槐定碱的用途、以及漱口水及其制备方法与流程

本发明涉及医药保健领域，具体而言，涉及一种槐定碱的用途、以及漱口水及其制备方法。
背景技术：
：牙周炎是侵犯牙龈和牙周组织的慢性炎症，是一种破坏性疾病，其主要特征为牙周袋的形成及袋壁的炎症、牙槽骨吸收和牙齿逐渐松动，它是导致成年人牙齿丧失的主要原因。其病多因为菌斑、牙石、食物嵌塞、不良修复体、咬创伤等引起，牙龈发炎肿胀，同时使菌斑堆积加重，并由龈上向龈下扩延。由于龈下微生态环境的特点，龈下菌斑中滋生着大量毒力较大的牙周致病菌，如牙龈类杆菌、中间类杆菌、螺旋体等，使牙龈的炎症加重并扩延，导致牙周袋形成和牙槽骨吸收，造成牙周炎。牙周炎已被医学界定论为继癌症、心脑血管疾病之后，威胁人类身体健康的第三大杀手，也是口腔健康的“头号杀手”。牙周炎出现的一些前期症状，也成为口腔“亚健康”恶化的主要特征。绝大多数牙周炎患者都伴随着牙龈萎缩的症状，调查发现，在45岁以上的人群，90％以上存在不同程度的牙龈萎缩现象，而牙龈萎缩，也一向被口腔医学界视为不可逆转的生理退化现象。值得重视的是，由于遗传、环境、食物安全方面因素的影响，牙龈萎缩生理退化现象有逐年低龄化趋势，最年轻的牙龈萎缩患者是18岁。牙周炎的现有治疗方法多以洁治和抗生素治疗为主，其中抗生素治疗包括全身给药(口服及注射)和牙周局部给药，副作用大、且疗效不佳。基于此，现在急需一种普适性强的技术，对日益严重的牙周炎进行预防或者是治疗。技术实现要素：本发明的第一目的在于提供一种槐定碱的新用途，即槐定碱在制备预防或治疗牙周炎的药物或保健品中的用途；槐定碱在制备牙周膜干细胞炎症反应的抑制剂中的用途；槐定碱在制备破骨细胞分化及成熟的抑制剂中的用途，为牙周炎的预防或治疗提供新的思路，也拓展了槐定碱的应用范围。本发明的第二目的在于提供一种用于治疗牙周炎的漱口水极其制备方法，这种漱口水以槐定碱为有效成分，能够有效防治牙周病变，避免牙齿松动，治疗效果佳。为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：槐定碱在制备预防或治疗牙周炎的药物或保健品中的用途。槐定碱在制备牙周膜干细胞炎症反应的抑制剂中的用途。槐定碱在制备破骨细胞分化及成熟的抑制剂中的用途。一种用于治疗牙周炎的漱口水，漱口水的原料包括：槐定碱、表面活性剂、亲水性分散剂和亲油性分散剂。一种用于治疗牙周炎的漱口水的制备方法，其包括：将槐定碱、表面活性剂、亲水性分散剂以及亲油性分散剂混合并分散在水中，并在80～85℃下搅拌20～30min。与现有技术相比，本发明的有益效果例如包括：本公开内容提供的这种槐定碱的新用途，即槐定碱在制备预防或治疗牙周炎的药物或保健品中的用途，为牙周炎的预防或治疗提供新的思路。发明人研究发现，槐定碱防治牙周炎主要是通过以下两个方面来实现：一是槐定碱能够有效抑制牙周膜干细胞炎症反应的发生，从而抑制白细胞介素-6、白细胞介素-1以及肿瘤坏死因子-α的表达，由此提示槐定碱可以使用在制备牙周膜干细胞炎症反应的抑制剂中；二是槐定碱能够有效抑制破骨细胞分化及成熟，从而显著抑制由破骨细胞激活引起的牙槽骨过量吸收的症状，由此提示槐定碱可以使用在制备破骨细胞分化及成熟的抑制剂中。本公开内容提供的这种用于治疗牙周炎的漱口水及其制备方法，以槐定碱为药效成分，利用表面活性剂、亲水性分散剂和亲油性分散剂将其均匀分散制成漱口水，能够有效预防和治理牙周炎。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1为实验例1中槐定碱浓度依赖的抑制破骨细胞形成的实验结果图；图2为图1中破骨细胞的数量的统计图；图3为图1中破骨细胞的覆盖面积统计图；图4为实验例1中槐定碱时间依赖的抑制破骨细胞形成的实验结果；图5为图2中破骨细胞的数量的统计图；图6为图2中破骨细胞的覆盖面积统计图。具体实施方式下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。本实施方式提供一种槐定碱在制备预防或治疗牙周炎的药物或保健品中的用途。牙周组织愈合、再生过程中的干细胞牙周组织主要由牙龈、牙周韧带、牙骨质和牙槽骨构成，这一复杂的组织，使牙周组织受伤之后，能够以一种特殊的方式愈合。牙周韧带在再生过程中负有重要使命，研究表明在牙周韧带附近有一群具有修复作用的间充质干细胞，具有广泛的增殖和分化潜能，可以分化为新的牙糟骨和牙周膜。但是，最新研究发现，这群细胞叫做牙周膜干细胞(pdsc)，是一把健康双刃剑。在正常生理条件下可以分化为牙周组织进行牙周修复，在病理条件下也可以大量分泌炎症因子，激活牙周单核巨噬细胞，促进过量的破骨细胞形成，引起牙糟骨吸收和牙周袋的形成，引起并恶化牙周炎。基于此，预防或治疗牙周炎的关键就是，如何有效避免牙周膜干细胞在病理条件下过度分泌炎症因子。发明人在长期的科研工作中发现，槐定碱这种天然单体化合物能够有效预防或治疗牙周炎，因此可以将槐定碱用在制备预防或治疗牙周炎的药物或保健品中。槐定碱(sophoridine,sop)含喹诺里西啶结构的生物碱，为无色或淡黄色晶体。槐定碱的分子式c15h24n2o，分子量248.37，casno.6882-68-45。槐定碱是一种已经上市的抗肿瘤药物，药品名称：盐酸槐定碱注射液，国药准字：h20051681，用于不能耐受标准化疗的恶性滋养细胞肿瘤的治疗，其毒性和副作用较低。文献报道槐定碱具有镇痛，抗肿瘤和抗乙肝病毒的活性。其结构式如下所示：发明人研究发现，槐定碱防治牙周炎主要是通过以下两个方面来实现：第一方面，槐定碱能够有效抑制牙周膜干细胞炎症反应的发生。牙周优势菌的脂多糖(lipopolysaccharide，lps)是目前公认的导致牙周病的重要影响因素，其不仅能引发牙周组织损伤和牙周炎的发生，还能够对牙周组织细胞产生细胞毒效应。有研究发现，lps能够引发多种炎性介质和细胞因子的合成与释放，如白细胞介素-1(il-1)、白细胞介素-6(il-6)、和肿瘤坏死因子-α(tnf-α)等。当人牙周膜干细胞(humanperiodontalligamentstemcell，hpdlscs)受到lps刺激时，其即可通过分泌tnf-α、il-6、il-1等细胞因子作为免疫辅助细胞参与到局部免疫反应中，并在牙周炎的发生、发展中发挥重要作用。发明人研究发现，槐定碱能抑制lps引起的il-6、il-1、tnf-αmrna表达上升，说明槐定碱能够通过抑制牙周膜干细胞产生炎症因子来抑制牙周膜干细胞炎症反应，由此提示槐定碱可以使用在制备牙周膜干细胞炎症反应的抑制剂中。第二方面，槐定碱能够有效抑制破骨细胞分化及成熟。牙周膜干细胞受到牙周细菌的刺激，大量产生炎症因子并不会引起严重的牙周病变，只有当其产生的炎症因子大量激活破骨细胞之后，才会产生牙槽骨过量吸收的症状，引起严重的牙周病和牙齿松动。发明人研究发现，在加入不同剂量的槐定碱之后，成熟破骨细胞的数量有了明显的下降，表明槐定碱能显著抑制破骨细胞激活引起的牙槽骨过吸收的症状，由此提示槐定碱可以使用在制备破骨细胞分化及成熟的抑制剂中。本实施方式还提供一种用于治疗牙周炎的漱口水，该漱口水的原料包括：槐定碱、表面活性剂、亲水性分散剂和亲油性分散剂。进一步的，亲水性分散剂包括：双脱乙醇、单氟磷酸钠、葡萄糖酸氯己定。进一步的，亲油性分散剂包括：丙三醇、聚氧乙烯氯化蓖麻油、聚氧乙烯氢化蓖麻油。进一步的，表面活性剂包括：十二烷基硫酸钠、十二烷基苯磺酸钠、聚山梨酯、脂肪酸山梨坦、脂肪酸甘油酯、卵磷脂。可选的，该漱口水的原料按重量份包括：槐定碱4～6份、表面活性剂0.5～1.5份、亲水性分散剂8.1～12.4份、亲油性分散剂3.5～8.5份。可选的，该漱口水的原料按重量份包括：槐定碱4～6份、十二烷基硫酸钠0.5～1.5份、双脱乙醇8～12份、单氟磷酸钠0.03～0.07、葡萄糖酸氯己定0.1～0.3份、丙三醇3～7份、及聚氧乙烯氯化蓖麻油0.5～1.5份。或者，该漱口水的原料按重量份包括：槐定碱5份、十二烷基硫酸钠1份、双脱乙醇10份、单氟磷酸钠0.05份、葡萄糖酸氯己定0.2份、丙三醇5份、及聚氧乙烯氯化蓖麻油1份。这种用于治疗牙周炎的漱口水的制备方法，其包括：将槐定碱、表面活性剂、亲水性分散剂以及亲油性分散剂混合并分散在水中，并在80～85℃下搅拌20～30min。可选的，还包括在反应完成后调节反应液的ph值至5.5～6.5之间。较为优选的，用小苏打或者氨水来调节ph。这种用于治疗牙周炎的漱口水及其制备方法，以槐定碱为药效成分，利用表面活性剂、亲水性分散剂和亲油性分散剂将其均匀分散制成漱口水，能够有效预防和治理牙周炎。以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述：实施例1本实施例提供一种用于治疗牙周炎的漱口水，其制备方法包括：a.备料：槐定碱5g、十二烷基硫酸钠1g、双脱乙醇10g、单氟磷酸钠0.05g、葡萄糖酸氯己定0.2g、丙三醇5g、及聚氧乙烯氯化蓖麻油1g。b.乳化反应：将上述原料中的各组分混合并分散在80g的纯化水中，并在82℃下搅拌25min，用碱调节ph至6.0，过滤后记得漱口水。实施例2本实施例提供一种用于治疗牙周炎的漱口水，其制备方法包括：a.备料：槐定碱4g、聚山梨酯1.5g、双脱乙醇8g、单氟磷酸钠0.03、葡萄糖酸氯己定0.3g、丙三醇3g、及聚氧乙烯氯化蓖麻油0.5g。b.乳化反应：将上述原料中的各组分混合并分散在80g的纯化水中，并在80℃下搅拌30min，用碱调节ph至6.5之间，过滤后即得漱口水。实施例3本实施例提供一种用于治疗牙周炎的漱口水，其制备方法包括：a.备料：槐定碱6g、脂肪酸山梨坦1.5g、双脱乙醇12g、单氟磷酸钠0.03、葡萄糖酸氯己定0.1g、丙三醇7g、及聚氧乙烯氯化蓖麻油1.5g。b.乳化反应：将上述原料中的各组分混合并分散在80g的纯化水中，并在85℃下搅拌20min，用碱调节ph至5.5之间，过滤后即得漱口水。实施例4本实施例提供一种用于治疗牙周炎的漱口水，其制备方法包括：a.备料：槐定碱5g、十二烷基苯磺酸钠1g、双脱乙醇12g、单氟磷酸钠0.03、葡萄糖酸氯己定0.36g、丙三醇5g、及聚氧乙烯氢化蓖麻油1g。b.乳化反应：将上述原料中的各组分混合并分散在80g的纯化水中，并在82℃下搅拌25min，用碱调节ph至6.0，过滤后记得漱口水。实施例5本实施例提供一种用于治疗牙周炎的漱口水，其制备方法包括：a.备料：槐定碱5g、聚山梨酯1g、双脱乙醇8g、单氟磷酸钠0.03、葡萄糖酸氯己定0.07g、丙三醇3g、及聚氧乙烯氢化蓖麻油1g。b.乳化反应：将上述原料中的各组分混合并分散在80g的纯化水中，并在82℃下搅拌25min，用碱调节ph至6.0，过滤后记得漱口水。下面结合实验数据对槐定碱在预防或治疗牙周炎方面的效果进行评价。实验例1槐定碱对牙周炎的作用：一、实验过程：1.1主要试剂和仪器250g/l胰蛋白酶、胶原酶、α-mem培养基(gibcobrl，美国)；牙龈卟啉单胞菌lps(sigma，美国)；逆转录聚合酶链反应(rt-pcr)试剂盒、细胞总rna提取试剂盒、逆转录试剂盒(takara，日本)；酶联免疫检测仪(bio-tek，美国)；倒置显微镜以及照相系统(olympus，日本)；rt-pcr仪(appliedbiosystems，美国)1.2牙周膜干细胞的分离方法收集12～15岁志愿者(患者及其家长均知情同意)因正畸减数而拔除的健康前磨牙18个，立即用pbs缓冲液反复冲洗后，刮取根中1/3的牙周膜组织，并将其转移至加有适量α-mem培养液的无菌培养皿中；然后再在α-mem培养液浸润下将牙周膜组织剪成1mm×1mm×1mm的组织块，并用250g/l的胰蛋白酶消化15min。终止消化后，离心弃上清，再将分离的组织块均匀平铺于6孔板中；用无菌盖玻片覆盖组织块使之贴壁后，每孔加入适量含有100ml/l胎牛血清的α-mem培养液，置于50ml/lco2、37℃的孵箱中进行培养。每3d换液1次，待细胞生长达80％时，采用stro-1为标记物以免疫磁珠分离筛选人牙周膜干细胞，并进行常规传代培养。二、试验方法2.1mtt法测定槐定碱对牙周膜干细胞增殖的影响取生长状态良好的第4代人牙周膜干细胞，经胰蛋白酶消化并用α-mem制成密度为5×107/l的细胞悬液后，以200μl每孔接种于96孔板；标准环境下培养24h后，弃原培养液并将细胞随机分为a、b、c、d和e共5组；a组加入含槐定碱1μg/ml+lps10ng/ml的α-mem、b组加入含槐定碱5μg/ml+lps10ng/ml的α-mem、c组加入含槐定碱10μg/ml+lps10ng/ml的α-mem、d组加入含lps10ng/ml的α-mem、e组加入不含lps的α-mem(每孔200μl)继续培养。分别于培养12、24、48、72h各时间点取各组细胞(每组每个时间点各4孔)，每孔加入20μlmtt溶液继续静置培养4h后，小心吸去孔内上清液，再于每孔中各加入150μldmso，并在室温下振荡15min；然后用酶标仪分别检测各孔490nm波长处的吸光度(a490)值，并取4孔的平均值进行统计学分析。2.2槐定碱对lps诱导的牙周膜干细胞炎症反应的抑制效果取生长状态良好的第4代人牙周膜干细胞，并按2.1同样的方法进行分组处理和培养。连续培养72h后，用trizol试剂盒一步法提取细胞rna，并按照逆转录试剂盒说明书，用随机引物法将rna逆转录成cdna。根据genbank数据库，用primer5.0计算机软件设计引物，并由上海生工公司进行引物合成，各引物序列见表1。表1.引物序列然后以cdna为模板，β-actin为内参照，用rt-pcr仪进行pcr反应，反应条件为：94℃预变性4min，94℃变性20s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；最后72℃检测信号。pcr反应结束后直接在pcr仪上获取阀值ct，并采用2-△△ct法计算各组il-6、il-1β、tnf-αmrna的相对表达水平。每组均设置5个平行复孔，取平均值。2.3槐定碱对破骨细胞分化及成熟的影响。根据研究发现，牙周单核巨噬细胞在核因子受体活化因子配体rankl以及人巨噬细胞集落刺激因子的刺激诱导下可以向破骨细胞分化。骨质疏松往往由过多的骨吸收导致，是破骨细胞过度活化的结果。故选择单核巨噬细胞作为细胞模型，研究槐定碱对rankl诱导的破骨细胞生成的影响十分适宜。观察槐定碱是否能够抑制破骨细胞特异相关基因的表达及其对破骨细胞噬骨能力的影响，从而阐述槐定碱在制备用于防治骨质疏松的药物中的应用及机制。为表明本发明槐定碱可以抑制小鼠骨髓巨噬细胞分化为破骨细胞，现将小鼠骨髓巨噬细胞以1×104个/细胞接种于96孔板，待细胞长满后弃掉培养基，分别以终浓度为0(空白对照组)、5μg/ml、10μg/ml、15μg/ml将槐定碱加入各新鲜培养基中，然后加入96孔板中，同时rankl(50ng/ml)、m-csf(50ng/ml)诱导小鼠骨髓巨噬细胞向破骨细胞分化。然后，对小鼠巨噬细胞进行trap染色(图1)，并对结果进行定量统计(图2和图3)，发现随着槐定碱浓度的增加可以明显抑制小鼠骨髓巨噬细胞分化为破骨细胞。由上述实验和图1～图3可知，本发明所述槐定碱可以浓度依赖的抑制单核巨噬细胞向破骨细胞分化，抑制骨吸收，从源头抑制牙周炎引起的牙齿松动。为确定那个时间段加入槐定碱可以更好的抑制破骨细胞的形成，现将小鼠骨髓巨噬细胞以1×104个/细胞接种于96孔板，同时rankl(50ng/ml)诱导小鼠骨髓巨噬细胞向破骨细胞分化，随后分别在第0天、第2天、第4天和第5天弃掉培养基，加入终浓度为60μg/ml的槐定碱的培养基。然后，对小鼠巨噬细胞进行trap染色(图4)，并对结果进行定量分析(图5和图6)。结果表明，为了有效抑制破骨细胞的形成槐定碱需要出现在早期阶段和整个rankl诱导分化过程中。2.4统计学分析用spss19.0软件对数据进行方差分析，两两比较用t检验，检验水准α＝0.01。三、实验结果3.1不同浓度槐定碱对牙周膜干细胞增值率的影响不同浓度槐定碱与10ng/ml的lps作用于人牙周膜干细胞12、24、48、72h后，mtt检测结果显示：各组各时间点的a490值均以阴性对照组(e组)最低；各时间点内a、b、c和d组与e组间的a490值两两相比均有统计学差异(p＜0.05)。但是a、b、c和d组之间比较，槐定碱组的细胞增殖率微微下降，但是无统计学意义，表明槐定碱在10μg/ml浓度以下对牙周膜干细胞增值无影响。表2不同时间点内槐定碱对牙周膜干细胞增殖的作用本实验例分别采用10ng/mllps对人牙周膜干细胞进行刺激，造牙周膜干细胞炎症模型。同时使用槐定碱共培养，观察槐定碱对牙周膜干细胞增殖率的影响。结果显示，与对照组相比，10ng/mllps组在各时间的a490值均显著升高，而添加槐定碱后在各时间点的a490值无显著性变化；提示，低浓度的lps(10ng/ml)对人牙周膜干细胞的增殖具有促进作用，槐定碱对牙周膜干细胞的增殖无显著性作用。3.2槐定碱抑制lps诱导的牙周膜干细胞炎症反应不同浓度的槐定碱(1、5、10μg/ml)与10ng/ml的lps作用于人牙周膜干细胞，rt-pcr检测结果显示：与e组相比，a、b、c和d组的il-6、il-1β、tnf-αmrna表达水平均提升，表示建模成功。与d组相比，a、b和c组的il-6、il-1β、tnf-αmrna表达水平均下降，且以高剂量组c组更明显，c组与d组间两两相比均有统计学差异(p＜0.01)(表3)。表3.槐定碱对牙周膜干细胞炎症因子表达的抑制作用本实验例分别采用10ng/mllps对人牙周膜干细胞进行刺激，造牙周膜干细胞炎症模型。同时使用槐定碱共培养，观察槐定碱对牙周膜干细胞炎症的抑制效果。tnf-α、il-6是单核细胞、淋巴细胞及成纤维细胞所产生的多功能细胞因子，其生物学活性较为广泛。有研究发现，伴放线杆菌和牙龈卟啉单胞菌的lps能够促进hpdlscs合成il、tnf-α，并使其mrna的表达水平上调。其中，牙龈卟啉单胞菌的lps主要是通过与人牙周膜干细胞表面的受体结合，然后刺激人牙周膜干细胞释放炎性因子，因而在牙周炎的发生过程中发挥重要作用。有研究显示，牙龈卟啉单胞菌的lps可促进单核细胞和肝细胞的生长因子释放白介素、tnf-α及前列素e2，并可使干细胞生长因子的il-1和il-6分泌水平显著升高。本结果显示，与对照组(d组)对比，a、b和c组(分别为槐定碱低、中、高剂量组)的il-6、il-1β、tnf-αmrna表达水平均显著下降，且以c组(高剂量组)下降更明显；c组与d组间两两相比有统计学差异(p＜0.05)。由此说明，槐定碱能抑制lps引起的il-6、il-1、tnf-αmrna表达上升。由上述结果可知，槐定碱能有效抑制牙龈卟啉单胞菌的lps引起的牙周膜干细胞炎症，可以用槐定碱来制备牙周膜干细胞炎症反应的抑制剂。3.3槐定碱可显著抑制破骨细胞分化及成熟牙周膜干细胞受到牙周细菌的刺激，大量产生炎症因子并不会引起严重的牙周病变，只有当其产生的炎症因子大量激活破骨细胞之后，才会产生牙槽骨过量吸收的症状，引起严重的牙周病和牙齿松动。如图1～图6所示，在加入不同剂量的槐定碱之后，成熟破骨细胞的数量有了明显的下降(红色的为成熟破骨细胞)。表明槐定碱能显著抑制破骨细胞激活引起的牙槽骨过吸收，可以用槐定碱来制备破骨细胞分化及成熟的抑制剂。综上所述，槐定碱能有效抑制牙龈卟啉单胞菌的lps引起的牙周膜干细胞炎症、以及抑制破骨细胞激活引起的牙槽骨过吸收，能够用来制备预防或治疗牙周炎的药物或保健品。实验例2槐定碱漱口水对牙齿松动的治疗作用随机选取76名年龄分布在46-59岁的使用者，男女各半，按照牙齿松动指数ptv分成健康组(19人，ptv-8-9)，轻微松动组(20人，ptv10-19)，松动组(17人，ptv20-29)和严重松动组(20人，ptv大于30)。使用本发明实施例1中提供的漱口水对所有组别的使用者进行半年的治疗，治疗后按照牙齿松动指数ptv记录使用者的牙齿松动情况，结果如表4所示：表4.使用者的牙齿松动情况治疗前(ptv±sd)治疗后(ptv±sd)健康组2±31±3轻微松动组15±411±2*松动组24±417±3**严重松动组36±629±4*p≦0.05，**p≦0.01实验结果表明，漱口水对健康组人群牙齿松动情况无影响，表明没有牙齿方面的副作用。对轻微松动组和松动组，具有显著性的治疗效果，但是对严重松动的患者治疗效果一般。另外，将其它实施例提供的漱口水用于进行上述实验，结果与实施例1基本一致，故不一一赘述。尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。当前第1页12