一种用于心肌修复的可注射水凝胶及其制备与应用的制作方法

本发明涉及生物医学材料、组织工程与医学领域，尤其涉及一种用于心肌修复的可注射水凝胶及其制备与应用。

背景技术：

心肌梗塞常常导致心肌组织的损伤以及心室腔的扩张，从而使得心脏的正常功能收到损伤。心肌梗塞后导致的心力衰竭仍然是导致死亡率高的主要原因。心脏衰竭的病人1-5年的死亡率大致为43％，并且其一年期的死亡率是33％。因此，许多治疗手段被应用在心肌梗塞的治疗上，但是这些治疗手段大多都是药物治疗或是冠状动脉搭桥手术以及心脏移植等。然而这些治疗方法常常受到诸多限制并且预后也不是十分理想，所以需要寻找新的手段去治疗心肌梗塞，解决由于心肌梗塞导致的心肌受损的问题

海藻酸钠水凝胶是一种天然高分子水凝胶，其在多价离子存在的条件下易成凝胶。通过控制多价离子的释放速度和释放总量，可以有效的控制海藻酸钠的凝胶速度和得到凝胶的硬度。从而能够对于心肌损伤部位起到一定的填充作用，在一定程度上防止心室腔扩张。并且水凝胶凝固后呈现多孔隙结构，这些空隙能够为细胞的生长提供有效的空间。

生物活性玻璃是一种含有钙(ca)、硅(si)的陶瓷材料，具有可控的机械性能和降解速率、良好的生物活性、能在体内抑制炎症并促进成血管分化。其释放的离子能够刺激细胞分泌血管内皮生长因子(vegf),碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)等生长因子来刺激内皮细胞等细胞等增殖和分化，从而促进血管再生，对于改善心肌梗塞部位的状况具有良好的效果。

葡萄糖酸内酯是一种凝固剂，可作为药剂添加剂，具有无毒，可内服，固化效果佳等特点，可应用于多种药物制剂中。

目前在生物材料及医学领域，心肌梗塞导致的心肌受损仍然是一个需要解决的问题，科技人员也在不断地寻找新的思路与方法。

因此，本领域的技术人员致力于开发一种用于心肌修复的可注射水凝胶及其制备与应用。

技术实现要素：

有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是提供一种用于心肌修复的可注射水凝胶及其制备与应用。

为实现上述目的，本发明第一方面提供了一种用于心肌修复的可注射水凝胶。

在一个优选的实施例中，该用于心肌修复的可注射水凝胶主要成分为海藻酸钠，生物活性玻璃和药物添加剂

进一步地，上述用于心肌修复的可注射水凝胶中的药物添加剂是葡萄糖酸内酯。

进一步地，上述用于心肌修复的可注射水凝胶中海藻酸钠、生物活性玻璃和葡萄糖酸内酯的质量比(克)包括但不限于1:1:1到4:2:1。

进一步地，上述用于心肌修复的可注射水凝胶中海藻酸钠、生物活性玻璃和添加剂(葡萄糖酸内酯)在水凝胶中的质量体积(克/毫升)百分比各自独立为1％～2％。进一步地，上述用于心肌修复的可注射水凝胶中含有海藻酸钠、生物活性玻璃、葡萄糖酸内酯，葡萄糖酸内酯会使水凝胶中形成弱酸性环境，从而使得生物活性玻璃持续缓慢的释放出在有效浓度之上的钙离子、硅离子，可注射水凝胶以液态注入体内后，能够填充任意创面，同时凝胶后呈现多孔隙结构，可供细胞生长，促进血管再生，改善心肌梗塞。

其中，凝胶的时间为30sec到3min。

本发明第二方面提供了上述可注射水凝胶的制备方法，在一个优选的实施例中，该制备方法的步骤如下：

1)将海藻酸钠配置成海藻酸钠水溶液；

2)将葡萄糖酸内酯与所述海藻酸钠水溶液混匀；

3)将生物活性玻璃加入步骤2)中的获得的溶液中，混合均匀，获得所述可注射水凝胶。

优选地，该方法中：

(1)将海藻酸钠溶液吸入注射器内；

(2)利用三通管将葡萄糖酸内酯均匀地混合在海藻酸钠溶液中；

(3)按比例在混合有葡萄糖酸内酯的海藻酸钠溶液中加入生物活性玻璃，并借助三通管将生物活性玻璃均匀的分散在海藻酸钠溶液中；

进一步地，上述可注射水凝胶混合均匀后为液态，通过注射器注射进入心肌缺损部位，液态水凝胶会凝胶形成固体，防止被心脏排出

进一步地，上述可注射水凝胶的制备方法中，步骤(1)中海藻酸钠溶液的质量体积(克/毫升)百分比为1％～2％；

进一步地，上述可注射水凝胶的制备方法中，步骤(2)中海藻酸钠、生物活性玻璃、添加剂的混合溶液，其中海藻酸钠、生物活性玻璃、药物添加剂的质量体积(克/毫升)百分比包括但不限于为1％～2％；

进一步地，上述可注射水凝胶的制备方法中，步骤(2)、步骤(3)中使用三通管进行混匀。

本发明的第三个方面提供了上述可注射水凝胶在修复心肌损伤上的应用。

上述可注射水凝胶具有促进血管再生，改善心肌梗塞，防止心室腔进一步扩大的作用。水凝胶中的生物活性玻璃在葡萄糖酸内酯的弱酸性环境下能够不断产生钙、硅等离子，促进内皮细胞的血管化，从而改善心肌损伤的情况。

本发明的可注射水凝胶可以通过控制不同的配比来控制凝胶的时间，从而保证以液体状态注射进入心脏的水凝胶能够充分的贴合创面，并形成支撑和保护，从而在一定程度上避免了心室腔的进一步扩张。同时，可注射水凝胶的多孔隙结构能够为细胞的生长提供充足的空间和支撑。

在实际应用中，利用本发明的可注射水凝胶能够在保护心肌受损的心室腔不进一步扩张的同时，通过生物活性玻璃在弱酸性的环境下分解产生的钙、硅等离子来促进vegf,bfgf等生长因子的分泌来促进内皮细胞等细胞等成血管作用，从而在很大程度上改善受损心肌部位的病理生理情况，同时水凝胶内大量的空隙为细胞提供了良好的生长条件。

本发明中的可注射水凝胶制备方法简单，易操作，成本低。临床上可单独或是配合药物或手术来改善受损心肌。相较于目前已有的手术治疗和药物治疗，本发明的可注射水凝胶可以用来填充心肌缺损的部位并起到支撑的作用，从而防止心肌损伤的进一步扩大，有效阻止心室腔的进一步扩张，同时原材料价格低廉，易于灭菌，通过刺激人体本身的细胞来改善心肌梗塞后的心脏。本发明中的可注射水凝胶操作简便，可以用于微创注射使用，减少病患在治疗过程中的痛苦以及避免二次伤害，减少医护人员的工作强度，并且对于病患无特殊的要求，应用广泛且实用性高。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。

本说明书中公开的任一特征，除非特别叙述，均可被其他等效或具有类似目的的替代特征加以替换。即，除非特别叙述，每个特征只是一系列等效或类似特征中的一个例子而已。

下面将结合具体附图对本发明可注射水凝胶及其的制备方法作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。

附图说明

图1是可注射水凝胶用于心肌修复的示意图；

图2是可注射水凝胶通过注射器的示意图；

图3是可注射水凝胶凝胶后的内部结构示意图；

图4是水凝胶内的生物活性玻璃尺寸分布的示意图；

图5是凝胶后内部生物活性玻璃降解比例的示意图；

图6是人内皮细胞培养试验对照组细胞血管化的示意图；

图7是人内皮细胞培养试验水凝胶试验组细胞血管化的示意图；

图8是人内皮细胞培养试验水凝胶试验组和对照组细胞血管化指数对比的示意图；

图9是防止心室腔扩张试验he染色和manson染色对比的示意图；

图10是防止心室腔扩张试验相对疤痕厚度及梗死扩展指数对比的示意图。

具体实施方式

本发明具体实施方式中使用的原料、设备若无特殊说明，为已知产品，通过购买市售产品获得。以下所述sa即海藻酸钠，bg即生物活性玻璃，gdl即葡萄糖酸内酯。

实施例1

可注射水凝胶的制备：

(1)将2g海藻酸钠(sa)粉体溶于100ml去离子水中不断搅拌制备得到2％中黏度海藻酸钠溶液；

(2)将2％的sa溶液与萄糖酸内脂(gdl)粉末研磨混合均匀，其中，gdl的最终质量体积(克/毫升)百分比为2％；

(3)将生物活性玻璃(bg)粉末加入步骤(2)中制得的混合溶液中，混合均匀，其中，bg的最终质量体积(克/毫升)百分比为2％。最终，配制成海藻酸钠、葡萄糖酸内脂、生物活性玻璃质量体积(克/毫升)百分比均为2％的可注射水凝胶。

上述制备方式中，可以通过任何方式进行混合，比如借助三通管将葡萄糖酸内酯均匀地混合在海藻酸钠溶液中，借助三通管将生物活性玻璃均匀的分散在混合了葡萄糖酸内酯的海藻酸钠溶液中。

可注射水凝胶转移到注射器中，以液体的形式注射进入心肌损伤处，从而填充满整个创面，而后水凝胶会在30s到3min的时间内在创面凝固。

如图1所示，可注射水凝胶通过注射进入心脏受损部位后，形成凝胶，同时凝胶释放的钙离子、硅离子可以刺激血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子的释放，促进血管生成，进而达到减少心肌梗死面积，促进心脏受损部位再生的目的。

实施例2

可注射水凝胶的外观和微观结构分析。

图2所示的是实施例1中制备的可注射水凝胶通过注射器的示意图。将实施例1中制备的可注射水凝胶冷冻干燥后，用光学显微镜观察水凝胶及其连接界面，如图3所示，可注射水凝胶中显示有大量空隙可均匀分布有生物活性玻璃颗粒。

对分布于水凝胶内的生物活性玻璃进行sem扫描电镜测量其尺寸分布，如图4所示，生物活性玻璃粒直径为正态分布，主要集中于30微米。

将含有生物活性玻璃的水凝胶按体积比1:4浸泡在杜氏改良伊格尔(dmem)培养液中，测量含有生物活性玻璃的水凝胶在培养液中释放出的离子浓度，以生物活性玻璃的离子比例推算其降解速率，推算方法为测量培养液内离子的浓度，换算成离子的量，通过元素守恒换算为生物活性玻璃降解的量。如图5所示，水凝胶中生物活性玻璃5到15天的时间内能够缓慢降解并释放有效离子。，且其中硅离子的浓度一直稳定在0.5ug/ml～1.06ug/ml，大致处在有效浓度内。

实施例3

可注射水凝胶对于血管再生的促进作用。

将实施例1中制备的可注射水凝胶与人的内皮细胞共培养，培养方法：采用的水凝胶其配比为2％质量体积分数的海藻酸钠溶液1ml，0.02g葡萄糖酸内酯，0.02g生物活性玻璃以实施例1中的方式制备成水凝胶，将其浸泡在4ml内皮细胞培养液中，将浸泡1d、3d、5d的培养液取出，过滤后留待备用。将内皮细胞以600000个/ml的密度接种在24孔板内，设置对照组和实验组，对照组始终以内皮细胞培养基(ecm)培养，结果如图6所示。实验组待细胞贴壁后，将培养液更换为之前提取的水凝胶浸提液与正常培养液1:1用以培养，可注射水凝胶试验组培养结果如图7所示，可注射水凝胶能够很大程度上促进内皮细胞的血管化，如图8所示，与对照组相比较，可注射水凝胶试验组分别在环形面积、节点面积和血管面积三方面显著促进了内皮细胞的血管化。环形面积指的是在人脐静脉内皮细胞血管化的过程中，形成的细胞首尾相连形成特定环状的面积。节点面积则是指在血管化过程中，形成的环状结构中相交的节点面积，而血管面积则是指的是形成封闭的环状初步呈现血管状结构的面积。

实施例4

可注射水凝胶对于防止心室腔扩张的作用。

首先制备大鼠心梗模型。采用sprague-dawley(sd)大鼠，雄性，体重200g左右，按体重3％腹腔注射戊巴比妥钠，以仰卧的姿势将大鼠放置在手术台中心位置处，采用外置光源照射气管，声门开启时插入自制的导管，然后使气管插管与小动物呼吸机相连，肉眼可见的心脏搏动最强烈的地区进行开胸手术，通常位于胸骨左侧的第三条肋骨和第四条肋骨之间。用准备好的适度大小的纱布置于大鼠切口周围；然后用小镊子轻轻提起心包膜。在左心耳与肺动脉圆锥之间预判左前降支并其走向，用7-0手术线活结结扎左前降支冠状动脉。进针深度为1～1.5mm，宽2～3mm。将实施例1中制备好的可注射水凝胶，通过注射器注射进入心肌梗塞部位，分别与未进行水凝胶注射正常对照组的大鼠，仅注射海藻酸钠溶液的大鼠，仅注射生物活性玻璃的大鼠进行对比。实验结束后对大鼠进行缝合并给青霉素预防感染。如图9所示，通过he染色和masson染色检测，可注射水凝胶可明显减少心肌损伤部位心室腔的进一步扩大。如图10所示，使用图像分析软件imagej测量以下指标：室间隔厚度(mm)，心梗瘢痕厚度(mm)，左室腔面积(mm²)，左室面积(mm²)。每个指标测量三次算平均值。然后计算一下指标：心梗瘢痕厚度比值＝心梗瘢痕厚度/室间隔厚度。心梗扩张指数＝左室腔面积/左室面积。通过对比实验检测相对疤痕的厚度以及梗死扩展指数证明本发明水凝胶到对心肌损伤部位明显的修复作用。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。