本发明涉及药物制剂领域，具体涉及一种丹皮酚-奥扎格雷偶联物长循环脂质体及其制备方法。
背景技术：
心脑血管疾病是全球人口死亡的主要原因，具有较高的发病率、致残率和死亡率，严重危害了患者的生命安全和身体健康，随着社会人口的老龄化，发病率与日俱增，有效预防和治疗心脑血管疾病是当代医学研究的重点。血栓栓塞是导致心脑血管疾病的重要因素之一，血栓栓塞性疾病是各种内在和外在因素导致血管内血栓形成和栓塞并导致组织和器官功能受损的病理过程。以冠状动脉血栓和脑血栓为核心的血栓栓塞性疾病在我国有很高的发病率和死亡率，因此，防止血栓也就成了心血管疾病领域当今最为热门的研究课题之一。抗血小板聚集在血栓形成过程中具有非常重要的作用，当动脉粥样斑块破裂后，血小板被激活，聚集的血小板活化并释放多种物质，同时为凝血因子的活化提供平台，凝血因子的活化使纤维蛋白原转变为纤维蛋白，网罗红细胞等形成血栓。如果能及时有效的控制血小板聚集，即可阻止或者延缓血栓栓塞的形成。
奥扎格雷的作用部位是血小板与血管内皮细胞，可以通过抑制血小板聚集，扩张血管，有效抑制脑血栓的形成，被批准用于治疗心脑血管疾病。丹皮酚对脑缺血有保护作用，属于脂溶性的成分，容易透过血脑屏障，能够活血化淤，从而改善脑部血液循环，防止血栓的形成。实验前期将丹皮酚与奥扎格雷拼合，得到丹皮酚奥扎格雷偶联物(poc)，可以通过抑制血小板聚集，达到抑制脑血栓形成和治疗脑梗塞的作用，具有很好的稳定性、半衰期较长，生物利用度高、疗效更好等特点。在临床上可以预防或治疗血小板聚集引起的心脑血管疾病的作用，特别是能治疗血栓性心、脑的缺血或梗死等疾病。
长循环脂质体由于含有亲水基团而能阻止血液中许多不同组分特别是调理素与其结合，从而降低与单核吞噬细胞系统的亲和力，可在循环系统中稳定存在并使半衰期延长，增加病变组织对它的摄取。炎症部位病变引起毛细血管的通透性增加，含有药物的长循环脂质体能增加药物在这些部位的聚集量，脂质体药物的缓释直接作用于病变部位，增强了治疗效果。
专利cn201710269432.6公开了一种乙醇注入法制备丹皮酚-奥扎格雷偶联物长循环脂质体的方法。其是由丹皮酚-奥扎格雷偶联物、磷脂、胆固醇、缓冲溶液、有机溶剂等组成，是一种普通的脂质体，包封的药物快速渗漏，容易被体内肝脾网状内皮系统吞噬，药物在体内的循环时间短。因此，有必要研究一种丹皮酚-奥扎格雷偶联物长循环脂质体。
技术实现要素：
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种丹皮酚-奥扎格雷偶联物长循环脂质体。
本发明的另一目的在于提供上述丹皮酚-奥扎格雷偶联物长循环脂质体的制备方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种丹皮酚-奥扎格雷偶联物长循环脂质体，由丹皮酚-奥扎格雷偶联物、磷脂、胆固醇、长循环辅料、有机溶剂和水制成，其中，丹皮酚-奥扎格雷偶联物与磷脂的质量比为1:30～1:15，胆固醇与磷脂的质量比为1:10～1:5，长循环辅料与磷脂的质量比为1:12～1:7.5，有机溶剂与水的体积比为1:10～1:5，所述长循环辅料选自peg-二棕榈酰磷脂酰甘油酯、peg-胆固醇、peg-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺、peg-二棕榈酰磷脂酰胆碱、peg-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺中的一种或几种的混合。
本发明所述的丹皮酚-奥扎格雷偶联物可参照cn201310422876.0制备得到，其化学名为(e)-3-(4-((1h-咪唑基-1-基)甲基)苯基)丙烯酰氯，分子式：c22h20n2o4，分子量：376.41，结构式如下：
本领域适用于长循环脂质体的长循环辅料有很多，常见的如peg分子量为1000-10000的硬脂酸酯、peg分子量在1000-10000维生素e琥珀酸酯，peg硬脂酸酯与分子量为200-10000的peg的混合物，myrj类，brij类，peg-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺、peg-二棕榈酰磷脂酰胆碱、peg-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺，神经节苷脂，聚丙烯酰胺，壳聚糖，聚乙二醇聚十六烷基腈基丙酸酯，分子量为200-10000的peg、pvp或pva及其任意组合。
本发明对上述长循环辅料进行了筛选，结果如下：
直接使用peg或peg-硬脂酸酯与脂质体之间的连接不牢固，不能有效的降低网状内皮系统(res)对脂质体的摄取。而对于peg-二棕榈酰磷脂酰甘油酯和peg-胆固醇，可以延长脂质体长循环的能力，但其效果差于peg-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺。dspe-peg(二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇)是两亲线型聚合物，peg与dspe通过氨基甲酸酯键相连，有两个饱和脂酰基链，亲脂端为dspe，亲水端为peg，与脂质体的连接牢固，保护脂质体不被破坏的能力最强。dspe-peg(二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇)在脂质体表面交错覆盖成致密的构象云，形成较厚的立体位阻层，这种立体位阻降低了血浆蛋白与细胞表面配体的相互作用，其立体位阻可同时屏蔽res系统对脂质体的识别，明显延长在血液中驻留时间，有利于病变部位的有效吸收。peg链的长度和分子质量与脂质体的稳定性关系密切，对于胶态脂质体，分子质量在1000～2000之间的peg长循环效果较好，因此，本发明优选peg分子量为1000-2000的peg-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺作为长循环辅料。一般而言，peg链越长，脂质体的循环时间越长，故本发明更优选dspe-peg2000制备长循环脂质体。
所述磷脂为大豆卵磷脂、卵黄磷脂、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱或二棕榈酰磷脂酰乙醇胺中的一种或几种的混合，优选大豆卵磷脂或卵黄磷脂。
所述有机溶剂为二氯甲烷、甲醇、无水乙醇、四氢呋喃或异丙醇中的一种或几种的混合，优选无水乙醇。
考虑到长循环脂质体的包封率和粒径，本发明对长循环脂质体的各成分之间的配比进行了优化，具体操作如下：
一、药脂比例的考察
按表1配方，将水于40℃水浴预热；称取丹皮酚-奥扎格雷偶联物、磷脂、胆固醇、长循环辅料于无水乙醇中，水浴加热至完全溶解，构成油相；用注射器将上述油相缓慢匀速注射到预热的水中，继续搅拌，即得丹皮酚-奥扎格雷偶联物长循环脂质体。
高效液相计算药物的包封率，使用粒径仪测定粒径，结果如表2。
表1丹皮酚-奥扎格雷偶联物长循环脂质体的药脂比例的考察
表2药脂比例的考察结果
由表2可以看出，综合考虑包封率和粒径，丹皮酚-奥扎格雷偶联物与磷脂的质量比控制在1:30～1:15为宜，优选为1：20。
二、胆固醇与磷脂的质量比例的考察
配方如表3，制备方法同上，高效液相计算药物的包封率，使用粒径仪测定粒径，结果如表4。
表3胆固醇与磷脂的质量比例的考察
表4胆固醇与磷脂质量比例的考察结果
由表4可以看出，胆固醇与磷脂的质量比控制在1:10～1:5为宜，优选为1：10。
三、dspe-peg2000与磷脂的质量比例的考察
配方如表5，制备方法同上，高效液相计算药物的包封率，使用粒径仪测定粒径，结果如表6。
表5dspe-peg2000与磷脂的质量比例的考察
表6dspe-peg2000与磷脂的质量比例的考察结果
由表6可以看出，dspe-peg2000与磷脂的质量比控制在1:12～1:7.5为宜，优选为1：12。
四、水与有机溶剂的体积比的考察
配方如表7，制备方法同上，高效液相计算药物的包封率，使用粒径仪测定粒径，结果如表8。
表7水与有机溶剂的体积比的考察
表8水与有机溶剂的体积比的考察结果
由表8可以看出，有机溶剂与水的体积比为1:10～1:5为宜，优选为1：10。
综上考察，优选的，丹皮酚-奥扎格雷偶联物与磷脂的质量比为1:30，胆固醇与磷脂的质量比为1:10，长循环材料与磷脂的质量比为1:12，有机溶剂与水的体积比为1:10。
本发明还提供了上述丹皮酚-奥扎格雷偶联物长循环脂质体的制备方法，包括以下步骤：
a、将水于40℃-50℃水浴预热；
b、将丹皮酚-奥扎格雷偶联物、胆固醇、磷脂和长循环辅料溶于有机溶剂中，水浴加热至完全溶解，构成油相；
c、用注射器将步骤b的油相缓慢匀速注入到预热的水中，继续搅拌，待有机溶剂挥发完全后，即得丹皮酚-奥扎格雷偶联物长循环脂质体。
本发明对工艺条件进行了优化，具体操作如下：
五、温度的选择
如表9所示，温度分别选择30℃、40℃和50℃，高效液相计算药物的包封率，使用粒径仪测定粒径，结果如表10。
表9丹皮酚-奥扎格雷偶联物长循环脂质体制备温度的选择
表10丹皮酚-奥扎格雷偶联物长循环脂质体制备温度的考察结果
由表10可以看出，温度选择40℃-50℃为宜，优选40℃。
六、转速的考察
如表11所示，转速分别选择200rpm、400rpm、600rpm和800rpm，高效液相计算药物的包封率，使用粒径仪测定粒径，结果如表12。
表11丹皮酚-奥扎格雷偶联物长循环脂质体制备转速的考察
表12丹皮酚-奥扎格雷偶联物长循环脂质体制备转速的考察结果
由表12可以看出，转速选择400-600rpm为宜，优选400rpm。
七、搅拌时间的考察
如表13所示，搅拌时间分别选择1h、2h和3h，高效液相计算药物的包封率，使用粒径仪测定粒径，结果如表14。
表13丹皮酚-奥扎格雷偶联物长循环脂质体制备搅拌时间的考察
表14丹皮酚-奥扎格雷偶联物长循环脂质体制备搅拌时间的考察结果
由表14可以看出，搅拌时间选择2-3h为宜，优选2h。
综上考察结果，优选的，步骤c中，所述搅拌的时间为2-3h，优选为2h；转速为400-600r/min，优选为400r/min。
本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：
(1)与丹皮酚-奥扎格雷偶联物脂质体相比，本发明的长循环脂质体通过长循环辅料对药物进行表面修饰，有助于避免药物体内肝脾网状内皮系统的吞噬，且具有缓释功能，可以延长药物在体内的循环时间，能更好的预防或治疗血小板聚集引起的心脑血管疾病的作用，特别是血栓性心、脑的缺血或梗死等疾病；
(2)本发明通过对组分的配比及工艺条件的优化，制备得到的丹皮酚-奥扎格雷偶联物长循环脂质体具有载药量高、包封率高、性能稳定，制剂可稳定贮存等优点。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明，以下实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受下述实施例的限制。
丹皮酚-奥扎格雷偶联物(poc)：安徽中医药大学参照cn201310422876.0制备得到。
本发明中使用的其他原料全部为市售原料。
实施例一
量取20ml水于具塞锥形瓶中，放入磁子，于40℃水浴预热；精密称取poc3.00mg、卵黄磷脂60.00mg、胆固醇6.00mg，dspe-peg20005.00mg溶于3ml无水乙醇中，水浴加热至完全溶解，构成油相；用1ml注射器将上述油相缓慢匀速注入到预热的水中，继续搅拌2h，转速400r/min，待有机溶剂挥发完全后，即得丹皮酚-奥扎格雷偶联物长循环脂质体。
测定丹皮酚-奥扎格雷偶联物长循环脂质体的载药量和包封率分别为3.64％和93.52％。
实施例二
量取20ml水于具塞锥形瓶中，放入磁子，于40℃水浴加热；精密称取poc4.00mg、大豆卵磷脂60.00mg、胆固醇8.00mg，dspe-peg20005.0mg溶于3ml无水乙醇中，水浴加热至完全溶解，构成油相；用1ml注射器将上述油相缓慢匀速注入到预热的水中，继续搅拌2.5h，转速500r/min，待有机溶剂挥发完全后，即得丹皮酚-奥扎格雷偶联物长循环脂质体。
测定丹皮酚-奥扎格雷偶联物长循环脂质体的载药量和包封率分别为3.72％和91.64％。
实施例三
量取20ml水于具塞锥形瓶中，放入磁子，于40℃水浴加热；精密称取poc2.00mg、大豆卵磷脂60.00mg、胆固醇6.00mg，dspe-peg20006.00mg溶于3ml无水乙醇中，水浴加热至完全溶解，构成油相；用1ml注射器将上述油相缓慢匀速注入到预热的水中，继续搅拌3h，转速400r/min，待有机溶剂挥发完全后，即得丹皮酚-奥扎格雷偶联物长循环脂质体。
测定丹皮酚-奥扎格雷偶联物长循环脂质体的载药量和包封率分别为2.57％和93.82％。
实施例四
量取20ml水于具塞锥形瓶中，放入磁子，于40℃水浴加热；精密称取poc3mg、大豆卵磷脂60mg、胆固醇12mg，dspe-peg20005mg溶于3ml无水乙醇中，水浴加热至完全溶解，构成油相；用1ml注射器将上述油相缓慢匀速注入到预热的水中，继续搅拌2h，转速600r/min，待有机溶剂挥发完全后，即得丹皮酚-奥扎格雷偶联物长循环脂质体。
测定丹皮酚-奥扎格雷偶联物长循环脂质体的载药量和包封率分别为3.47％和92.53％。
实施例五
量取20ml水于具塞锥形瓶中，放入磁子，于40℃水浴加热；精密称取poc3mg、大豆卵磷脂60mg、胆固醇6mg，dspe-peg20006mg溶于3ml无水乙醇中，水浴加热至完全溶解，构成油相；用1ml注射器将上述油相缓慢匀速注入到预热的水中，继续搅拌2h，转速400r/min，待有机溶剂挥发完全后，即得丹皮酚-奥扎格雷偶联物长循环脂质体。
测定丹皮酚-奥扎格雷偶联物长循环脂质体的载药量和包封率分别为3.76％和93.94％。
实施例六
量取20ml水于具塞锥形瓶中，放入磁子，于40℃水浴加热；精密称取poc3mg、大豆卵磷脂60mg、胆固醇6mg，dspe-peg20005mg溶于2ml无水乙醇，水浴加热至完全溶解，构成油相；用1ml注射器将上述油相缓慢匀速注入到预热的水中，继续搅拌2h，转速400r/min，待有机溶剂挥发完全后，即得丹皮酚-奥扎格雷偶联物长循环脂质体。
测定丹皮酚-奥扎格雷偶联物长循环脂质体的载药量和包封率分别为3.93％和96.64％。