本发明涉及兽用生物制品领域，具体涉及一种猪肺炎支原体灭活疫苗与猪瘟活疫苗组合疫苗及其制备方法。
背景技术：
猪支原体肺炎(MPS)又称猪气喘病或地方性流行性肺炎(SEP)，是由猪肺炎支原体(Mhp)引起的一种接触性慢性呼吸性传染病，不同年龄、品种的猪均能感染发病；患病猪主要表现为咳嗽和气喘，剖解时以肺部病变为主，出现“肉变样”或“胰变样”，发病率高，死亡率低，是引起继发感染，造成养猪业经济损失严重的疾病之一。
猪瘟对养猪生产危害严重，我国将其列为一类重大动物疫病，当前主要采取免疫、净化等措施控制该病，而目前越来越多的猪场使用疫苗预防该病。
技术实现要素：
针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种猪肺炎支原体灭活疫苗与猪瘟活疫苗组合疫苗及其制备方法，旨在提供一种组合疫苗，提升免疫效果。
为解决上述的技术问题，本发明采用的技术方案为：
一种猪肺炎支原体灭活疫苗与猪瘟活疫苗组合疫苗，包括猪肺炎支原体灭活疫苗和猪瘟活疫苗，用一头份的猪肺炎支原体灭活疫苗稀释一头份的猪瘟活疫苗；其中，猪肺炎支原体灭活疫苗CCU不低于108/头份，猪瘟活疫苗病毒每头份含量不低于150兔体感染量。
进一步地，猪肺炎支原体灭活疫苗的制备方法如下：
(1)制备一级生产种子：将冻干菌种启封，按10％的接种量将菌种接种于液体培养基中，于37～37.5℃培养3～7天，且培养基pH值为6.8时，得一级生产种子，并于-20℃以下保存备用；
(2)制备二级生产种子：按10％的接种量将一级生产种子接种于液体培养基中，于37～37.5℃培养3～7天，且培养基pH值为6.8时，得二级生产种子，并于-20℃以下保存备用；
(3)菌液培养：按8％～10％的接种量将二级生产种子接种于液体培养基中，于37℃培养3～7天，且培养基pH值为6.8～7.0时，得菌液；
(4)浓缩灭活：过滤步骤(3)所得菌液，并将滤液浓缩为原体积的1/10～1/2，再在2～8℃的条件下，在搅拌的同时加入菌液体积0.2％的β-丙内酯，灭活处理24h后，回温至37℃，保持2h，得猪肺炎支原体灭活疫苗。
进一步地，猪瘟活疫苗的制备方法如下：
(1)制备单层次代细胞；
(2)制备新鲜脾毒；
(3)取去脂肪、清洗后的新鲜脾毒，剪碎并研磨，再加入100mL乳汉液，过滤，收集滤液，得脾毒液，再将脾毒液于2～8℃的条件下放置60min，每15～20min振荡一次，于2～8℃、3000r/min的条件下离心15min，取上清液，并向其中加入100mL维持液，摇匀，36～37℃培养，得脾毒种；
(4)除去步骤(1)所得次代细胞中的营养液，接种步骤(3)所得脾毒种，再向其中加入瓶体容积1/10的维持液，包扎后，于37℃、9～11r/h的条件下培养，得猪瘟活疫苗。
进一步地，步骤(1)中培养基为改良Goodwin氏A26液体培养基。
进一步地，改良Goodwin氏A26液体培养基包括0.2％水解乳蛋白Hanks液、牛心消化液、25％酵母液以及1/80乙酸铊；其中，0.2％水解乳蛋白Hanks液、牛心消化液、25％酵母液以及1/80乙酸铊体积比为50:30:2:1。
进一步地，步骤(3)中维持液包括犊牛血清、双抗溶液和碳酸氢钠；其中，犊牛血清、双抗溶液和碳酸氢钠的体积比为4:1:6。
进一步地，猪肺炎支原体毒株为HP-G株，保藏编号为CCTCCNO.V2001661。
上述猪肺炎支原体灭活疫苗与猪瘟活疫苗组合疫苗的制备方法，包括以下步骤：
用一头份的猪肺炎支原体灭活疫苗稀释一头份的猪瘟活疫苗，混合，即得猪肺炎支原体灭活疫苗与猪瘟活疫苗组合疫苗；其中，猪肺炎支原体灭活疫苗CCU不低于108/头份，猪瘟活疫苗病毒每头份含量不低于150兔体感染量。
本发明的有益效果为：
采用猪肺炎支原体灭活疫苗稀释猪瘟疫苗，形成一种组合疫苗，且猪肺炎支原体灭活疫苗和猪瘟疫苗具有协同免疫功能，可有效提升组合疫苗的免疫效果。
组合疫苗可简化接种程序，节省人力、物力，减少接种次数，可降低发生不良反应的几率，提升免疫效果。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。
实施例
一种猪肺炎支原体灭活疫苗与猪瘟活疫苗组合疫苗及其制备方法，包括以下步骤：
1、猪肺炎支原体灭活疫苗的制备
(1)制备一级生产种子：将冻干的菌种启封，然后按照10％的接种量将菌种接种于改良Goodwin氏A26液体培养基中，于37～37.5℃振荡培养3～7天，待培养基pH值下降至6.8时，即可收获一级生产种子，并将其保存于-20℃以下，保存时间不超过2个月，继带不超过5代；
改良Goodwin氏A26液体培养基包括0.2％水解乳蛋白Hanks液、牛心消化液、25％酵母液以及1/80乙酸铊；其中，0.2％水解乳蛋白Hanks液、牛心消化液、25％酵母液以及1/80乙酸铊体积比为50:30:2:1。
培养基制备方法：将上述成份混匀，于121℃的条件下，高压灭菌20分钟；待培养基温度下降到37℃时，加入20％无特异性抗体猪血清(56℃灭活30分钟)160ml，青霉素(250单位/ml)20万，用NaOH调pH值至7.5～7.6。
(2)制备二级生产种子：按10％的接种量将一级生产种植接种于改良Goodwin氏A26液体培养基中，于37～37.5℃振荡培养3～7天，待培养基pH值下降至6.8时，即可收获二级生产种子，并将其保存于-20℃以下，保存时间不超过2个月；
(3)菌液培养：按8～10％的接种量将二级生产种子接种于改良Goodwin氏A26液体培养基中，于37℃搅拌培养3～7天，待培养基pH值下降至6.8～7.0时，收获菌液；
(4)浓缩灭活：过滤步骤(3)所得菌液，得到滤液，然后将滤液浓缩为其体积的1/10～1/2，在搅拌的状态下加入菌液体积0.2％的β-丙内酯，于2～8℃灭活24h，然后再回温至37℃，保持2h，得到猪肺炎支原体灭活疫苗。
2、猪瘟活疫苗的制备
(1)制备单层次代细胞
采集犊牛睾丸：初生犊牛经颈动脉采血致死后，用0.2％新洁尔灭溶液冲洗阴囊及其周围皮肤，擦干后，用5％碘酊消毒一次，75％酒精脱碘，将睾丸压入阴囊内，固定睾丸，在预定切口处用消毒酒精再次消毒，切下阴囊，打开装有矮缸的专用包装袋，以无菌操作采取牛睾丸，浸泡待用。
将装有牛睾丸的矮缸移到百级工作台，将处理后的牛睾丸用镊子夹出放在小平皿上，以无菌操作除去被膜、副睾，称量睾丸重量，用其重量除以5，确定所用细胞瓶数。
组织的消化：将0.25％胰蛋白酶溶液倒入500ml抽滤瓶中，加入适量的7.5％的碳酸氢钠，使溶液pH值为8，将牛睾丸倒入抽滤瓶中，塞紧瓶口，置37℃水浴锅中水浴，消化完毕后，用消毒酒精消毒抽滤瓶表面，移至百级工作台。
细胞分散：弃去胰蛋白酶溶液后，用乳汉液脱酶，再用玻珠振摇法分散细胞，并加入乳汉液稀释，待组织块沉淀后，通过纱囊过滤收取细胞悬液于细胞瓶中。
单层原代细胞的制备：将细胞悬液加入包括犊牛血清、双抗溶液和碳酸氢钠溶液的生长液中，充分摇匀，再分装于细胞瓶中，装量约为瓶容积的1/10，塞紧瓶口，转至37℃温室中，放置转速为9～11转/小时的转瓶机上培养待其长成致密单层；其中，犊牛血清、双抗溶液和碳酸氢钠溶液的体积比为4:1:6。
牛睾丸次代细胞的制备：
将长满致密单层原代细胞瓶移到百级工作台，去掉其瓶塞细胞管上的小反口胶塞，在直管上接上已准备好的单胶管，倒掉废液。
先将EDTA和0.25％胰白蛋酶按体积比为1:1的比例配制好细胞消化液，将其加入细胞瓶中消化细胞，当细胞层出现空隙后，倒掉消化液，在细胞瓶中加入乳汉液轻轻振摇细胞瓶，使细胞脱落分散形成细胞悬液。
将细胞悬液加入包括犊牛血清、双抗和碳酸氢钠溶液的营养液中，摇匀，平均分装于洁净的空细胞瓶内，装量约为瓶容积的1/10，塞上小反口胶塞并包扎好，转运并放置在37℃温室转瓶机上旋转培养，待其形成良好单层次代细胞；其中，犊牛血清、双抗溶液和碳酸氢钠溶液的体积比为20:1:3。
(2)制备新鲜脾毒
取购自中国兽医药品监察所的猪瘟弱毒冻干毒种(编号为AV1412，0.1g/支)，用灭菌生理盐水按5mL/瓶稀释，按1mL/只耳静脉注射家兔。
测体温：接种家兔24小时后，每6小时测体温一次，观察72小时，并按定型热判定原则判定大兔的热型反应，选取经典的定型热兔备用，热型判定接种家兔的体温反应分为四类：
①定型热反应﹙﹢﹢﹚潜伏期24～48小时，体温上升呈明显曲线，超过常温1℃以上，至少有3个温次，并稽留12～36小时。
②轻热反应﹙﹢﹚潜伏期24～72小时体温上升有一定曲线，超过常温0.5℃以上，至少有2个温次，稽留12～36小时。
③可疑反应﹙±﹚潜伏期不到24小时，或超过72小时以上，体温曲线起伏不定，或稽留不到12小时，或稽留超过36小时而不下降。
④无反应﹙－﹚体温正常者，注：常温为家兔接种前3天所测体温的平均温度。
潜伏期由接种时算起到体温上升超过常温0.5℃以上的间隔时间。
稽留期由体温上升超过0.5℃算起，到体温下降或接近常温间隔时间。
选择定型热反应兔，从体温下降及其以后的24小时内剖杀，得到合格脾毒，于-15℃以下放置保存，且保存期限不超过6个月。
(3)取去脂肪、清洗后的新鲜脾毒，剪碎并研磨，再加入乳汉液，过滤，收集滤液，得脾毒液，再将脾毒液于2～8℃的条件下放置60min，每15～20min振荡一次，于低温、3000r/min的条件下离心15min，取上清液，并向其中加入维持液，摇匀，36～37℃培养，得脾毒种；
(4)除去步骤(1)所得次代细胞中的营养液，接种步骤(3)所得脾毒种，再向其中加入瓶体容积1/10的维持液，包扎后，于37℃、9～11r/h的条件下培养，接毒后的第五日为第一次猪瘟疫苗收获期，并对维持液进行更换，其后每隔4日更换维持液，并收获猪瘟疫苗。
3、用一头份的猪肺炎支原体灭活疫苗稀释一头份的猪瘟活疫苗，混合均匀，即得猪肺炎支原体灭活疫苗与猪瘟活疫苗组合疫苗；其中，猪肺炎支原体灭活疫苗CCU不低于108/头份；猪瘟活疫苗病毒每头份含量不低于150兔体感染量。
实验例
1、对猪肺炎支原体灭活疫苗进行灭活检验，其具体过程如下：
取1ml猪肺炎支原体灭活疫苗菌液接种于50ml改良Goodwin氏A26液体培养基中，37℃培养，于第5、10日各移植一次，最后一次移植后继续培养观察14日；在接种和移植的同时分别接种改良Goodwin氏A26固体培养基，37℃培养，观察14日。
2、将24头同等重量的猪随机分为4组，每组6头，根据表1免疫方案进行免疫实验。
表1免疫方案
结果
1、固体培养均无支原体生长，且液体培养基本不变色，由此判断，灭活检验合格。
2、无论是单独猪肺炎支原体灭活疫苗和猪瘟疫苗，还是用猪肺炎支原体灭活疫苗(HP-G株)稀释猪瘟疫苗后再免疫，猪的体温、食欲、精神状态均正常，未见免疫副反应发生。
3、用猪瘟间接ELISA抗体检测试剂盒检测Ⅰ组、Ⅲ组和Ⅳ组猪瘟免疫后0d、7d、14d、21d和28d时猪瘟抗体效价，结果见表2，猪瘟抗体阳性数统计结果见表3。
表2猪瘟抗体检测结果
表3猪瘟抗体阳性数统计结果
由表2可知，与Ⅰ组相比，免疫后14d-28d，Ⅲ组和Ⅳ组猪瘟抗体水平均极显著升高(P<0.01)，免疫组平均IE值均远大于10％；Ⅳ组猪瘟抗体水平略高于单独免疫组，表明猪肺炎支原体灭活疫苗与猪瘟疫苗具有一定的协同免疫作用，提升组合疫苗的免疫效果。
由表3可知，猪瘟单独免疫组，用猪肺炎支原体灭活疫苗稀释猪瘟疫苗组，在14d-28d时猪瘟抗体阳性率均为100％。
4、用猪肺炎支原体间接血凝抗体检测试剂盒检测Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅳ组猪二免后0d、7d、14d、21d和28d的Mhp抗体效价，其结果见表4。
表4猪肺炎支原体抗体阳性数统计结果
由表4可知，免疫后7d抗体开始转阳，抗体效价达1:16；免疫后14d抗体效价为1:16、1:32、1:32、1:32、1:32、1:32；免疫21d时，效价均达1:32。