体外调理吞噬测定(opa)的靶菌株，以及制备用来超免疫小鼠的热灭活细菌。将绵羊血琼脂平板上分离的菌落接种在5ml的todd-hewittbroth(thb；oxoid,nepean,on,canada)中，并且在水浴中于37℃和120rpm摇动下温育8h。通过将10μl用pbs1:1,000稀释的8h-培养物转移至30ml的thb中制备工作培养物，将其温育16h。将细菌洗涤一次并重悬于pbs中，获得5x108cfu/ml。如以前所述获得热灭活的细菌培养物(segura,etal.infectimmun.1999；67:4646-54)。简单地说，将过夜培养物用pbs洗涤一次，然后重悬于30ml的新鲜thb中。采集样品在thb琼脂(tha)上进行细菌计数。通过在60℃上温育45min将细菌立即杀死，然后在冰上冷却。通过在血琼脂上48h没有生长证实细菌杀死。用于猪攻击模型的菌株在下文中描述。
2型猪链球菌cps的分离和纯化：如calzas等人(infectimmun.2013；81:3106-18)所述使细菌培养物生长。如vancalsteren等人(biochemcellbiol.2010；88:513-25)所述进行cps提取和纯化，然后质量控制，包括通过改进型lowry蛋白测定试剂盒(pierce,rockford,il,usa)确定蛋白，利用nd-1000分光计(nanodrop,wilmington,de,usa)核酸定量以及1d/2d1h核磁共振(nmr)分析，以便确保质量和身份。
对照小鼠抗血清：在第0、7、21和28天通过腹腔内注射用7.5x108cfu/ml的thb中的热灭活猪链球菌血清型2菌株s735重复免疫5周龄雌性c57bl/6小鼠获得超免疫小鼠(n＝6)。在第42天，收集血清，汇集，等分并储存在-80℃下。
抗2型猪链球菌cps和tt的抗体测量：为了测量特异性抗体，将0.1mnaco3,ph9.6中的200ng天然猪链球菌血清型2cps或tt添加至elisa板(nunc-immunopolysorp,canadawidescientific,toronto,on,canada)的孔中。在4℃下包被过夜之后，将板用包含0.05％(v/v)tween20的pbs(pbst)洗涤并通过添加包含1％(w/v)的bsa(hyclone,logan,ut,usa)的pbs封闭1h。洗涤之后，将pbst中稀释的小鼠血液或小鼠/猪血清样品添加至孔中1h。洗涤之后，如下文所述将板用pbst中稀释的hrp缀合的同种型特异性抗体温育1h。通过添加3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(tmb；invitrogen,burlington,on,canada)将酶反应显影，通过添加0.5mh2so4终止，并且用elisa酶标仪在450nm处读取吸光度。
为了追踪对cps和tt的总(igg+igm)抗体应答的动力学，将采集自尾静脉的小鼠血液分别1:100或1:20,000稀释。以前已进行稀释优化(数据未示出)。将1:2,500稀释的hrp缀合的山羊抗小鼠igg+igm(h+l)(jacksonimmunoresearch)用作检测抗体。
为了进行小鼠ig同种型的滴定，将第42天血清在pbst中系列稀释(2倍)，并且利用如上文提到的hrp缀合的山羊抗小鼠igg+igm，1:1000稀释的山羊抗igm，1:400稀释的山羊抗igg1、山羊抗igg2b、山羊抗igg2c或山羊抗igg3(southernbiotech)检测抗体。对于猪血清，在pbst中进行2倍系列稀释，并且利用1:4,000稀释的hrp缀合的山羊抗猪总ig[igg+igm](jacksonimmunoresearch)检测抗体。为了检测猪igg亚类，添加1:250稀释的未缀合的小鼠抗猪igg1或小鼠抗猪igg2(abdserotec,raleigh,nc,usa)，然后用hrp缀合的山羊抗小鼠二抗温育。对于小鼠和猪血清滴定，认为导致光密度(od450nm)等于或低于0.2(作为比较目的的预先设定的截止值)的最后血清稀释的倒数是该血清的滴度。为了代表性目的，给予负滴度(≤截止值)10的任意滴度值。
为了控制板间变化，将内部参考阳性对照添加至每个板。对于小鼠抗体的滴定，这个对照是来自超免疫小鼠的血清池(如上文所述制备)。对于猪抗体的滴定，这个对照是用108cfu的猪链球菌血清型2的灭活悬浮液超免疫的血清。当对阳性内部对照获得1的od450nm时终止tmb中的反应。在初步标准化期间确定包被抗原(cps或tt)、阳性内部对照血清以及hrp缀合的抗小鼠或抗猪抗体的最佳稀释。
调理吞噬测定：通过心内穿刺从幼稚c57bl/6小鼠采集血液，用肝素钠处理，然后稀释以获得补充了5％热灭活胎牛血清、10mmhepes、2mml-谷氨酰胺和50μm2-巯基乙醇的rpmi1640中的6.25x106个白细胞/ml。所有试剂均来自gibco(invitrogen,burlington,on,canada)。将所有血液制品保持在室温下。利用洗涤的如上文所述生长的细菌培养物，在完全细胞培养基中制备最终细菌悬浮液以获得1.25x106cfu/ml的浓度。通过利用autoplate4000automatedspiralplater(spiralbiotech,norwood,ma,usa)将样品平板接种在tha上确定最终悬浮液中的cfu数量/ml。将所有细菌制品保持在冰上。将5x105个白细胞的稀释的全血与5x104cfu的猪链球菌(0.1的感染复数[moi])和40％(v/v)的来自幼稚或免疫接种小鼠的血清在微型管中混合至0.2ml的最终体积。利用无菌的25g针将管顶刺穿，然后将微型管在37℃和5％co2下温育2h，每20min温和手动搅拌。温育之后，在tha上利用autoplate4000automatedspiralplater进行活细菌计数。将添加天然兔血清或兔抗猪链球菌2型菌株s735血清(higginsandgottschalk.jvetdiagninvest.1990；2:249-52)的管分别用作阴性和阳性对照。利用下式确定细菌杀死的％：杀死的细菌％＝[1-(从样品管回收的细菌/从用幼稚小鼠血清的阴性对照管回收的细菌)]x100。基于利用不同温育时间和moi的几个预实验选择最终opa条件(goyette-desjardinsetal.methodsmolbiol.2015；1331:81-92)。
统计分析：所有数据均表示为平均值±平均值的标准误差(sem)。利用来自sigmaplot11.0版的方差分析(anova)分析数据的显著性，除了存活曲线分析，其利用来自graphpad5.01版的log-rank检验进行。显著性在图中表示如下：*，p＜0.05；**，p＜0.01和***，p＜0.001。
实施例1:
缀合物疫苗的制备：
1.2型cps的解聚：
在2010年，vancalsteren等人报道了血清型2cps的重复单元的精确结构(byrdandkadis.infectimmun.1992；60:3042-51)。cps重复单元由1鼠李糖:1葡萄糖:3半乳糖:1n-乙酰葡糖胺:1唾液酸(也称作n-乙酰神经氨酸[neu5ac])的独特排列组成。据发现唾液酸是分支上的末端，具有与半乳糖的α2,6-键。猪链球菌血清型2cps结构的精确知识为糖缀合物的构建提供化学基础。
利用如calzas等人(calzasetal.infectimmun.2013；81:3106-18)以前描述的包含少于1％w/w蛋白或核酸的高度纯化的来自猪链球菌2型的cps，研究缀合至载体蛋白如tt是否避免cps的t细胞不依赖性(ti)抗原性，取而代之诱导动物中的t细胞依赖性(td)保护性体液应答。
为了制备糖缀合物，首先决定将cps解聚至较小大小以提高缀合的效力和蛋白载体的t细胞肽表位的残基暴露。由于其高mw，发现为410,000-480,000da(vancalsterenetal.biochemcellbiol.2010；88:513-25；和calzasetal.infectimmun2013；81:3106-18)，首先将猪链球菌2型的天然多糖解聚为较小片段。
为了进行这种解聚，进行如szu等人(szuetal.carbohydrres.1986；152:7-20)描述的超声辐照。相对于通过化学(duanandkasper.glycobiology2011；21:401-9；higashietal.carbohydrpolym2011；86:1365-70；和andersonp.infectimmun1983；39:233-8)或酶促(svensonetal.femsmicrobiollett1977；1:145-7；svensonetal.jimmunolmethods1979；25:323-35；wesselsetal.procnatlacadsci1987；84:9170-4；和paolettietal.jbiolchem1990；265:18278-83)方法片段化，选择超声辐照(超声处理)以避免化学改变(pawlowskiandsvenson.femsmicrobiollett1999；174:255-63)。此外，其易于使用，对于不稳定表位可靠，并且不需要消除过量的试剂。超声辐照的另一大优势是样品多分散性减少，导致mw的非常窄和均匀的分布(表1)(szuetal.1986)，有利于生物化学表征，特别是糖缀合物内。
将20毫升的cps在50mmnh4hco3中的2mg/ml溶液转移至冰浴中的50ml锥形聚丙烯管。将安装在virsonic600超声波仪(virtis,gardiner,ny,usa)上的钛1/8微探针浸入cps溶液中，并且在20khz和24w下进行超声处理60min(见下文)。超声处理之后，采集cps样品以通过如以前描述的大小排阻色谱加上多角度光散射(sec–mals)(vancalsterenetal.biochemcellbiol2013；91:49-58)确定分子量(mw)。简单地说，用串联的2个8mm×300mmshodexohpak凝胶过滤柱(sb-806和sb-804)进行色谱分离，之前是sb-807g保护柱(showadenko,tokyo,japan)。利用0.1mnano3作为流动相以0.5ml/min进行洗脱。利用dawneosmals探测器(wyatt,santabarbara,ca,usa)确定摩尔质量，并且用astra软件版本6.1.1.17(wyatt)利用解聚样品的角度34.8°至132.2°的11个探测器(探测器5–15)进行计算。将解聚cps的剩余溶液对水透析(spectra/por,mwco3,500；spectrumlaboratories,ranchodominguez,ca,usa)并冻干。
在预实验中利用不同时间点确定超声处理的最佳条件。在预实验期间通过sec-mals监测样品的cpsmw，据显示超声处理45min之后解聚进入平台期(图1e)。基于这些观察，我们选择超声处理60min的解聚时间，在这个时间两个不同批次产生可重复结果，给出115,000da的平均mw(113,000-118,000da；表1)。这两批的1hnmr研究发现除了解聚本身，没有多糖的结构改变(数据未示出)。将这些解聚的cps用于随后制备缀合物疫苗制剂。
表1：解聚的多糖批次的大小排阻色谱加上多角度光散射(sec–mals)数据。
a通过超声辐照获得解聚的多糖。注意：mw，重均摩尔质量；rz，z-平均回转半径；mw/mn，多分散性。括号中的值代表相对标准差。
2.解聚cps的轻度高碘酸盐氧化：
唾液酸(neu5ac)在猪链球菌血清型2cps的重复单元序列中作为组分存在允许使用温和条件以实现甘油侧链的c8-c9之间的氧化切割，因此留下游离的末端醛作为反应基团用于随后通过还原氨基化缀合至tt(reuteretal.glycoconjj1989；6:35-44)。期望的氧化百分比也是关键参数：太少反应基团会产生不良缀合物，而太多会留下很少天然多糖的完整表位(reuteretal,1989)。为了保留cps免疫原性，目标是10％水平的氧化，留下全部neu5ac的90％未受影响。对于～115,000da长的cps，这导致每条链平均9个氧化的neu5ac。预实验之后，选择0.1当量的高碘酸钠/neu5ac，并且氧化两个不同的cps批次。如通过过乙酰化甲基糖苷的gc-fid分析确定的获得9.2-9.4％的在c8处的可重复氧化水平。在这些条件下未观察到在c7处的氧化。1hnmr研究发现没有多糖的其他结构修饰(数据未示出)。
在黑暗中将解聚的猪链球菌血清型2cps(8.8mg,6.7μmol)用1.1ml水中的620μm高碘酸钠温育，在室温下磁力搅拌1h。添加过量的2当量三甘醇/高碘酸盐1h以消耗任何残余的高碘酸盐。将混合物对水透析(spectra/por,mwco1,000；spectrumlaboratories)并冻干。在初步试验中确定氧化的最佳条件(数据未示出)。
通过改编自以前描述的方法(houdeetal.infectimmun.2012；80:506-17)的过乙酰化甲基糖苷的气相色谱(gc)分析评价唾液酸(neu5ac)残基的氧化程度。简单地说，通过在室温下添加100μl水中的nabh4(10mg/ml)1h还原氧化的cps(0.4mg)。用甲醇中的5％乙酸溶液终止反应并利用n2流蒸发干燥。重复蒸发3次，每次添加250μl甲醇。通过甲醇分解作用确定残余物的组成。为了这个目的，将产生hcl的甲醇(465μl)和乙酰氯(35μl)添加至残余物。将溶液在75℃下加热17h，蒸发干燥，然后添加500μl叔丁醇并再次蒸发干燥。将甲基糖苷用150μl吡啶和150μl乙酸酐在100℃下乙酰化20min。将冷却的溶液用5ml的水和1ml的ch2cl2分配。通过利用火焰离子检测的gc(gc-fid)分析包含过乙酰化甲基糖苷的有机层。在装有30-m乘0.32-mm(0.25-μm粒径)hp-5毛细管柱的hewlett-packard型号7890气相色谱仪(agilenttechnologies,santaclara,ca,usa)上利用以下温度程序进行gc-fid分析：50℃保持2min，30℃/min增加至150℃，然后3℃/min增加至230℃，并且保持5min。注射器和火焰离子检测器的温度分别为225℃和250℃。
3.破伤风类毒素(tt)单体的纯化：
在缀合之前通过凝胶过滤色谱获得tt单体。将1毫升包含4.5mg/ml蛋白(如通过改进型lowry蛋白测定确定的)的液体制品装载至用pbs(20mmnahpo4ph7.2,150mmnacl)中平衡的superdex200prepgrade(gehealthcarelifesciences,uppsala,sweden)填充的xk16-100柱上，并且用相同缓冲液洗脱。在两个峰中从柱洗脱蛋白：较早的洗脱峰包含寡聚类毒素，而对应于150,000的mr的较晚洗脱峰包含破伤风类毒素单体。将对应于较晚(单体)峰的级分汇集，对去离子水脱盐并利用centriconplus-70离心过滤装置(30kultracelplmembrane；millipore,billerica,ma,usa)浓缩，然后冻干。
4.通过还原氨基化将2型cps缀合至tt：
将高碘酸盐处理的2型cps(3.6mg,40nmol)和纯化的tt单体(3.0mg,20nmol)溶于2.2ml的0.1m碳酸氢钠ph8.1中用于2:1缀合比例。添加氰基硼氢钠(7.5mg,120μmol)，并且将混合物在37℃和轨道摇动下温育2天。对于1:1缀合比例，以如上文所述的相同方式进行缀合，除了使用1.8mg(20nmol)氧化的cps。然后将硼氢化钠(4.7mg,124μmol)添加至反应混合物以还原任何剩余的游离醛基团。将缀合物制品对水大量透析(spectra/por,mwco3,500；spectrumlaboratories)并冻干。如下文所述通过sds-page上的凝胶迁移、免疫印迹和高效液相色谱(hplc)控制缀合。在预实验中利用不同的cps比tt比例、不同的cps氧化％和不同的温育时间确定通过还原氨基化缀合的条件(数据未示出)。
通过还原氨基化将解聚-氧化的cps和纯化的tt单体以2条cps链:1tt的摩尔比或1:1的摩尔比缀合(wesselsetal.jclininvest1990；86:1428-33)。在预实验期间发现缀合的最佳温育时间是2天(数据未示出)。温育之后，通过添加硼氢化钠还原剩余的醛基团。然后通过对水大量透析从缀合物混合物消除试剂。
用不同的cps:tt比例获得了两种缀合物疫苗制剂。据发现2:1缀合物疫苗是最有免疫原性的，即导致显著较高滴度的igg2b和igg2c抗cps同种型。免疫原性的这种差异可能起因于2:1中比1:1缀合物疫苗中高的总cps百分比(分别为55％和37％)，这可能影响缀合物调节免疫细胞的能力，包括抗原呈递细胞(apc)，可能通过其易于摄取和内化的较高分子量/大小。
实施例2:
缀合物检测和纯化
凝胶迁移、蛋白印迹和hplc分析证实cps成功缀合至tt：通过凝胶迁移和蛋白印迹实验(图1a-1d)以及通过hplc分析(图2)证实不同制品中缀合物的存在。对于凝胶迁移实验，考马斯蓝(图1a)和银染(图1b)均显示从150kda的纯化的tt单体(泳道2)相当大地迁移至缀合物中超过250kda的厚条带(泳道3-4)。这种迁移由共价添加随机数量的115kdacps链至蛋白所致。考马斯蓝(图1a)、银染(图1b)或利用抗cpsmab的蛋白印迹(图1c)均未显示在所有凝胶中作为对照包括的解聚cps的任何条带(泳道5)，说明其在这些测定条件下通过凝胶迁移的能力很弱。利用抗ttmab对照染色(图1d)显示单克隆抗体结合的表位保留在缀合物中。tt抗原性的保留至关重要，因为它是允许产生t细胞依赖性抗cps体液应答的关键机制。应当注意2:1和1:1缀合物制品之间信号强度的差异(图1a-1d，泳道3-4)可能与10μg装载样品/泳道内蛋白含量的总量(分别为4.5μgvs.6.3μg)有关。当使用抗cpsmab时仅对大于250kda的条带观察到阳性信号，表明缀合物中cps和tt之间键的共价性质(图1c，泳道3-4)。
hplc分析(图2)显示缀合物(＞250kda)的洗脱，游离cps(100kda)和游离tt(150kda)的洗脱。通过整合来自色谱图的uv280nm信号，估计来自混合物的48±6％(平均值±sd)的蛋白含量实际上发现在缀合物级分中。总的来说，凝胶迁移和蛋白印迹实验加上两种缀合物样品的hplc分析显示2cps:1tt和1:1制品中缀合物的存在。
实施例3:
小鼠免疫：
将5-6周龄的c57bl/6雌性小鼠(charlesriver,wilmington,ma,usa)在第0天用0.1mlpbs中的不同剂量的猪链球菌缀合物制品皮下免疫并在第21天加强。在目的是比较不同佐剂的第一套实验中，3组(n＝10)接受按照制造商的推荐用20μg的cpg寡脱氧核糖核酸(odn)1826(invivogen,sandiego,ca,usa)、
在所有实验中，为了追踪抗体应答，在免疫后第1、7、14、21、28、35和41天将小鼠通过尾静脉每周采血(10μl)。如上文所述将稀释的血液直接用于elisa测试。在免疫后第42天将小鼠人道安乐死，采集血清并冷冻在-80℃下用于elisaig滴定和分型，以及用于opa分析(如上文所述)。
乳化佐剂对多糖抗原表现出比cpgodn高的免疫调节特性：利用2:1缀合物制剂，在小鼠模型中利用自交系c57bl/6小鼠进行免疫方案的优化。
在预实验期间，观察到缀合单独不足以诱导针对猪链球菌2型cps的强免疫学应答(数据未示出)。在这方面，已知亚单位疫苗如果与佐剂组合会诱导更有效和持久的抗原特异性免疫(o'haganandvaliante.natrevdrugdiscov.2003；2:727-35)。已显示佐剂不仅可以提高缀合物疫苗的免疫原性，而且还可以不同地指导抗多肽抗体同种型向期望的igg亚类转变(chuetal.infectimmun.2000；68:1450-6；和fattometal.vaccine.1995；13:1288-93)。据显示目前进行用于人疫苗的临床试验的cpgodn1826(bodeetal.expertrevvaccines2011；10:499-511)以血清型和小鼠年龄依赖性方式对肺炎球菌缀合物增强从igm同种型转变至igg2a和igg3亚类(chuetal.infectimmun.2000；68:1450-6；andkovariketal.immunology.2001；102:67-76)。
比较3种不同佐剂的表现。cpgodn是具有未甲基化的cpg基序的细菌寡核苷酸的合成版本，并且充当toll样受体9(tlr9)配体，对th1应答具有免疫调节特性(chuetal.,1997)。
基于文献(sommarivaetal.jtranslmed.2013；11:25)，选择添加20μg的cpg的剂量用于佐剂化。平行地，对于
因为认为
用缀合物疫苗观察到对抗体水平的剂量-应答效应：
利用
即使在高剂量(25μg)的游离cps下，在整个免疫期间未观察到显著的总ig[g+m]原发性或记忆性抗体应答(图4a-4h)。相比之下，当用2:1缀合物制品免疫小鼠时观察到剂量-应答效应，如在每周采集的血液样品上测量的，25μg剂量产生最高的总ig[g+m]抗cps抗体应答。
猪链球菌2型cps缀合至tt在小鼠中诱导抗体同种型转变：
不仅加强之后较强的应答(如图3a-3f和4a-4h中说明的)，而且抗体同种型转变也是缀合物免疫原性和诱导t细胞依赖性应答能力的良好指标。因此，在用
为了确定cps比tt比例对缀合物免疫原性的影响，制备另一缀合物制剂，这时利用1cps:1tt的比例(在图1a-d中示出)并在
免疫的小鼠表现出相似的igm滴度，减少(但没有显著不同)的igg1和igg3滴度，以及比
为了证实观察到的免疫原性事实上是由于疫苗制剂中存在的缀合物，并且不仅是由于剩余的游离cps和tt，研究中包括两个额外的对照。第一个对照是对应于来自2:1缀合物制品的缀合物的hplc分离的特异性级分。第二个对照是与缀合之前相同的2:1比例的游离cps和游离tt的混合物。一般来说，在2:1缀合物制剂和特异性2:1缀合物hplc-级分之间未观察到大差异，然而，用后一制品观察到较高滴度的igg1、igg2b和igg3(图5b、e和f，p＜0.01)。相比之下，与2:1缀合物制剂相比，未缀合的cps和tt的混合物给出强igm滴度但是非常低滴度的igg1(图5b和d)(p＜0.01)。此外，在用这种对照未缀合的制品免疫的小鼠中未观察到igg2c(图5c)亚类的产生。
最后，来自用热灭活细菌重复注射的小鼠的对照超免疫血清导致针对cps抗原的高滴度的igm(图5d)，产生igg2b(图5e)和igg2c(图5c)，但是不存在igg1(图5b)和igg3(图5f)亚类(图5a-f)。当用
抗体的功能活性：
强抗体应答不一定反映对象的保护(goyette-desjardinsetal.methodsmolbiol.2015；1331:81-92)。在这方面，优选功能测定，如调理吞噬测定(opa)，公认的对胞外荚膜革兰氏阳性细菌如肺炎球菌(s.pneumonia)的保护性免疫的相关性(plotkinsa.clinvaccineimmunol.2010；17:1055-65；songjy,etal.jinfectchemother.2013；19:412-25；和romero-steineretal.clinvaccineimmunol.2006；13:165-9)。在opa期间，来自免疫血清的调理抗体或调理靶细菌，其反过来触发补体经典途径的激活。沉积的抗体和/或补体会分别被fc受体和补体受体识别，通过血液白细胞触发增强的免疫应答，其导致细菌吞噬作用和杀菌活性(goyette-desjardinsetal.methodsmolbiol.2015；1331:81-92；guilliamsetal.natrevimmunol.2014；14:94-108；underhillandozinsky.annurevimmunol.2002；20:825-52；和ricklinetal.natimmunol.2010；11:785-97)。特异性细胞类型激活取决于免疫血清中存在的ig同种型/亚类，因为每种同种型/亚类对fc受体具有不同的结合偏好，其不同地影响细胞应答(goyette-desjardinsetal.,methodsmolbiol.2015；1331:81-92；和underhillandozinsky,2002)。除了igm，小鼠中对ti抗原的保护性抗体的主要亚类是igg3(leeetal.critrevmicrobiol.2003；29:333-49；perlmutteretal.jimmunol.1978；121:566-72；rubinsteinandstein.jimmunol.1988；141:4352-6；和schreiberetal.jinfectdis.1993；167:221-6)。利用小鼠单克隆抗体的研究表明1型亚类(igg3＞＞igg2b≥igg2a)在调理吞噬活性和补体激活中优于2型igg1亚类。然而，小鼠igg亚类的这些功能特性看来取决于靶抗原(蛋白与碳水化合物)、抗原分布以及细菌对抗体/补体攻击的敏感性(michaelsenetal.scandjimmunol.2004；59:34-9；和mclayetal.jimmunol.2002；168:3437-43)。
代替使用细胞系或单一细胞类型，利用来自幼稚小鼠的全血将opa标准化(goyette-desjardinsetal.,methodsmolbiol.2015；1331:81-92)。这个模型考虑所有血液白细胞，因此代表全身感染期间所有免疫细胞和细菌之间复杂相互作用的更真是模型，正如猪链球菌的情况。
如图6a所示，来自用
因此，结果证实获得最高细菌杀死值的两组是2:1缀合物疫苗和用
实施例4:
猪中的免疫原性和保护：
基于以前的结果，选择2:1缀合物制剂以评价猪链球菌天然宿主：猪中的免疫原性和保护。选择佐剂
将猪以3周的间隔肌肉内注射两次，并且在第0、21和34天采集血清样品用于抗cps抗体的滴定和分型(图7a)。在免疫后第21天，2:1缀合物疫苗诱导的总ig[g+m]抗cps滴度明显高于(p＜0.01)安慰剂和菌苗的。加强之后，在免疫后第34天，对两个免疫接种组均观察到与第21天相比抗cps滴度增加。但是，仅来自用2:1缀合物制剂免疫接种的猪的滴定明显高于安慰剂对照组(p＜0.001)。在加强注射之后(第34天)还测定了不同猪igg亚类的滴度，即igg1和igg2。40％用2:1缀合物疫苗免疫的猪表现出显著水平的抗cpsigg1亚类(图7a)。未观察到转变为igg2亚类(数据未示出)。相比之下，用菌苗免疫接种猪不能诱导抗cpsig类别转变(图7a和未示出的数据)。
在研究的第36天，将猪用3x109cfu的atcc700794(毒性猪链球菌血清型2菌株)的剂量腹腔内攻击。安慰剂组中的大部分猪在猪链球菌感染的全身阶段死亡，达到86.7％的死亡率。相比之下，用菌苗或2:1缀合物疫苗免疫的猪分别表现出28.6％和30.0％的死亡率。存活曲线的分析(图7b)显示一到第3天免疫组和安慰剂组之间就有显著差异(p＝0.009)。在猪中猪链球菌攻击感染的全身阶段，2:1缀合物疫苗诱导的保护与对照2型菌苗的相似。
在攻击之后还连续7天监测猪的临床表现(行为、运动问题或cns表现)。在对菌苗免疫接种组的所有观察的31.6％中以及在对缀合物免疫接种组的所有观察的28.1％中观察到异常行为。这与安慰剂组中的发现相比明显较低，其中90.7％的观察显示异常行为(表2，调整的p值＜0.05)。与安慰剂组的89.3％相比，在菌苗免疫接种组的所有观察的26.3％中以及在缀合物免疫接种组的所有观察的33.5％中观察到跛行(表2，调整的p值＜0.05)。当对每组每天分析临床评分的分布时也观察到这些差异(数据未示出)。仅在很少猪中观察到cns表现，并且在三个攻击组之间未观察到统计显著差异(表2)。这可以通过仅在攻击后的7天时间观察动物的事实解释，因为研究设计主要集中在疾病的全身阶段。
表2：用猪链球菌血清型2实验攻击之后免疫的猪的临床评价a。
a评价行为，包括表明攻击对中枢神经系统(cns)和运动的影响的任何行为。对行为的观察数字评分如下：0＝生理，1＝抑郁，2＝冷漠。对运动的观察评分为0＝生理，1＝轻微至中度跛行，2＝严重跛行/不愿站立，3＝动物部分/完全倒下；动物可以起立，但是在10秒内再次躺下。cns表现评分为0＝不存在和1＝存在。
b累积观察期的评价。评价的百分比，其中行为、运动或cns表现跨越数天给出＞0的值。数据表示为最小二乘均数(经逆变换，％)。
c调整的p-值(scheffé’s检验)：所有值与攻击对照组相比；评价中不包括严格对照组。ns，不显著，p≥0.05。
将所有发现死亡的猪以及所有安乐死的猪尸检。胸腔(即纤维蛋白、过量流体、心包炎)或关节中大体病变的频率在免疫接种动物中与安慰剂组相比全面减少。然而观察到的差异未达到统计显著性(表3)。缀合物疫苗显著减少来自关节拭子的攻击菌株回收率(p＜0.01)。与安慰剂组相比，猪链球菌攻击菌株还较少从脑膜和心包拭子分离，然而差异没有统计上不同(表4)。
表3：来自攻击的猪的尸检(或尸体剖检)的大体病理观察a。
a记录胸腔(包括浆膜表面、心脏和肺)和关节(包括过量流体、纤维蛋白、肿胀)的严重表现。
b具有病理发现/观察的动物的百分比。
cp-值：所有值与攻击对照组相比；评价中不包括严格对照组。ns，不显著，p≥0.05。
表4：在攻击的猪的尸检(或尸体剖检)时从拭子回收猪链球菌血清型2a。
a来自拭子的培养物通过形态学、用2型抗血清血清分型和通过猪链球菌2型pcr确认。
b具有至少一种来自拭子培养物的阳性猪链球菌2型分离株的动物的百分比。
cp-值：所有值与攻击对照组相比；评价中不包括严格对照组。ns，不显著，p≥0.05。
因此，总的来说，检测并发现抗cpsigm和igg1抗体在用毒性猪链球菌血清型2体内致死剂量攻击中具有明显的保护作用。虽然菌苗诱导与缀合物疫苗相似水平的保护，但是这种保护与抗cps抗体无关。这与以前的数据是一致的，表明整个猪链球菌(活的或杀死的)在小鼠或猪模型中不能诱导显著水平的抗cps抗体(calzasetal.infectimmun.2015；83:441-53)。因此，绝对需要将cps缀合至载体蛋白以产生调理抗cps抗体，已知其针对荚膜细菌是高度保护性的。在另一方面，菌苗产生的保护可能与抗蛋白抗体有关。但是，与猪链球菌2型的普遍抗原cps相反，蛋白抗原因菌株来源或序列类型(st)变化(fittipaldietal.futuremicrobiol.2012；7:259-79；galinaetal.canjvetres.1996；60:72-4；gottschalketal.canjvetres.1998；62:75-9；okwumabuaetal.femsmicrobiollett.1999；181:113-21；fittipaldietal.emerginfectdis.2011；17:2239-44；和liy,etal.infectimmun.2006；74:305-12)，因此不易通用。
统计分析：猪研究的总结和数据分析由生物统计学家利用
可以根据本公开制备和执行本文公开并要求保护的所有组合物和方法而无需过多实验。虽然本发明的组合物和方法已根据优选实施方案来描述，但是本领域技术人员会清楚变化可以应用于所述组合物和方法以及本文所述方法的步骤或步骤的顺序而不背离本发明的概念、精神和范围。更具体地，显而易见化学和生理相关的某些物质可以取代本文描述的物质，同时会获得相同或相似结果。本领域技术人员显而易见的所有这类相似的取代和修改被视为在如以下权利要求定义的本发明的精神、范围和概念内。
参考文献
如果它们提供示例性程序或补充本文所示那些的其他细节，则以下参考文献特别地援引加入本文。
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