免疫球蛋白制剂和用于免疫球蛋白制剂的存储系统的制作方法

发明领域

本发明涉及具有提高的存储稳定性的免疫球蛋白(Ig)制剂。

本发明进一步涉及用于Ig制剂的存储系统，用于提供这样的存储系统的方法和具有低于20vol-％氧含量的气体用于提高Ig制剂存储稳定性的用途。

发明背景

用于Ig替代治疗的Ig制剂，例如，用于治疗原发性免疫缺陷(PID)病，如普通易变型免疫缺陷(CVID)和X-连锁丙种球蛋白缺乏症，是本领域公知的。这样的Ig制剂通常获自人血浆并且存储于小瓶中，用于进一步的使用。然后，可以将制剂通过静脉内(IVIg)或皮下(SCIg)给药于需要治疗的病人。

使用皮下途径时，具有相对高Ig浓度的Ig制剂是理想的，因为这使得与较低浓度的制剂相比，允许较低频率的给药和/或较小体积的给药。

如果存储几个月，已知的Ig制剂的颜色易于变成浅黄色。对于具有相对高的Ig浓度并且暴露于应激条件(如，光暴露和/或升高的温度)的Ig制剂，这种影响特别明显；所述制剂在存储两个月后，通常显示出相对深的黄-棕色。

然而，这样的着色与Ig制剂的标准要求是相矛盾的。例如，欧洲药典要求制剂保持清澈-黄色或浅棕色。

处理这个问题的一种可能的方法是将Ig制剂存储在黑暗环境中。进一步的方法是将Ig制剂存储在相对低的温度下，例如，约5℃。尽管两种方法已经显示出导致浅黄色着色的减轻，但它们操作不方便，并且对于实施相对繁重，因为在整个存储阶段中必须维持各自的环境。

技术实现要素：

因此，本发明的目的是提供一种用于Ig替代治疗的Ig制剂，其显示出降低的浅黄色着色，并且因此使得遵循涉及着色的标准要求，甚至在光和室温下延长存储后。再一个目的是提供以使得浅黄色着色降低的方式来存储制剂的存储系统，因此使得遵循涉及着色的标准要求，甚至在如暴露于光和升高温度的应激条件下延长存储后。

通过根据独立权利要求的Ig制剂和存储系统解决了这个问题。优选的实施方案是从属权利要求的主题。

根据第一个方面，本发明因此涉及包含至少4％质量-体积百分比(即，4g/100ml)Ig的Ig制剂。与天然产生的生物流体相反，本发明的液体Ig制剂因此富含Ig。已知其相对高的Ig浓度，因此该制剂适用于Ig替代治疗。10％或更高的制剂适用于皮下给药，这可以通过病人自己来进行。

出人意料地发现了如果室温下的制剂中溶解的氧浓度低于200μmol/l，可以实现在延长的时间段内对抗浅黄色着色的高稳定性。优选，浅黄色着色是由应激因素引起的，而不是光暴露，即，在黑暗中发生的，不是由光降解引起的。特别地，可以获得只显示出轻微的浅黄色着色或根本没有浅黄色着色的稳定Ig制剂，因此满足例如欧洲药典的标准要求，即使在24个月，甚至36个月，或更长的延长时间段后。特别地，可以获得在室温下且黑暗中满足标准要求的稳定Ig制剂，即使在24个月，甚至36个月的延长存储阶段后。在25℃且黑暗中存储24个月后，稳定的免疫球蛋白制剂的吸光度A_350-500nm保持低于0.28，优选稳定的免疫球蛋白制剂具有20％w/v的浓度。在本发明的优选实施方案中，在37℃且黑暗中存储6个月后，测量为20％Ig制剂时，吸光度A_350-500nm保持低于0.355。在25℃且黑暗中存储36个月时，稳定的免疫球蛋白制剂显示出低于0.18，优选低于0.17，甚至更优选低于0.16的A_350-500nm的增加。在37℃且黑暗中存储6个月时，稳定的免疫球蛋白制剂显示出低于0.22，优选低于0.20，甚至更优选低于0.19的A_350-500nm的增加。

用于测定Ig制剂中溶解的氧浓度的方法是本领域技术人员已知的。例如，可以通过极谱法，使用例如Clark电极来测定氧浓度。或者，例如，发光氧传感也可以用于测定制剂中的氧浓度。

当包含在容器中时，可以使用延伸至容器中并延伸至其中所含的Ig制剂中的电极来测定Ig制剂的氧浓度。或者，可以在打开容器后测定Ig制剂的氧浓度。在这后一种情况中，在打开容器后的5分钟内进行测定，以避免接触免疫球蛋白制剂的气体的氧含量增加引起的相应的误差结果。

不希望受到理论的束缚，假设通常使用常规Ig制剂看到的浅黄色着色是由于其中所含的Ig的氧化改变引起的。根据本发明，通过将制剂中溶解的氧含量维持在浓度低于如果将制剂存储在大气压的空气下确定的浓度下，将降低这种氧化改变。

已知事实是：根据本发明，可以获得如下的Ig制剂，其甚至在延长的存储后仍然只显示出轻微的浅黄色着色或根本没有浅黄色着色，病人和医生可以容易地知道其中所含的Ig是品质良好的，其进一步引起制剂可接受性的提高。

除了预示低程度的可能的氧化Ig改变，无色或仅有轻微颜色的制剂在视觉上比黄色或黄色-棕色制剂更有吸引力。

如果在室温下溶解的氧浓度低于175μmol/l，优选低于150μmol/l，更优选低于125μmol/l，最优选低于100μmol/l，则可以获得特别高稳定性的本发明的Ig制剂。

因为对于常规Ig制剂，对于具有高Ig浓度的制剂，浅黄色着色的影响特别明显，本发明特别涉及包含至少5％，优选至少10％，更优选至少12％，更优选至少14％，更优选至少16％，更优选至少18％，最优选至少20％质量-体积百分比Ig的制剂。优选，Ig制剂是多克隆Ig制剂，更优选多克隆IgG制剂。

可以通过其中给出的各自的方法(Ph.Eur.5.5，2006，General methods 2.2.2Degree of Coloration of Liquids)来确定Ig制剂与欧洲药典各自的着色要求的顺从性。

或者，还可以通过分光光度方法来测定与着色要求的顺从性，已经发现其结果与根据欧洲药典的方法的结果相关。具体地，已经发现了具有低于0.355的平均光密度A_350-500nm(即，350nm下的吸光度减去参照波长500nm下的吸光度)的Ig制剂满足欧洲药典各项要求。

在黑暗中在25℃下存储超过24个月时，根据本发明仅获得约0.1的光密度(吸光度)A_350-500nm的平均增加，在黑暗中在25℃下存储超过36个月时，仅获得约0.15的光密度的平均增加(对应于大约每月增加0.004的吸光度)。在光暴露和5℃下存储超过3个月时，根据本发明仅获得约0.04的光密度(吸光度)A_350-500nm的平均增加(对应于大约每月增加0.01的吸光度)，这与根据本发明的其中氧浓度没有降低的Ig制剂的平均增加形成明显对比，所述增加为约1.2(对应于大约每月增加0.40的吸光度)。此外，在黑暗中在37℃下存储超过6个月时，根据本发明仅获得约0.18的光密度A_350-500nm的平均增加(对应于大约每月增加0.03的吸光度)，这与根据本发明的其中氧浓度没有降低的Ig制剂的平均增加形成明显对比，所述增加为约0.24(对应于大约每月增加0.04的吸光度)。

本发明的Ig制剂可以用于静脉内和皮下给药于病人，作为非限制性实例，用于治疗PID或CVID。然而，优选用于皮下给药。

已知Ig的高浓度，本发明使得可以将较小体积的制剂给药于病人，同时维持与具有较低Ig浓度的常规可用制剂相当的功效。

由于根据本发明的Ig制剂优选用于皮下给药于人，因此本发明还涉及Ig制剂用于制备皮下给药于人的药物的用途。例如，如S.Misbah等，Clinical and Experimental Immunology，158(增补1)；pp.51-59所报道的，制剂的皮下给药存在各种优于静脉内给药的优势。特别地，不需要静脉入口，并且降低了对皮质类固醇和抗组胺的前驱给药的需求。

此外，使用皮下给药途径时，使用每月一次的IVIg灌输通常能看到的显著峰得到抑制，并且获得持续升高的Ig水平，导致全身性的副作用降低。

优选，本发明的Ig制剂中所含的Ig基本上由IgG组成，但不限于此。根据本发明制剂的其他优选实施方案中，Ig分别包含IgM或基本上由IgM组成或包含IgA或基本上由IgA组成。

根据另一个方面，本发明进一步涉及用于Ig制剂(优选多克隆Ig制剂)的存储系统，所述存储系统包含容器，该容器具有内部，所述内部的第一个部分由Ig制剂占据，所述内部的剩余第二个部分形成顶部空间并由气体占据，其中在顶部空间的气体中，氧含量低于20vol-％。在本发明的内容中，术语“vol-％”具有技术领域中常用的意思并且表示各自的气体成分相对于包含其的气体的总体积的体积比。

本发明的存储系统的顶部空间中的气体因此与周围的空气相比具有降低的氧含量。如果存储在这样的存储系统中，Ig制剂中溶解的氧由此在延长的存储时间段中保持在低于200μmol/l的浓度，优选低于175μmol/l，更优选低于150μmol/l，再更优选低于125μmol/l，并且最优选低于100μmol/l，并且浅黄色着色可以显著降低，即使Ig制剂存储在光和室温下。

用于测定顶部空间气体中的氧含量的方法是本领域技术人员已知的。例如，可以通过激光吸收光谱法，特别是可调二极管激光吸收光谱法来测定氧含量，由此消除顶部空间中所含的其他成分的干扰。具体地，可以通过LaserGas^TM II型(LaserGas Oy，芬兰)的装置，由此通过单-模式二极管扫描氧的吸收线来测定氧含量。基于可以计算顶部空间气体的氧含量，通过检测仪测量氧分子对光的吸收。

优选在顶部空间的气体中，氧含量低于16vol-％，优选低于12vol-％，更优选低于10vol-％，并且最优选低于7vol-％。已经发现低于7vol-％的氧含量特别优选，因为存储在容器中的各自顶部空间下的Ig制剂已经完全符合欧洲药典的需求，即使在24个月或更长时间的延长存储时间段后，甚至在36个月或更长时间的存储时间段后，即使在25℃(黑暗中)下存储时亦如此，以下将详细显示。

根据非常直接并且因此优选的实施方案，顶部空间的气体至少大约是在大气压下的。

进一步优选在顶部空间的气体中，惰性气体的含量高于80vol-％，优选高于84vol-％，更优选高于88vol-％，更优选高于90vol-％，并且最优选高于93vol-％。惰性气体可以是例如氮气、氩气、其他惰性气体或其混合物。已知其可用性，优选使用氮气。

进一步优选气密性存储系统的容器包括小瓶，特别是由DIN/ISO8362-1标准化的小瓶。

根据进一步优选的实施方案，顶部空间与Ig制剂的体积比为约0.1:1至0.9:1，这取决于所用的小瓶。对于6R小瓶，例如，比例通常为约0.9:1，而对于20R小瓶，比例通常为约0.1:1。

特别地，本发明的存储系统提高了Ig制剂在室温且黑暗下在24个月，甚至36个月的延长存储时间段后的稳定性。使用20％Ig制剂作为参照时，本发明的存储系统提供了免疫球蛋白制剂的吸光度A_350-500nm在25℃且黑暗中存储24个月时保持低于0.28，优选20％Ig制剂在37℃且黑暗中存储6个月后测量时，吸光度A_350-500nm保持低于0.355。本发明的存储系统提供了稳定的免疫球蛋白制剂，其在25℃且黑暗中存储36个月时，显示出低于0.18，优选低于0.17，更优选低于0.16的A_350-500nm增加。本发明的存储系统提供了稳定的免疫球蛋白制剂，其在37℃且黑暗中存储6个月时，显示出低于0.22，优选低于0.20，更优选低于0.19的A_350-500nm增加。

根据进一步的方面，本发明还涉及用于提供用于Ig制剂的存储系统的方法，包括步骤：将Ig制剂填入容器中，并将容器密封，其中在密封之前，用气体填充容器的顶部空间，使得顶部空间气体中的氧含量低于20vol-％，优选低于16vol-％，更优选低于12vol-％，再更优选低于10vol-％，并且最优选低于7vol-％。这种顶部空间的“惰性气体充气”使得溶解氧的浓度在延长的存储时间段中保持在低于200μmol/l的浓度，优选低于175μmol/l，更优选低于150μmol/l，再更优选低于125μmol/l，并且最优选低于100μmol/l。优选，延长的存储时间段是在25℃(或室温)且黑暗下长于24个月，优选甚至长于36个月。特别地，本发明的方法提高了Ig制剂在室温且黑暗下在24个月，甚至36个月的延长存储时间段后的稳定性。使用20％Ig制剂作为参照时，本发明的方法提供了免疫球蛋白制剂的吸光度A_350-500nm在25℃且黑暗中存储24个月时保持低于0.28，优选20％Ig制剂在37℃且黑暗中存储6个月后测量时，吸光度A_350-500nm保持低于0.355。本发明的方法提供了稳定的免疫球蛋白制剂，其在25℃且黑暗中存储36个月时，显示出低于0.18，优选低于0.17，更优选低于0.16的A_350-500nm增加。本发明的方法提供了稳定的免疫球蛋白制剂，其在37℃且黑暗中存储6个月时，显示出低于0.22，优选低于0.20，更优选低于0.19的A_350-500nm增加。

优选，所获得的存储系统的顶部空间的气体是在大气压下的。

以上方法替换地或另外地，通过将Ig制剂或其溶剂接受脱气步骤和/或使用惰性气体的充气步骤，可以获得以上限定的具有降低的溶解氧浓度的Ig制剂。因此优选在Ig制剂配制前，将Ig制剂的溶剂，通常是水，接受脱气和/或充气步骤。例如，可以通过将溶剂存储在升高的温度或降低的压力下来获得脱气。例如，可以通过将惰性气体引入各自的制剂或其溶剂中来进行使用惰性气体的充气。

根据以上所述的，根据进一步的方面，本发明还涉及具有低于20vol-％氧含量的气体用于提高包含至少4％质量-体积百分比免疫球蛋白的免疫球蛋白制剂的存储稳定性的用途。如以上所给出的，由此优选将该气体用于其中存储Ig制剂的容器的顶部空间中。

使用本发明的存储系统，或本发明的方法，或根据本发明的具有低于20％氧含量的气体的用途，在黑暗中存储延长时间段时，可获得Ig制剂在350nm处的吸光度平均增加至少10％，优选可以获得超过12％、14％、16％、18％或20％，更优选超过25％、30％、35％、38％、40％，乃至45％的降低。使用本发明的存储系统或方法，对于包含至少5％，优选至少10％，更优选至少12％，更优选至少14％，更优选至少16％，更优选至少18％，并且最优选至少20％质量-体积百分比Ig的制剂，可以实现这些改善。

以下实施例中给出了根据本发明的方法的详细描述。

实施例

Ig制剂

使用IgPro20来评估本发明获得的技术效果。

IgPro20是即可使用的，用于皮下给药的多价人IgG的20％(200g/l)液体制剂，由大量集合的人血浆制得。其蛋白质部分≥98％IgG，其中超过90％的是单体+二聚体的形式。用pH 4.8的稳定剂L-脯氨酸(250mmol/L)来配制IgPro20，没有使用防腐剂。

Ig制剂的填充

在将IgPro20无菌填入小瓶的过程中，用氮气将小瓶的顶部空间进行充气。

具体地，使用氮气的充气以两个步骤来进行：

a)将Ig制剂引入小瓶后直接通过延伸至顶部空间中的充气针将无菌过滤的氮气填入顶部空间中；

b)将用于密封小瓶的塞子插入过程中，通过再一个相对于开口轴有角度的方向延伸的充气针在小瓶的开口上吹入氮气。

使用Pall Corporation的KA02PFRP8型的无菌滤器，将所用的氮气无菌过滤。将充气设备的操作压设定至约0.5巴。

通过以上程序，可以提供具有顶部空间的存储系统，其在密封小瓶后立即具有低于4.5vol-％的氧含量。已知制剂在填入小瓶之前没有脱气或用惰性气体充气的事实，顶部空间的气体中的氧含量可能提高，直至免疫球蛋白和气体之间建立平衡。即使在这种情况下，氧含量也保持低于7vol-％。

存储条件

根据International Conference on Harmonizaiton(ICH)of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use guideline Q1A(R2)，选择用于IgPro20的长期稳定性项目的存储条件和测试间隔。以下图3中显示了在25℃下长期存储长达24个月。

为了模拟第二次包装，将小瓶存储在37℃的温度下且黑暗中。

根据ICH指导Q5C，容器的水平位置保持溶液与塞子的接触。

浅黄色着色的量化

为了量化Ig制剂的变黄，在存储的几个间隔后测定了350至500nm的平均光密度。这是基于平均光密度可以与液体着色的标准化检查相关联的发现，如欧洲药典中所述的(Ph.Eur.5.6，01/2005，General methods 2.2.2，Degree of Coloration of Liquids)进行的。

附图说明

通过附图说明了本发明获得的技术效果，其中

图1是在5℃和光下，并且没有顶部空间的惰性充气(菱形)下，在顶部空间中各自使用具有16vol-％(方块)、12vol-％(三角)、10vol-％(十字)、7vol-％(星星)和低于7vol-％(圆圈)氧含量的气体存储后，作为存储时间的函数，存储的Ig制剂的光密度(吸光度)A_350-500nm的图示。

图2是在37℃且黑暗中，并且没有顶部空间的惰性充气(菱形)下，在顶部空间中使用至多7vol-％(方块)氧含量的气体存储后，作为存储时间的函数，存储的Ig制剂的光密度(吸光度)A_350-500nm的图示。

图3是在25℃且黑暗中，在顶部空间中使用具有低于7vol-％氧含量的气体存储时，作为存储时间的函数，许多Ig制剂样品的平均光密度(吸光度)A_350-500nm的图示。

如从图1可看到的，通过在顶部空间中使用具有降低的氧含量(并且因此也具有降低氧分压)的气体降低了免疫球蛋白制剂随着时间的变黄。具体地，通过使用具有低于7vol-％氧含量的气体，即使在存储6个月后，光密度A_350-500nm仍低于0.35，因此在延长存储后完全符合欧洲药典的要求。在室温下，溶解于各自样品中的氧浓度低于100μmol/l。

参考图2，根据本发明，在顶部空间中使用至多7vol-％氧含量的气体，在37℃且黑暗中存储超过6个月时，可以获得光密度A_350-500nm的平均增加仅为约0.18。这与没有使用顶部空间充气存储的Ig制剂的平均增加形成明显对比，所述增加为约2.4。

如图3中所示，在25℃且黑暗中存储超过24个月时，根据本发明可以获得平均光密度A_350-500nm的平均增加仅为约0.1。

如以下的表1所示，即使在25℃且黑暗中存储超过36个月后，平均光密度仍然低于0.355，如果存储在5℃且黑暗中，甚至更低。显示了6个不同批次的值。

表1：

表2显示了不同存储条件下吸光度A_350-500nm的平均月增加。对于测试的所有条件，将氧浓度保持低于100μmol/l，或顶部空间中低于7％的氧，导致吸光度的显著降低，表示IgG制剂显著较高的稳定性。将所有样品存储在黑暗中。收集数据持续24或36个月；在该时间过程中，吸光度随时间的增加大致是线性的。

表2：