本发明涉及一种新型微乳原位凝胶制剂，以及其在治疗老年黄斑变性病中的用途。
背景技术：
：老年黄斑变性病又称年龄相关性黄斑变性(age-relatedmaculardegeneration,amd或armd)，1885年首次由haab描述，1904年oeller提出采用黄斑盘状变性专用名词，其后在1926年junius和kuhnt对此种病变撰写了分类的专题文章，故又名ku-hnt-junius病。世界卫生组织(who)对老年黄斑下的定义为：“老年黄斑变性病(amd)是一种影响老年人的视力情况，涉及到人的中心视野，其发生在视网膜黄斑(或中心)发展退行性损伤时。一般认为，循环衰竭、黄斑区血流量减少也起到了很重要的作用”。who的一份调研报告显示老年黄斑变性病是继白内障、青光眼之后，全球第三大致盲性疾病。其在各个年龄段均可致病，主要发生在50岁以上的人群中。全球老年性黄斑部病变市场调研报告显示，老年黄斑变性病正以年复合成长率6.62％增长。国内最新关于老年黄斑变性发病率的调查为2005年发表的一份调研报告，调研结果显示我国45岁以上人群的患病率为3.44％～15.15％。我国人口基数大，人口老龄化越来越严重，老年黄斑变性的发病率肯定会高于上述统计数字。老年黄斑变性病的防治形势将更加严峻。目前为止，老年黄斑变性病的发病机制尚不明确，也没有特效的治疗药物及手段。临床上一般使用2种方法进行治疗：药物治疗及手术治疗。fda已经批准的治疗老年黄斑变性病的药物有：贝伐单抗(bevacizumab)、阿瓦斯汀(avastin)、哌加他尼钠(pegaptanibsodium)注射液、康柏西普(conbercept)、阿柏西普(aflibercept)、艾力亚(eylea)、雷珠单抗(ranibizumab)、和诺适得(lucentis)。玻璃体注射制剂价格昂贵，每支的价格在几千元到几万元不等。并且，玻璃体注射制剂使用频繁，一般每月需要注射一次，也有2～3个月注射一次的，患者耐受性差，其在使用中会对眼球造成的一定的损伤，具有一定的风险。由于直接作用于给药部位，玻璃体注射制剂在显效的同时，其副作用也相对较大。目前，我国与治疗老年黄斑变性病制剂相关的专利申请有：cn03117180.x、cn200810244348.x、cn201210343280.7、cn201410818022.9、cn201511035320.1、cn201110117394.5、cn201410158944.1等。然而，以上专利申请涉及的均为口服制剂。治疗老年黄斑变性病的一种局部给药制剂为七叶洋地黄双苷滴眼液(商品名，施图伦)。然而，局部用滴眼液载药量小，患者需要频繁使用才能满足需要；局部滴眼液由于是液体制剂，生物粘附性较差在眼睛里保留的时间较短，极易被消除；局部用滴眼液极难穿透眼球的生理结构到达后眼部位；局部用滴眼液还具有一定的毒副作用；对于水溶性较差的药物(例如，bcsiii和bcsiv类的药物)很难制成局部用滴眼液制剂。川芎、黄芪组合物为中国中医科学院眼科医院的临床有效方，临床上用以治疗老年黄斑变性。文献报道川芎、黄芪组合物对治疗视网膜静脉阻塞(rvo)具有显著的疗效。藁本内酯是川芎、黄芪组合物中的一种重要的活性成分，其具有广泛的药理活性，包括对谷氨酸诱导pc12细胞的凋亡具有保护作用，镇痛抗炎作用，对缺糖缺氧诱导大鼠海马神经元凋亡的保护作用，以及藁本内酯预处理对ogd-r损伤的huvec有保护作用，可对抗细胞氧化损伤，并调节内皮细胞功能。此外，藁本内酯属于一种内酯类化合物，分子量小，脂溶性强具有较强的穿透作用，可以跨越血眼屏障及血脑屏障，达到后眼部位而发挥作用。本发明提供了一种新型的用于治疗老年黄斑变形病的局部用制剂，其应用方便，无刺激性，可提高患者的顺应性，可提高其在眼部的作用时间，克服了现有制剂中存在的缺陷。同时，本发明中涉及的这种新型局部用制剂在低于常温(25℃)时为澄清透明的液体，滴入眼睛之后转变成凝胶。在滴加入眼睛之前方便样品的制备、包装、贮存及使用，滴入眼睛之后形成原位凝胶将大大延长其在眼部的作用时间。本发明涉及的微乳原位凝胶可以协助活性成分直接作用于后眼部位而发挥疗效技术实现要素：本发明目的在于提供一种治疗老年黄斑变性病的局部用中药微乳原位凝胶制剂。本发明所述的中药由川芎和黄芪两味药组成，其重量比例为1:1。本发明将中药的脂溶性提取物制成水包油(o/w)型的微乳，而将其水溶性提取物制成温敏性原位凝胶。因此，本发明一方面提供一种微乳原位凝胶组合物，其由微乳和温敏性原位凝胶基质以及作为活性成分的川芎和黄芪提取物组成，其中所述川芎和黄芪提取物包含脂溶性提取物和水溶性提取物，其中脂溶性提取物包载于微乳中，并且水溶性提取物包载于原位凝胶基质中。术语“微乳原位凝胶”是指由微乳部分和原位凝胶部分构成的复合体系。通常将脂溶性成分制成水包油型(o/w)微乳，增加其溶解度及与原位凝胶的相容性，从而构成一个均一的体系。原位凝胶，又称即型凝胶，在作用到指定部位之前为液体状态，作用到指定部位之后转变为凝胶，该种凝胶即为原位凝胶。根据原位凝胶触发机制的不同，又分为温度敏感性凝胶、离子敏感性凝胶和ph敏感性凝胶等，本发明涉及的是一种温度敏感性凝胶，即温敏性原位凝胶。根据本发明所述的微乳原位凝胶组合物，其中所述微乳由表面活性剂、助表面活性剂和油相制得。在本发明的一个实施方案中，根据本发明所述的微乳原位凝胶组合物，其中所述表面活性剂选自辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯(labrasol)、司盘80(sp80)、吐温80、聚氧乙烯氢化蓖麻油rh40、十二烷基硫酸钠(sls)、聚乙二醇4000(peg4000)、和聚乙烯醇/聚乙二醇(3:1)接枝共聚物(collicoatir)中的一种或多种，优选辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯(labrasol)、司盘80(sp80)、吐温80、和聚氧乙烯氢化蓖麻油rh40中的一种或多种，更优选辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯(labrasol)或聚氧乙烯氢化蓖麻油rh40。在本发明另一个实施方案中，根据本发明所述的微乳原位凝胶组合物其中所述助表面活性剂选自聚乙二醇400、丙二醇和甘油中的一种或多种，优选为聚乙二醇400、丙二醇和甘油中的两种的混合物，即聚乙二醇400-丙二醇混合物、聚乙二醇400-甘油混合物、或丙二醇-甘油混合物，更优选为聚乙二醇400、丙二醇和甘油三者的混合物，即聚乙二醇400-丙二醇-甘油混合物。在本发明另一个实施方案中，根据本发明所述的微乳原位凝胶组合物，其中所述油相选自大豆油(so)、油酸(oa)、肉豆蔻酸异丙酯(ipm)、和中链甘油三酸酯(mct)中的一种或多种，优选油酸(oa)、肉豆蔻酸异丙酯(ipm)、和中链甘油三酸酯(mct)中的一种或多种，更优选油酸(oa)。在本发明的一个实施方案中，根据本发明所述的微乳原位凝胶组合物，其中所述温敏性原位凝胶基质选自泊洛沙姆188、泊洛沙姆407、骨质明胶b、海藻酸钠、琼脂、阿拉伯胶、β-环糊精(β-cd)、和聚乙烯醇(pva)中的一种或多种，优选泊洛沙姆188、泊洛沙姆407、和骨质明胶b中的一种或多种，更优选泊洛沙姆188-骨质明胶b混合物或泊洛沙姆407-骨质明胶b混合物。术语“温敏性凝胶”是对温度敏感的一类凝胶的总称，其在未达到相转变温度之前为液体，达到相转变温度之后发生相转变形成凝胶。一般的温敏性凝胶在低温下为液体，高温时发生相转变形成凝胶，如泊洛沙姆407。也有一些温敏性凝胶在高温下为液体，低温时发生相转变形成凝胶，如琼脂。在本发明一个优选的实施方案中，根据本发明所述的微乳原位凝胶组合物，其中，所述表面活性剂和助表面活性剂的重量比例大于等于1:1，优选大于等于4:1，更优选4:1-9:1。在本发明另一个优选的实施方案中，根据本发明所述的微乳原位凝胶组合物，其中，表面活性剂和助表面活性剂混合物与油相的重量比例大于等于4:1，优选大于等于9:1，更优选为9:1。在本发明的一个实施方案中，根据本发明所述的微乳原位凝胶组合物，其中，所述脂溶性提取物由川芎和黄芪在醇类溶剂中提取获得，优选所述醇类溶剂为50％乙醇、70％乙醇、80％乙醇、85％乙醇、95％乙醇、或无水乙醇，更优选为95％乙醇。在本发明的另一个实施方案中，根据本发明所述的微乳原位凝胶组合物，其中，所述水溶性提取物由川芎和黄芪在水性溶剂中提取获得，优选所述水性溶剂为蒸馏水、去离子水、注射用水，更优选为注射用水。在本发明的一个优选的实施方案中，根据本发明所述的微乳原位凝胶组合物，其中，包载有脂溶性提取物的微乳的载药量按重量计大于等于10％，优选大于等于20％，更优选20％-50％。在本发明的另一个优选的实施方案中，根据本发明所述的微乳原位凝胶组合物，其中，包载有水溶性提取物的温敏性原位凝胶基质的载药量按重量计大于等于1.0％，优选大于等于2.0％，更优选为2.0％至6.0％。术语“载药量”是指药物中的含药量与其总重量的比值，具体到本发明中则载药量为提取物重量(含脂溶性提取物、水溶性提取物)与微乳原位凝胶总重量的比值，微乳部分的载药量为脂溶性提取物与微乳总重量的比值，原位凝胶部分的载药量为水溶性提取物与原位凝胶总重量的比值。本发明进一步提供根据本发明所述的微乳原位凝胶组合物的制备方法，其包括以下步骤：1)在醇类溶剂中提取川芎和黄芪，得到脂溶性提取物，优选所述醇类溶剂为50％乙醇、70％乙醇、80％乙醇、85％乙醇、95％乙醇或无水乙醇，更优选为95％乙醇；2)将步骤1)中提取后的药渣用水提取，浓缩至相对密度为50℃1.08～1.12，进行醇沉，优选乙醇，将上清液回收、干燥，得到水溶性提取物；3)将表面活性剂与助表面活性剂混合得到表面活性剂混合物，然后向其中加入油相，搅拌混合直至均匀，得到空白微乳；4)将步骤1)中得到的脂溶性提取物加入至步骤3)中得到的空白微乳中，得到包载有脂溶性提取物的微乳；5)将温敏性原位凝胶基质混合，用水充分溶胀，溶胀温度为4℃，得到空白原位凝胶基质；6)将步骤2)中得到的水溶性提取物加入至步骤5)中得到的空白凝胶基质中，得到包载有水溶性提取物的原位凝胶基质；7)将步骤4)中得到的包载有脂溶性提取物的微乳加入至步骤6)中得到的包载有水溶性提取物的原位凝胶基质中，混合均匀，得到本发明的微乳原位凝胶组合物。本发明另一方面提供根据本发明所述的微乳原位凝胶组合物在制备用于治疗老年黄斑变性病的药物中的用途。本发明涉及的中药微乳原位凝胶具有以下几个方面的特点：(1)本发明涉及的中药微乳原位凝胶具有干预实验性视网膜变性的作用；(2)本发明涉及的中药微乳原位凝胶无刺激性，家兔的一次给药实验和7天给药实验均证明其无刺激性；(3)本发明涉及的中药微乳原位凝胶可以穿透眼球屏障到达后眼部位而起作用，以藁本内酯为指标的组织分布结果显示，其不仅在角膜中能测到，在玻璃体及视网膜中也能测到。具体实施方式以下通过具体实施例进一步描述本发明，但应理解这些实施例仅是为了阐明本发明，并不以任何形式限制本发明的范围。川芎：购自北京仟草中药饮片有限公司黄芪：购自北京仟草中药饮片有限公司七叶洋地黄双苷滴眼液：购自中国中医科学院眼科医院本发明使用的表面活性剂、油相、助表面活性剂及基质辅料均购自北京凤礼精求医药股份有限公司实施例1川芎、黄芪的提取精制称取川芎、黄芪各500g，首先用95％的乙醇提取2次，每次1小时，回收乙醇至无醇味，干燥，即得脂溶性部分，共得脂溶性提取物109.34g，每克脂溶性提取物相当于9.15g生药。将提取后的药渣用10倍体积的水提取2次，每次1小时，浓缩至相对密度(1.08～1.12，50℃)时用2倍体积量的95％乙醇进行醇沉(1～3倍体积)，将上清液回收乙醇至无醇味，干燥，即得水溶性部分，共121.38g，每克水提物相当于8.24g生药。实施例2本发明微乳原位凝胶的制备微乳的制备将实施例1中得到的脂溶性提取物制成微乳，具体操作如下。称取表面活性剂labrasol3.6g，按照重量比9:1的比例称取助表面活性剂0.4g(聚乙二醇4000.2g，甘油0.1g，丙二醇0.1g)，混合均匀后，得表面活性剂混合物。将如上得到的表面活性剂混合物溶解于2倍体积的水中，混合均匀，搅拌30分钟。然后，按照油相与表面活性剂混合物的重量比1:9称取油酸0.44g，少量多次加入到上述溶液中，磁力搅拌混合30分钟直至均匀，得到空白微乳。称取0.2g实施例1中得到的脂溶性提取物，加入0.8g的如上制备的空白微乳，混合均匀，制成载药量为20％的载药微乳。原位凝胶的制备将实施例1中制得的水溶性提取物制成温敏性原位凝胶，具体操作如下。称取温敏性原位凝胶基质泊洛沙姆40717g，用水81.78g使其充分溶胀，即得空白温敏性凝胶基质。称取0.22g实施例1中得到的水溶性提取物，加入如上制备的空白温敏性凝胶基质，搅拌混合均匀，即得载药原位凝胶，载药量为0.2％。微乳-原位凝胶的制备将如上制得的载药微乳，加入到如上制得的载药原位凝胶中，混合均匀，即得本发明的微乳原位凝胶。实施例3本发明微乳原位凝胶的制备二微乳的制备将实施例1中得到的脂溶性提取物制成微乳，具体操作如下。称取表面活性剂聚氧乙烯氢化蓖麻油酸rh407.2g，按照重量比4:1的比例称取助表面活性剂1.8g(聚乙二醇4001.62g，甘油0.18g)，混合均匀后，得表面活性剂混合物。将如上得到的表面活性剂混合物溶解于2倍体积的水中，混合均匀，搅拌30分钟。然后，按照油相与表面活性剂混合物的重量比1:9称取油酸1.0g，少量多次加入到上述溶液中，磁力搅拌混合30分钟直至均匀，得到空白微乳。称取2.27g实施例1中得到的脂溶性提取物，加入2.27g的如上制备的空白微乳，混合均匀，制成载药量为50％的载药微乳。原位凝胶的制备将实施例1中制得的水溶性提取物制成温敏性原位凝胶，具体操作如下。称取温敏性原位凝胶基质泊洛沙姆40717g，用水75.56g使其充分溶胀，即得空白温敏性凝胶基质。称取2.73g实施例1中得到的水溶性提取物，加入如上制备的空白温敏性凝胶基质，搅拌混合均匀，即得载药原位凝胶，载药量2.9％。微乳-原位凝胶的制备将如上制得的载药微乳，加入到如上制得的载药原位凝胶中，混合均匀，即得本发明的微乳原位凝胶。实施例4本发明微乳原位凝胶的制备三微乳的制备将实施例1中得到的脂溶性提取物制成微乳，具体操作如下。称取表面活性剂聚氧乙烯氢化蓖麻油酸rh407.2g，按照重量比4:1的比例称取助表面活性剂1.8g(聚乙二醇4001.62g，丙三醇0.18g)，混合均匀后，得表面活性剂混合物。将如上得到的表面活性剂混合物溶解于2倍体积的水中，混合均匀，搅拌30分钟。然后，按照油相与表面活性剂混合物的重量比1:9称取油酸1.0g，少量多次加入到上述溶液中，磁力搅拌混合30分钟直至均匀，得到空白微乳。称取4.54g实施例1中得到的脂溶性提取物，加入4.54g的如上制备的空白微乳，混合均匀，制成载药量为50％的载药微乳。原位凝胶的制备将实施例1中制得的水溶性提取物制成温敏性原位凝胶，具体操作如下。称取温敏性原位凝胶基质泊洛沙姆40717g和骨制明胶b0.1g，用水68.29g使其充分溶胀，即得空白温敏性凝胶基质。称取5.46g实施例1中得到的水溶性提取物，加入如上制备的空白温敏性凝胶基质，搅拌混合均匀，即得载药原位凝胶，载药量6.0％。微乳-原位凝胶的制备将如上制得的载药微乳，加入到如上制得的载药原位凝胶中，混合均匀，即得本发明的微乳原位凝胶。实施例5本发明微乳原位凝胶的制备四微乳的制备将实施例1中得到的脂溶性提取物制成微乳，具体操作如下。称取表面活性剂聚氧乙烯氢化蓖麻油酸rh407.2g，按照重量比4:1的比例称取助表面活性剂1.8g(丙二醇1.62g，甘油0.18g)，混合均匀后，得表面活性剂混合物。将如上得到的表面活性剂混合物溶解于2倍体积的水中，混合均匀，搅拌30分钟。然后，按照油相与表面活性剂混合物的重量比1:9称取中链甘油三酸酯1.0g，少量多次加入到上述溶液中，磁力搅拌混合30分钟直至均匀，得到空白微乳。称取2.5g实施例1中得到的脂溶性提取物，加入5.0g的如上制备的空白微乳，混合均匀，制成载药量为30％的载药微乳。原位凝胶的制备将实施例1中制得的水溶性提取物制成温敏性原位凝胶，具体操作如下。称取温敏性原位凝胶基质泊洛沙姆18817g和骨制明胶b0.1g，用水72.62g使其充分溶胀，即得空白温敏性凝胶基质。称取2.78g实施例1中得到的水溶性提取物，加入如上制备的空白温敏性凝胶基质，搅拌混合均匀，即得载药原位凝胶，载药量3.0％。微乳-原位凝胶的制备将如上制得的载药微乳，加入到如上制得的载药原位凝胶中，混合均匀，即得本发明的微乳原位凝胶。实施例6本发明微乳原位凝胶的制备五微乳的制备将实施例1中得到的脂溶性提取物制成微乳，具体操作如下。称取表面活性剂聚氧乙烯氢化蓖麻油酸rh403.6g和labrasol3.6g，按照重量比4:1的比例称取助表面活性剂1.8g(聚乙二醇4001.44g，丙二醇0.18g，甘油0.18g)，混合均匀后，得表面活性剂混合物。将如上得到的表面活性剂混合物溶解于2倍体积的水中，混合均匀，搅拌30分钟。然后，按照油相与表面活性剂混合物的重量比1:9称取油酸1.0g，少量多次加入到上述溶液中，磁力搅拌混合30分钟直至均匀，得到空白微乳。称取2.27g实施例1中得到的脂溶性提取物，加入2.27的如上制备的空白微乳，混合均匀，制成载药量为50％的载药微乳。原位凝胶部分将实施例1中制得的水溶性提取物制成温敏性原位凝胶，具体操作如下。称取温敏性原位凝胶基质泊洛沙姆18817g，用水75.56g使其充分溶胀，即得空白温敏性凝胶基质。称取2.73g实施例1中得到的水溶性提取物，加入如上制备的空白温敏性凝胶基质，搅拌混合均匀，即得载药原位凝胶，载药量2.9％。微乳-原位凝胶的制备将如上制得的载药微乳，加入到如上制得的载药原位凝胶中，混合均匀，即得本发明的微乳原位凝胶。试验例1本发明微乳原位凝胶在干预实验性视网膜变性中的作用为了验证根据本发明的微乳原位凝胶组合物对老年黄斑变性病的治疗作用，设计了动物实验。本实验对大鼠的眼睛造成视网膜变性的模型，然后使用根据本发明的微乳原位凝胶组合物进行干预，以观察期疗效。实验方法选用43只sd大鼠(购自北京维通利华实验技术有限公司)，雄性，体重150-180g，随机分为4组：本发明微乳原位凝胶组、模型组、阳性药组(七叶洋地黄双苷滴眼液)、和正常对照组。通过40mg/kg碘酸钠舌下静脉注射，一次性造成视网膜变性模型。造模后第一天开始给药，分别于用药后第7天、14天观察给药后大鼠视网膜的变化及组织病理学情况。给药方案如下：本发明微乳原位凝胶组：实施例1制得的微乳原位凝胶点眼1滴，4次/天，模型组：生理盐水点眼1滴，4次/天，阳性药组：七叶洋地黄双苷滴眼液点1滴，4次/天，正常对照组：正常饲养，不予造模及特殊处理。试验结果视网膜测量：大鼠暗适应2小时后，全身麻醉联合局部麻醉(麻醉剂为水合氯醛，购自国药集团化学试剂有限公司)、散瞳(散瞳剂为复方托吡卡胺滴眼液，购自参天制药(中国)有限公司)，使用动物保温装置(独立送风隔离笼具)，采用大鼠专用环形角膜电极(罗兰电生理电极)，标准闪光刺激诱发视网膜综合电位，通频带为：0.1-1～300-1000hz，单次刺激。按视网膜五项测量，并记录数值，计算秩均值，并采用秩和检验的方法进行统计学分析，结果见表1。表1给药后各组视网膜变化统计表视杆细胞反应为视网膜对视觉刺激所产生的综合电反应，是检测视网膜机能的客观方法之一。统计结果显示，各组b波振幅差异有统计学意义，其中两两比较，正常对照组、本发明微乳原位凝胶组、阳性药组振幅均明显高于模型组，差异有统计学意义(p<0.05)。组织病理学检查：将大鼠的左眼眼球摘除后，置于4％多聚甲醛固定2小时后，小心去除眼前节和部分玻璃体，余下组织固定24小时后脱水、石蜡包埋，4μm连续切片，he染色后评价视网膜病变严重程度，并对视网膜色素上皮细胞数进行计数，并采用秩和检验的方法对数据进行统计学分析，结果见表2。表2给药后各组视网膜色素上皮细胞统计表统计结果显示，各组视网膜色素上皮细胞数量差异有统计学意义，其中两两比较，正常对照组、本发明微乳原位凝胶组、阳性药组的上皮细胞数量均明显低于模型组，差异有统计学意义(p<0.05)。从以上实验可知，本发明微乳原位凝胶对碘酸钠造模的视网膜变性模型具有较好的干预作用，统计学结果显示其与模型组有显著性差别(p<0.05)，与阳性药相似。试验例2刺激性实验取经眼科检查证明双眼符合要求的家兔(spf级雄性家兔，体重3.0±0.5kg，购自中国军事医学科学院实验动物中心，许可证号scxk(京)2015-0108)40只，按照《中药、天然药物刺激性和溶血性研究的技术指导原则》(zgpt4-1)的评分标准进行一次给药试验及7天给药试验。所述的评分标准见下表3和表4。表3表4眼刺激性评价标准-分值评价0～3无刺激性4～8轻度刺激性9～12中度刺激性13～16重度刺激性一次给药试验：家兔30只，眼科检查证明双眼符合要求后，分为3组，采用10％本发明微乳原位凝胶组(以下简称10％微乳原位凝胶组，给予实施例1制得的微乳原位凝胶)、凝胶基质组(仅给予对应的凝胶基质)、生理盐水组(仅给予生理盐水)，每组10只。给药后第1、3、24、72小时作眼科检查(结膜、角膜、虹膜、分泌物)，评分(依据zgpt4-1中的评分标准)，进行同体双眼比较。结果见表5。表5给药后72小时各组评分情况结论：一次给药的结果显示10％微乳原位凝胶无刺激性。7天给药试验：家兔30只，眼科检查证明双眼符合要求后，分为3组，每组10只，分别为10％本发明微乳原位凝胶组(以下简称10％微乳原位凝胶组，给予实施例1制得的微乳原位凝胶)、凝胶基质组(仅给予对应的凝胶基质)、生理盐水组(仅给予生理盐水)，每组10只。每天给药4次，连续7天。7天后作眼科检查进行(结膜、角膜、虹膜、分泌物)，同体双眼和给药前后比较，采用zgpt4-1中的评分标准进行评分。结果见表6。表6给药后7天后各组评分情况*：与生理盐水组相比有统计学意义(p<0.05)结论：7天给药实验显示10％微乳原位凝胶组与生理盐水组有一定的差别，但根据刺激性评判原则的标准来判断仍然是无刺激性的。试验例3组织分布研究为了考察5％本发明微乳原位凝胶能否穿过眼球的屏障作用而到达后眼部位而起作用，进行了组织分布研究。组织分布研究以藁本内酯(购自武汉天植生物技术有限公司)作为定量指标。藁本内酯测试方法：液相型号:lc-20ad岛津质谱型号:5500qtraplc-ms/msab公司色谱柱:behc181.7μm100x2.1mm沃特世科技(上海)有限公司柱温：40℃进样量：1ul流动相：a:水(0.1％甲酸)b:已腈cur:30.00cad:mediumcxp:10.00is:5000.00dp:120.0gs1:50.00tem:500.00ep:10.0gs2:50.00组织分布样品收集：取经眼科检查证明双眼符合要求的sd雄性大鼠(购自北京维通利华实验技术有限公司体重150～180g)8只，分成2组，即对照组(生理盐水)和5％本发明微乳原位凝胶组(本发明实施例1制得的微乳原位凝胶)，每组4只。雄性sd大鼠双眼均滴入受试物20μl，给药0.5、1、2、4小时后将sd大鼠处死，剥离雄性sd大鼠双眼的眼球。眼球经眼科显微手术器械剥离后，取下眼球后，用镊子夹住眼球，用剪刀剪开角膜，取下角膜，取出晶状体，用镊子捞出玻璃体，将组织剪开两半，用镊子顺向推开，取出视网膜。收集的组织置于1ml的离心管中，置于液氮中待样品全部取完后置于-80℃的环境下保存。组织分布样品的处理：称取眼睛组织，匀浆，加入50％甲醇水超声提取1小时。13200r/min离心10分钟。取100ul上清液，液质进样检测。结果见表7。表7藁本内酯在眼睛各部分组织中的分布情况结论：结果显示指标成分藁本内酯在角膜、玻璃体及视网膜中均能测到，说明本发明微乳原位凝胶可以顺利的到达后眼部。当前第1页12