一种负载生物活性玻璃微粒皮肤再生材料的制备方法与流程

本发明涉及皮肤科学领域，具体是一种负载生物活性玻璃微粒皮肤再生材料的制备方法。

背景技术：

皮肤是人体最大的器官，主要由表皮层、真皮层和皮下组织构成，同时含有丰富的血管和神经。日常生活中由于各种原因如创伤、烧伤、溃疡、手术及先天性畸形等很容易造成皮肤的缺损。皮肤组织虽然具有较强的再生能力，但是对于大面积的全层皮肤缺损，由于真皮层的缺失，皮肤的再生能力明显不足。治疗全层皮肤缺损的关键是重建和再生真皮组织，促进创面尽早封闭，避免微生物入侵等并发症。迄今为止，自体皮移植仍然是临床治疗全层皮肤缺损最有效的方法。但是该方法面临着自体皮供应不足的缺点，如ⅲ度烧伤面积超过30％时供皮部位就已不足。另一个常用的治疗方法就是采用人工皮肤。目前国际市场上人工皮肤有apligraf、integra、transcyte、alloderm和dermagraft等。

皮肤再生材料血管化速度是影响其再生性能、决定材料移植成活率的关键。由于皮肤再生材料中缺乏相互连通的血管网络，难以实现与创面区血管的快速连接。在移植初期，皮肤再生材料中的细胞所需要的营养物质主要依靠扩散作用来实现。在血供实现以前，皮肤再生材料中细胞的增殖和分化等功能常因营养成分的缺乏而受限，甚至导致细胞调亡，从而影响其再生速度和存活率。目前的皮肤再生产品的血管化速率较慢，植入物完全血管化一般需要几周(2-4周)的时间，增加了病人的住院时间和感染风险。因此，如何促进皮肤再生材料的血管化速度，进而缩短创面缺血时间，提高移植存活率，是皮肤再生与修复研究中亟待解决的关键问题。

为了提高皮肤再生材料的血管化速度，采用在植入物上负载血管化因子如内皮细胞生长因子(vegf)、血小板源性生长因子(pdgf)等方法，取得了积极的效果。但由于生长因子不稳定，容易降解，而且直接注射生长因子需要多次重复操作，带来了极大的不便。使用能够快速促进机体自身分泌血管化细胞因子的生物活性支架材料成为一种可行的选择，也是人们研究的一个热门。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种负载生物活性玻璃微粒皮肤再生材料的制备方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种负载生物活性玻璃微粒皮肤再生材料的制备方法，具体步骤如下：

步骤一，将正硅酸乙酯和磷酸三乙酯在2mol/l的硝酸催化下水解形成溶胶，后加入硝酸钙搅拌均匀，经过陈化、干燥、粉磨并且在680-720摄氏度下煅烧2-3小时后得到玻璃粉体；

步骤二，用质量分数为0.05％的na2co3溶液煮沸处理生丝5次，每次1小时，温度为100摄氏度，浴比l:100，用蒸馏水充分洗净，自然干燥，得到纯丝素纤维，用摩尔比为1:2:8的cacl2、ch3ch2oh和h2o三元溶剂溶解，溶液与生丝质量比为10：1，于75-80摄氏度下搅拌溶解1-2小时得到混合溶液，冷却后得到的溶液注入纤维素透析膜中，在流水中透析2-4天，将透析后的溶液风干浓缩，得到丝素蛋白浓缩水溶液；

步骤三，用质量分数为0.3％-5％的乙酸溶液分别配制质量分数为0.1％-1％的丝素蛋白溶液和质量分数为0.1％-1％的壳聚糖溶液，将玻璃粉体、聚乙烯醇、壳聚糖溶液和丝素蛋白溶液混合并且搅拌均匀，其中壳聚糖溶液与丝素蛋白溶液的质量之比为1：4,每10ml壳聚糖溶液和丝素蛋白溶液的混合溶液之中含有1g玻璃粉体和0.5-3g的聚乙烯醇，再进行真空脱泡即可得到聚乙烯醇-生物活性玻璃-壳聚糖-丝素蛋白共混液，将聚乙烯醇-生物活性玻璃-壳聚糖-丝素蛋白共混液注入模具中，采用冷冻-干燥法，在零下50至零下5摄氏度的温度下冷冻干燥，获得聚乙烯醇-生物活性玻璃-壳聚糖-丝素蛋白四维多孔支架；将聚乙烯醇-生物活性玻璃-壳聚糖-丝素蛋白四维多孔支架与质量分数为0.05％-1％的戊二醛溶液中交联1-48小时，反复清洗后，再次在零下50至零下5摄氏度的温度下冷冻干燥，即可得到成品。

作为本发明进一步的方案：步骤一中粉磨后的生物玻璃微粒的颗粒度在5μm-20μm粒度范围的颗粒不小于90％，不允许有多于5％的颗粒其上限值大于20μm粒度尺寸的颗粒存在。

作为本发明再进一步的方案：步骤三中聚乙烯醇-生物活性玻璃-壳聚糖-丝素蛋白支架的孔隙率为90％-100％，孔径为100μm-120μm。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明为创伤、烧伤等深度皮肤缺损和慢性皮肤溃疡的治疗提供了一种性能良好的皮肤替代物，可以显著促进创面的愈合，减少瘢痕的增生，进而减轻病人的痛苦；可以广泛应用于创伤、烧伤和外科整形等方面；本发明制备方法简单，材料来源广泛，生产效率高，适用于产业化生产；与国外同类产品相比，本发明产品成本方面具有很大优势。

附图说明

图1为负载生物活性玻璃微粒皮肤再生材料的制备方法中材料的扫描电镜图。

图2为负载生物活性玻璃微粒皮肤再生材料的制备方法中负载了生物活性玻璃微粒和聚乙烯醇的壳聚糖-丝素蛋白支架扫描电镜图。

图3为负载生物活性玻璃微粒皮肤再生材料的制备方法中负载了生物活性玻璃微粒和聚乙烯醇的壳聚糖-丝素蛋白(2：8)支架植入全层皮肤烧伤创面3、7、14、21、28天后的大体观察图图。

图4为负载生物活性玻璃微粒皮肤再生材料的制备方法中负载了生物活性玻璃微粒和聚乙烯醇的壳聚糖-丝素蛋白(2：8)支架植入全层皮肤烧伤创面3、7、14、21、28天后的h&e图。

图5为负载生物活性玻璃微粒皮肤再生材料的制备方法中负载了生物活性玻璃微粒和聚乙烯醇的壳聚糖-丝素蛋白(2：8)支架植入全层皮肤烧伤创面3、7、14、21、28天后的masson图。

图6为负载生物活性玻璃微粒皮肤再生材料的制备方法中负载了生物活性玻璃微粒和聚乙烯醇的壳聚糖-丝素蛋白(2：8)支架植入全层皮肤烧伤创面3、7、14、21、28天后的cd31的表达。

图7为负载生物活性玻璃微粒皮肤再生材料的制备方法中负载了生物活性玻璃微粒和聚乙烯醇的壳聚糖-丝素蛋白(2：8)支架植入全层皮肤烧伤创面3、7、14、21、28天后的asma的表达。

图8为负载生物活性玻璃微粒皮肤再生材料的制备方法中负载了生物活性玻璃微粒和聚乙烯醇的壳聚糖-丝素蛋白(3：7)支架植入全层皮肤烧伤创面3、7、14、21、28天后的大体观察图。

图9为负载生物活性玻璃微粒皮肤再生材料的制备方法中负载了生物活性玻璃微粒和聚乙烯醇的壳聚糖-丝素蛋白(3：7)支架植入全层皮肤烧伤创面3、7、14、21、28天后的h&e图。

图10为负载生物活性玻璃微粒皮肤再生材料的制备方法中负载了生物活性玻璃微粒和聚乙烯醇的壳聚糖-丝素蛋白(3：7)支架植入全层皮肤烧伤创面3、7、14、21、28天后的masson图。

图11为负载生物活性玻璃微粒皮肤再生材料的制备方法中负载了生物活性玻璃微粒和聚乙烯醇的壳聚糖-丝素蛋白(3：7)支架植入全层皮肤烧伤创面3、7、14、21、28天后的cd31的表达。

图12为负载生物活性玻璃微粒皮肤再生材料的制备方法中负载了生物活性玻璃微粒和聚乙烯醇的壳聚糖-丝素蛋白(3：7)支架植入全层皮肤烧伤创面3、7、14、21、28天后的asma的表达。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本专利的技术方案作进一步详细地说明。

实施例1

将正硅酸乙酯和磷酸三乙酯在2mol/l的硝酸催化下水解形成溶胶，后加入硝酸钙搅拌均匀，经过陈化、干燥、粉磨、700摄氏度煅烧2小时后得到玻璃粉体,研磨过筛后得到生物活性玻璃微粒。sem观察微粒的粒径和形貌结果如图1所示。

用质量分数0.05％na2co3水溶液煮沸处理生丝5次，每次1h，温度100℃，浴比l:100。用蒸馏水充分洗净，自然干燥，得到纯丝素纤维，用摩尔比为1:2:8的cacl2、ch3ch2oh和h2o三元溶剂溶解，溶液与生丝质量比10：1，于78摄氏度下搅拌溶解1-2小时得到混合溶液，冷却后得到的溶液注入纤维素透析膜中，在流水中透析3天，将透析后的溶液风干浓缩，得到丝素蛋白浓缩水溶液。

用质量分数为5％的乙酸溶液分别配制质量分数为1％的丝素蛋白溶液和质量分数为1％的壳聚糖溶液，壳聚糖和丝素蛋白的质量比为2:8，将生物活性玻璃微粒和聚乙烯醇加入壳聚糖-丝素蛋白混合溶液，搅拌均匀，真空脱泡，得到聚乙烯醇-生物活性玻璃-壳聚糖-丝素蛋白混合溶液；将聚乙烯醇-生物活性玻璃-壳聚糖-丝素蛋白共混液注入模具中，采用冷冻-干燥法，在零下50摄氏度温度下冷冻干燥，获得聚乙烯醇-生物活性玻璃-壳聚糖-丝素蛋白四维多孔支架；将聚乙烯醇-生物活性玻璃-壳聚糖-丝素蛋白四维多孔支架与质量分数为1％的戊二醛溶液中交联1小时后用三蒸水多次洗涤，零下50摄氏度冷冻干燥，其微观结构如图2所示，孔径在100-200μm，孔隙率大于90％。在大鼠背部制备全层烧伤创面，植入聚乙烯醇-生物活性玻璃-壳聚糖-丝素蛋白四维多孔皮肤再生支架。图3a、3b、3c、3d、3e分别是负载生物活性玻璃微粒和聚乙烯醇的壳聚糖-丝素蛋白(2：8)支架植入全层皮肤烧伤创面3、7、14、21、28天后的大体观察图。图4a、4b、4c、4d、4e分别是负载生物活性玻璃微粒和聚乙烯醇的壳聚糖-丝素蛋白(2：8)支架植入全层皮肤烧伤创面3、7、14、21、28天后的h&e图。图5a、5b、5c、5d、5e分别是负载生物活性玻璃微粒和聚乙烯醇的壳聚糖-丝素蛋白(2：8)支架植入全层皮肤烧伤创面3、7、14、21、28天后的masson图。图6a、6b、6c、6d、6e分别是负载生物活性玻璃微粒和聚乙烯醇的壳聚糖-丝素蛋白(2：8)支架植入全层皮肤烧伤创面3、7、14、21、28天后的cd31的表达。图7a、7b、7c、7d、7e分别是负载生物活性玻璃微粒和聚乙烯醇的壳聚糖-丝素蛋白(2：8)支架植入全层皮肤烧伤创面3、7、14、21、28天后的asma的表达。从图3可以看出，14天支架完全降解，21天伤口完全愈合。从图4和图5可以看出14天组织中炎症细胞水平很低，说明已基本无感染，21天新出现的表皮和新生的真皮连接紧密，而且有毛囊和血管出现，其组织结构与正常皮肤组织无异。cd31主要是检测新生血管的生成数量，而asma主要是检测成熟血管的生成数量，从图6和图7可以看出，随着时间的增加，新生血管和成熟血管数量明显增加，14天即有大量较大管腔血管形成，表明聚乙烯醇-生物活性玻璃-壳聚糖-丝素蛋白(2：8)四维多孔皮肤再生支架具有促进新生血管和成熟血管生成的作用。

实施例2

将正硅酸乙酯、磷酸三乙酯在2mol/l的硝酸催化下水解形成溶胶，后加入硝酸钙搅拌均匀，经过陈化、干燥、粉磨、700摄氏度下煅烧2小时后得到玻璃粉体,研磨过筛后得到生物活性玻璃微粒。

用质量分数为0.05％的na2co3水溶液煮沸处理生丝5次，每次1小时，温度100摄氏度，浴比l:100，用蒸馏水充分洗净，自然干燥，得到纯丝素纤维。用摩尔比为1:2:8的cacl2、ch3ch2oh和h2o三元溶剂溶解，溶液与生丝质量比10：1，于78摄氏度下搅拌溶解1-2小时得到混合溶液，冷却后得到的溶液注入纤维素透析膜中，在流水中透析3天，将透析后的溶液风干浓缩，得到丝素蛋白浓缩水溶液。

用质量分数为5％的乙酸溶液分别配制质量分数为1％的丝素蛋白溶液和质量分数为1％的壳聚糖溶液，壳聚糖和丝素蛋白的质量比为3:7，将生物活性玻璃微粒和聚乙烯醇加入壳聚糖-丝素蛋白混合溶液，搅拌均匀，真空脱泡，得到聚乙烯醇-生物活性玻璃-壳聚糖-丝素蛋白混合溶液；将聚乙烯醇-生物活性玻璃-壳聚糖-丝素蛋白共混液注入模具中，采用冷冻-干燥法，在零下50摄氏度温度下冷冻干燥，获得聚乙烯醇-生物活性玻璃-壳聚糖-丝素蛋白四维多孔支架；将聚乙烯醇-生物活性玻璃-壳聚糖-丝素蛋白四维多孔支架与质量分数为1％的戊二醛溶液中交联1小时后用三蒸水多次洗涤，零下50摄氏度下冷冻干燥。在大鼠背部制备全层烧伤创面，植入聚乙烯醇-生物活性玻璃-壳聚糖-丝素蛋白(3：7)四维多孔皮肤再生支架。图8a、8b、8c、8d、8e分别是负载生物活性玻璃微粒和聚乙烯醇的壳聚糖-丝素蛋白(3：7)支架植入全层皮肤烧伤创面3、7、14、21、28天后的大体观察图。图9a、9b、9c、9d、9e分别是负载生物活性玻璃微粒和聚乙烯醇的壳聚糖-丝素蛋白(3：7)支架植入全层皮肤烧伤创面3、7、14、21、28天后的h&e图。图10a、10b、10c、10d、10e分别是负载生物活性玻璃微粒和聚乙烯醇的壳聚糖-丝素蛋白(3：7)支架植入全层皮肤烧伤创面3、7、14、21、28天后的masson图。图11a、11b、11c、11d、11e分别是负载生物活性玻璃微粒和聚乙烯醇的壳聚糖-丝素蛋白(3：7)支架植入全层皮肤烧伤创面3、7、14、21、28天后的cd31的表达。图12a、12b、12c、12d、12e分别是负载生物活性玻璃微粒和聚乙烯醇的壳聚糖-丝素蛋白(3：7)支架植入全层皮肤烧伤创面3、7、14、21、28天后的asma的表达。从图8可以看出，14天支架完全降解，21天伤口基本愈合，28天伤口完全愈合。从图9和图10可以看出，术后14天，胶原大量沉积，有新生组织和血管出现。从图11和图12可以看出，14天有大量较大管腔血管形成，表明聚乙烯醇-生物活性玻璃-壳聚糖-丝素蛋白(3：7)四维多孔皮肤再生支架具有促进新生血管和成熟血管生成的作用。

丝素蛋白具有良好的生物相容性、易加工性和可降解性，近年来在生物医学领域的应用研究非常活跃，丝素蛋白支架植入后，可以在早期促进周围组织vegf和cd34等的表达，有利于组织血管化。

生物活性玻璃是一种具有良好生物相容性和可降解性的无机类生物活性材料，能够在植入部位迅速发生一系列表面反应，促进细胞迁移、增殖和组织修复。由于其化学组成与人体骨骼类似，常被用于骨和软骨组织工程支架材料。本发明将生物活性玻璃微粒与壳聚糖、丝素蛋白进行复合，考察其在皮肤再生修复方面的性能。

壳聚糖作为一种天然高分子材料，不仅具有良好的生物相容性，而且具有抗菌、灭菌的作用，但是由于力学性能不足，使得其难以单独作为皮肤再生支架材料。

本发明制备的负载生物活性玻璃微粒的皮肤再生材料，其突出特点是以可生物降解的丝素蛋白为主要原料，添加壳聚糖和聚乙烯醇起促进交联、耐降解、抗菌和抗感染作用，添加生物活性玻璃微粒促进缺损组织处细胞的迁移、增殖和分化；通过控制冷冻干燥条件，得到具有特定微结构(孔径、孔隙率等)的多孔支架，复合支架材料的孔径和孔隙率与单一材料支架相比明显改善，有利于细胞在支架材料中的粘附、增殖和分化，以及营养物质的输送和废弃物的排出，通过改变壳聚糖和丝素蛋白的比例，得到具有不同机械性能和缺损组织修复能力的皮肤再生支架。结果表明该支架能够有效促进内皮细胞的迁移、增殖和分化，促进成纤维细胞的浸入，具有良好的组织相容性。大鼠全层烧伤缺损试验发现14天即能充分血管化，21天伤口完全愈合。这种皮肤再生材料可作为组织生长的临时支架，促进创面的血管化，肉芽组织、内皮细胞和成纤维细胞在多孔支架内的生长。这些长入的组织或细胞会分泌出相应的细胞外基质进而分化成新的皮肤组织，促进受损皮肤的再生。与此同时，外源性的聚乙烯醇-生物活性玻璃－壳聚糖-丝素蛋白多孔支架会随着新生组织的不断生长而逐渐降解，并被机体吸收，最终得到的是与人体自身完全相似的皮肤组织。

本发明为创伤、烧伤等深度皮肤缺损和慢性皮肤溃疡的治疗提供了一种性能良好的皮肤替代物，可以显著促进创面的愈合，减少瘢痕的增生，进而减轻病人的痛苦；可以广泛应用于创伤、烧伤和外科整形等方面；本发明制备方法简单，材料来源广泛，生产效率高，适用于产业化生产；与国外同类产品相比，本发明产品成本方面具有很大优势。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。