超群羊肚菌的应用的制作方法

本发明涉及食用菌领域，具体而言，涉及超群羊肚菌的应用。

背景技术：

羊肚菌(morchella)是一种珍稀食用菌品种,因其菌盖表面凹凸不平、状如羊肚而得名。羊肚菌(morchella)是子囊菌纲(ascomycetes)，盘菌目(pezizales)，羊肚菌科(morohellaceae)，羊肚菌属(morchella)的珍稀的食、药两用的真菌，又称草笠竹、羊肚菜、羊蘑、羊肚蘑。目前中国已知的羊肚菌种类已经有很多，比较常见的有羊肚菌、小顶羊肚菌、尖顶羊肚菌、粗柄羊肚菌、小羊肚菌等。

羊肚菌是子囊菌中最著名的美味食菌，其菌盖部分含有异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸和缬氨酸7种人体必需的氨基酸。羊肚菌的营养相当丰富，据测定，羊肚菌含粗蛋白20％、粗脂肪26％、碳水化合物38.1％，还含有多种氨基酸，特别是谷氨酸含量高达1.76％。因此，有人认为是“十分好的蛋白质来源”，并有“素中之荤”的美称。

另外，据测定羊肚菌至少含有8种维生素：维生素b1、维生素b2、维生素b12、烟酸、泛酸、吡哕醇、生物素、叶酸等。羊肚菌的营养成份，可与牛乳、肉和鱼粉相当。因此，国际上常称它为“健康食品”之一。

野生羊肚菌分布于我国陕西、甘肃、青海、西藏、新疆、四川、山西、吉林、江苏、云南、河南、河北、北京、湖南、贵州等地区。在自然环境下生长，单体可达二百多克，目前，我国已发现的羊肚菌有20多种。

因此，人们希望提供更多的羊肚菌新品种、以及羊肚菌新品种的应用、鉴定方法和培养方法等。

鉴于此，特提出本发明。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种新的羊肚菌菌株，具有提高免疫力、抑制肿瘤细胞增殖等作用。

本发明的另一目的在于提供一种提取物，其提取自从上述的超群羊肚菌。

本发明的另一目的在于提供一种提高免疫力的药物或保健品。

本发明的另一目的在于提供预防或治疗肿瘤的药物。

本发明的另一目的在于提供一种鉴定上述超群羊肚菌的鉴定方法。

本发明的另一目的在于提供上述超群羊肚菌或其提取物的应用。

本发明的另一目的在于提供一种用于培养上述超群羊肚菌的培养基。

本发明的另一目的在于提供一种培养上述超群羊肚菌的方法。

本发明是这样实现的：

一方面，本发明提供一种超群羊肚菌，其保藏编号为cctccno:m2016032。

本发明的发明人从云南的一种羊肚菌的子实体进行分离、纯化后得到菌丝样品，通过对菌丝样品的形态进行观察，判定其是羊肚菌科的其中一个种，通过进一步的its序列分析，用菌丝样品提取的dna进行pcr扩增所得的rdna-its区段大小约为750bp，经过ncbi的blast比对，该菌丝样品与morchellaeximiavoucher菌种的序列相似性为99％，由此推断该羊肚菌菌株为morchellaeximiavoucher的一种新的羊肚菌菌株，为超群羊肚菌(morchellaeximiavoucher)。

该菌株于2016年1月13日保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，地址：中国武汉武汉大学，分类命名为：morchellaeximiavouchersaas-1，保藏编号为：cctccno:m2016032。

另一方面，本发明提供一种提取物，其从上述的超群羊肚菌中提取得到。

进一步地，在本发明一些实施方案中，该提取物为水提物或醇提物。

进一步地，在本发明一些实施方案中，该提取物为多糖提取物。

进一步地，在本发明一些实施方案中，该水提物或醇提物可通过如下方法制备：

取如上所述的超群羊肚菌新鲜子实体，清洗后，冻干；

将冻干的子实体，加入乙醇混合，超声破碎，得到粗提液；

离心粗提液，取上清液(沉淀备用)，干燥，得到醇提物，

取上述沉淀，干燥，加入水，进行加热，过滤，收集滤液，浓缩滤液得到水提物。

本发明实施例中的实验验证，本发明提供的提取物具有促进t细胞增殖和抑制肿瘤细胞增殖的作用。

另一方面，本发明提供一种提高免疫力的药物或保健品，其包括：上述的超群羊肚菌，或者上述的提取物。

本发明实施例中的实验验证，本发明提供的提取物具有促进t细胞增殖的作用。因此，该提取物或该超群羊肚菌可用于制备提高免疫力的药物或保健品。相应地，含有该提取物或该超群羊肚菌的药物或保健品也具有促进t细胞增殖，提高免疫力的作用效果。

另一方面，本发明提供一种预防或治疗肿瘤的药物，其包括：如上所述的超群羊肚菌，或者如上所述的提取物。

本发明实施例中的实验验证，本发明提供的提取物具有抑制肿瘤细胞增殖的作用。因此，该提取物或该超群羊肚菌可用于制备预防或治疗肿瘤的药物。相应地，含有该提取物或该超群羊肚菌的药物或保健品也具有抑制肿瘤细胞增殖，达到预防或治疗的目的。

另一方面，本发明提供一种如上所述的超群羊肚菌的鉴定方法，其包括：

扩增待测菌种的its区序列，得到待检序列；

将所述待检序列与参考序列进行比对，如果所述待检序列含有所述参考序列，则指示所述待测菌种为所述超群羊肚菌；

其中，所述参考序列如seqidno.1所示。

进一步地，在发明的一些实施方案中，用真菌通用引物扩增所述待测菌种的its区序列。

进一步地，在发明的一些实施方案中，所述真菌通用引物its1和its4扩增所述待测菌种的its区序列；its1的碱基序列如seqidno.2所示，its4的碱基序列如seqidno.3所示。

在分类学上看来，从传统形态学上来分将羊肚菌分为28个种，但是在分子生物学的角度却仅分为三或四个种，说明缺乏通过菌丝形态来鉴定菌种的参考依据。因为这些问题使得在羊肚菌的生产中发生菌种混乱的现象，因此建立一套科学、有效的菌种鉴定体系是亟需解决的一个重要问题。所以利用传统形态学和分子生物学相结合的方式，同时从形态特征及分子水平鉴定羊肚菌菌种是一个比较好的途径。

its(internaltranscribedspacer)：内转录间隔区，是真核生物核糖体rna(rrna)基因非转录区的一部分。通常用于真菌鉴定的its序列包括its1、5.8s和its2。核糖体内转录间隔区包含2个不同的非编码区域，即its1和its4。真菌its区域长度一般在650～750bp(碱基对)。its序列鉴定是指对its序列进行dna测序，通过将测序得到的its序列与已知真菌的its序列进行比较，从而获得未知真菌种属信息的一种方法。

传统的分类学鉴定方法是根据子实体形态来区分不同菌种，但是由于现在环境变化大，污染严重，子实体形态由于受生长环境和不同发育阶段的影响会产生变化，所以很难准确的进行区分。

本发明提供的鉴定方法应用rdna的its序列分析的方法对待测菌种进行鉴定，以seqidno.1作为参考序列，该参考序列源自保藏编号为cctccno:m2016032的超群羊肚菌的rdna的its序列，因此，采用该鉴定方法具有鉴定结果准确、可靠的特点。

另一方面，本发明提供如上所述的保藏编号为cctccno:m2016032的超群羊肚菌或该超群羊肚菌提取物在制备提高免疫力药物或保健品中的应用。

另一方面，本发明提供如上所述的保藏编号为cctccno:m2016032的超群羊肚菌或该超群羊肚菌提取物在制备预防或治疗肿瘤药物中的应用。

经本发明实施例中的实验验证，结果显示，从上述超群羊肚菌中提取的水提物或醇提物具有促进t细胞增殖和抑制肿瘤细胞增殖的作用。说明，如上所述的超群羊肚菌或超群羊肚菌提取物可以用于制备提高免疫力药物或保健品，以及预防或治疗肿瘤药物等领域。

另一方面，一种用于培养超群羊肚菌的培养基，其适于培养如上所述的保藏编号为cctccno:m2016032的超群羊肚菌，该培养基中含有杨树叶提取物。

进一步地，在发明的一些实施方案中，所述杨树叶提取物为杨树叶水提物。

进一步地，在发明的一些实施方案中，所述杨树叶水提物通过以下方法制备得到：

用水煎煮杨树叶，过滤，取滤液即得所述杨树叶水提物。

进一步地，在发明的一些实施方案中，所述培养基还含有：葡萄糖和kh2po4。

进一步地，在发明的一些实施方案中，按每l计，所述培养基含有：18-22g葡萄糖和0.8-1.1gkh2po4。

本发明提供的超群羊肚菌子实体来自云南曲靖，发明人根据子实体的生活环境和周围的树种，对其菌丝体的培养基配方进行了不断的改良和创造性的思考，其结果显示，相对普通培养基，本发明提供的培养基通过加入杨树叶提取物，可以使该超群羊肚菌很好地生长，表现出菌丝粗壮、生长速度快、菌核数量多的特点。

再一方面，本发明提供一种培养如上所述的保藏编号为cctccno:m2016032超群羊肚菌的方法，该方法采用如上所述的培养基培养。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供的超群羊肚菌，保藏编号为cctccno:m2016032。经鉴定，该超群羊肚菌为一种新的超群羊肚菌菌株，其提取物促进t细胞增殖和抑制肿瘤细胞增殖的作用，该超群羊肚菌或其提取物可以用于提高免疫力和预防或治疗肿瘤，相应地，该超群羊肚菌或其提取物可以用于制备提高免疫力的药物或保健品，或者制备预防或治疗肿瘤的药物中，具有广阔的应用前景；

此外，本发明提供的鉴定方法应用rdna的its序列分析的方法对待测菌种进行鉴定，以seqidno.1作为参考序列，该参考序列源自保藏编号为cctccno:m2016032的超群羊肚菌的rdna的its序列，因此，采用该鉴定方法，能够准确的鉴定出待测菌种是否是保藏编号为cctccno:m2016032的超群羊肚菌，其具有鉴定结果准确、可靠的特点。

再有，本发明提供的超群羊肚菌的培养基以及相应的培养方法，其根据保藏编号为cctccno:m2016032的超群羊肚菌的原始生长环境特点，通过在培养基中加入杨树叶提取物，可以使该超群羊肚菌很好地生长，表现出菌丝长、菌核数量多的特点。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例中的超群羊肚菌提取的dna电泳检测图(图中：m：marker；1、2、3、4、5为同种菌丝dna)；

图2为本发明实施例中的超群羊肚菌提取的dna在52-62℃温度梯度下的pcr电泳图(图中：m：marker；13、14为58℃；23、24为空白对照组)；

图3为本发明实施例中的超群羊肚菌提取的dna在58℃温度下的pcr电泳图(图中：m：marker；16为空白对照组)；

图4为本发明实施例中的胶回收电泳图(图中：m：marker)；

图5为本发明实施例中的菌液质粒的提取电泳图(图中：m：marker)；

图6为本发明实施例中的酶切电泳图(m：marker；1、2、3、4、6号成功转入载体)；

图7为本发明实施例中的blast比对结果；

图8为本发明实施例中的以不同羊肚菌its序列构建出的进化树；

图9为本发明实施例中的流式细胞仪检测的不同浓度超群羊肚菌醇提取物对t细胞增殖的影响结果；

图10为本发明实施例中的流式细胞仪检测的不同体积比超群羊肚菌水提取物对t细胞增殖的影响结果；

图11为本发明实施例中的不同浓度超群羊肚菌醇提取物对三种肿瘤细胞增殖的影响结果；

图12为本发明实施例中的不同体积比超群羊肚菌水提取物对三种肿瘤细胞增殖的影响结果；

图13为本发明实施例中的以不同超群羊肚菌its序列构建出的进化树；

图14为本发明实施例中的morchellaeximiavouchersaas-1与morchellaeximiavoucherlip:ph253的its序列对比部分结果。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

超群羊肚菌的分离与鉴定

1超群羊肚菌的分离

原始的羊肚菌采集自云南曲靖，进行分离、纯化后得到实验用的菌丝样品。

2超群羊肚菌的鉴定

2.1菌丝培养

取带培养基的少量供试菌株接入pda培养基，贴上封口膜后放入恒温恒湿培养箱中进行培养。培养条件恒定为：温度25℃，相对湿度40％，且无光照。

接入的菌丝1天左右后长出气生菌丝，且生长速度加快，3天时菌丝一般长满平板，菌丝颜色为白色，5天左右菌丝褐化，变为褐色，培养基中间长出颗粒状的褐色物质。由于菌丝提取dna的用量比较大，一般刮取接种4天左右的白色菌丝作为接下去实验的材料。

2.2ctab法提取dna

(1)菌丝培养完成后，挑取部分菌丝于2ml的离心管中。

(2)取预热的65℃的ctab800μl，加入离心管中，65℃水浴1h，间或摇匀混合液。

(3)12000rpm，4℃离心20min，取上清转入另一个2ml离心管中。

(4)加入预冷的(4℃)等体积的酚：氯仿(1:1)，充分混匀，12000rpm，4℃离心10min，取上清转入2ml的离心管中。

(5)用预冷的(4℃)等体积的氯仿：异戊醇(24:1)抽提2次，充分混匀，12000rpm，4℃离心10min，取上清转入1.5ml的离心管中。

(6)加入60μl的naac(3m,ph5.2)，并加入500μl预冷的(-20℃)异丙醇于-20℃静置20min以上，使dna沉淀。

(7)12000rpm，4℃离心10min，弃上清。

(8)加入1ml预冷的(4℃)70％的乙醇，轻轻上下颠倒，12000rpm，4℃离心10min，弃乙醇，自然干燥，静置15min以上。

(9)加入50μl的ddh2o，轻轻敲打使沉淀溶解。

(10)dna提取物于-20℃保藏。

羊肚菌菌丝基因组dna取5μl与2μl6×loadingbuffer混合均匀后，用2％琼脂糖凝胶于凝胶电泳仪上进行电泳，然后将琼脂糖凝胶置于凝胶成像系统中进行检测并观察图像结果。实验结果见图1。图1显示用ctab法提取羊肚菌菌丝是有效的，且该dna是接下去实验的基础。

2.3its区序列的pcr扩增

2.3.1退火温度筛选

采用真菌通用引物its1(5’-tccgtaggtgaacctgcg-3’,seqidno.2)和its4(5’-tcctccgcttattgatatgc-3’,seqidno.3)进行its区序列的扩增。

25μlpcr反应体系：10×pcrbuffer2.5μl，rtaq酶(5u/μl)0.2μl，mgcl2(25mmol/μl)2μl，dntps(10mmol/μl)0.3μl，primerits40.5μl，primerits50.5μl，dna模板2.5μl，ddh2o16.5μl。

反应程序：94℃预变性5min；94℃变性45s；52-62℃温度梯度退火45s；72℃延伸45s；35个循环；72℃补平10min。

为了筛选出菌丝pcr的最佳退火温度，将反应程序中的退火温度设置为52-62℃，其他条件不变，然后进行pcr扩增，将pcr产物与2μl6×loadingbuffer混合均匀后，用2％琼脂糖凝胶于凝胶电泳仪上进行电泳，然后将琼脂糖凝胶置于凝胶成像系统中进行检测并观察图像结果。实验结果见图2。

图2显示58℃时条带最清晰，且比较亮，所以58℃是相对来说比较合适的退火温度。

筛选出菌丝dna的pcr的最佳退火温度为58℃后，以此为反应条件进行普通pcr，其他条件不变。将pcr产物与2μl6×loadingbuffer混合均匀后，用2％琼脂糖凝胶于凝胶电泳仪上进行电泳，然后将琼脂糖凝胶置于凝胶成像系统中进行检测并观察图像结果。结果见图3。图3显示，退火温度为58℃时，条带都非常明亮清晰。

2.4按筛选出的退火温度进行pcr扩增，完成后，取5μlpcr产物与2μl6×loadingbuffer混合均匀后，用2％琼脂糖凝胶于凝胶电泳仪上进行电泳，然后将琼脂糖凝胶置于凝胶成像系统中进行检测并观察结果。

2.5胶回收

(1)切胶后，用1ml的枪头在1.5ml的离心管中尽量捣碎。

(2)加入300μl(最多不超过600μl)bindingb，55℃水浴10min。

(3)融化后转移至套管中，使膜接触液体，充分湿润2min后，离心。

(4)加入600μlwashd，离心，弃液体。

(5)加入400μlwashd，离心，弃液体。

(6)空管离心后，静置让酒精挥发15min以上。

(7)加入ddh2o30μl，放置半小时以上，让胶回收产物充分溶解在水中。

(8)取5μl胶回收产物与2μl6×loadingbuffer混合均匀后，用2％琼脂糖凝胶于凝胶电泳仪上进行电泳，然后将琼脂糖凝胶置于凝胶成像系统中进行检测并观察结果。结果见图4。图4显示，胶回收效果很好，条带明亮清晰。

2.6克隆

(1)在微型离心管中依次加入胶回收产物4μl(可根据胶回收浓度适当增减，最多不超过4μl)，peasy-t3cloningvector1μl，轻轻混合，25℃反应10min。反应结束后，将微型离心管放置于冰上。

(2)把连接产物加到50μl的trans1-t1感受态细胞中(要在感受态细胞刚解冻时加入连接产物，且始终放置在冰盒上。)，轻弹混匀，冰浴20-30分钟。

(3)42℃水浴热激50秒，立即置于冰上5分钟。

(4)加入250μl的已平衡至室温的lb液体培养基，200rpm、37℃培养1小时。

(5)取20μl的500mmiptg和40μl20mg/mlx-gal滴在平板上混合，均匀地涂在准备好的平板上(培养基中含有千分之一的氨苄)，在37℃培养箱中放置30分钟。

(6)等到30分钟后iptg和x-gal被吸收后，取200μl菌液均匀地涂在平板上，在37℃培养箱中培养过夜(为得到较多的克隆，12000rpm瞬离，弃掉100μl上清，保留200μl左右，轻轻吹打沉淀，使其充分溶解，吸取剩下全部菌液进行涂板)。

(7)16小时后(不要超过16小时)把过夜培养的培养皿取出，观察并挑选(用小枪头)不同区域的菌(最好选择一个区域只有单个菌的)，连同小枪头放入到1.5ml离心管中，然后往离心管中加入1ml液体lb培养基，将离心管放置于摇床上200rpm、37℃培养3小时。3小时后以此作为dna模板进行pcr扩增加以验证(pcr体系及反应条件皆同上)。

(8)挑选白色单克隆接种于lb液体培养基中，200rpm、37℃培养过夜，第二天提取质粒，取17μl质粒用限制性内切酶ecori进行酶切鉴定，并跑胶观察结果。结果如图5所示。

图5显示，质粒条带明亮，浓度较高，可以用作后续实验进行酶切。

(6)取部分质粒，用限制性内切酶ecori进行酶切鉴定，用2％琼脂糖凝胶于凝胶电泳仪上进行电泳，然后将琼脂糖凝胶置于凝胶成像系统中进行检测并观察图像结果。实验结果见图6。电泳图显示，1、2、3、4、6号的质粒都已经转入了载体，5号则没有。

(10)将酶切成功的剩余质粒送至上海生工进行测序。

测序结果如下(seqidno.4)：

5’-ggatcggcagtgattgtatacgactcactatagggcgaattgggcccgacgtcgcatgctcccggccgccatggcggccgcgggaattcgattggatcgcccttggaagtaaaagtcgtaacaaggtttccgtaggtgaacctgcggaaggatcattaccaagaaccacacagaaaagggcagccgaggggccaaccagggctagtagctttacgttgttgaacgtcctggaacggacccggagccgcccccatctaaacactctgcgtacccatcccaccttgcttcccccggccatccgctggggggaggaacaacaaccaaaactctttgtgaagaaacagacgtcagaatcataaccaaaaaaaagttaaaactttcaacaacggatctcttggttcccacatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataagtaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgaatctttgaacgcacattgcgccctctggtattccggggggcatgcctgttcgagcgtcataaaaacctcctcccccttcgggtttgattactatcgttgggggggtattggcctactgggaaagcgatttggcaattgccttcccactgtcctaaatacacttagacccgcctccagatgcgacagcaccgaggccatcaaccgtggagttatggaataccgttctccacacgccgatggcaaaccggtcgcagttgcgggcgtaaattggagccctcttcaggaccctcgtggcctagcatccaccatacatattttgacctcggatcaggtagggatacccgctgaacttaagcatatcaataagcggaggaaaagggcgatcccaatcactagtgaattcgcggccgcctgcaggtcgaccatattgggagagctcccaacgcgttggatgcatagcttgagtattctatagtgtcacctaaatagcttggcgtaatctgggtcatagctgtttcctggggtgaaatt-3’。

2.7blast比对

将上述测序序列去掉引物序列后，提交(如上用下划线标出的部分序列作为进行正式对比的序列，seqidno.1)到ncbi(nationalcenterforbiotechnologyinformation)，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/，进行blast比对。

blast比对结果如图7和图14所示，图14显示了morchellaeximiavouchersaas-1的its序列与超群羊肚菌(morchellaeximiavoucherlip:ph253)的its序列部分比对结果(query代表morchellaeximiavoucherlip:ph253；sbjct代表morchellaeximiavouchersaas-1)。比对结果显示，提交的序列(seqidno.1)与morchellaeximiavoucher的its序列比较分析，两者存在3个碱基的差异(如图14所示箭头所示)，序列相似性达99％。由此推断样品为morchellaeximiavoucher，名为超群羊肚菌，是一种新的超群羊肚菌菌株。命名为：morchellaeximiavouchersaas-1。

2.8构建系统进化树

2.8.1运用软件phyml3.0构建进化树。从ncbi官网(www.ncbi.nlm.nih.gov)下载目前已知的羊肚菌品种的its序列，利用软件musclev3.7处理各its序列后，根据最大似然法对其进行亲缘关系分析)，将morchellaeximiavouchersaas-1的its序列(seqidno.1)与其他羊肚菌物种:morchellaseptentr,morchelladelicious(小羊肚菌)，morchellabrunnea,morchellaelata(高羊肚菌),morchellapurpuras(异侧丝紫色羊肚菌),morchellanorvegie,morchelladisparil,morchellasnyderi,morchellaangustic,morchellaeximioid,morchellacostata(肋脉羊肚菌),morchellacapitata,morchellaexuberan,morchellasextelat,morchellaeximia(超群羊肚菌)，morchellaseptimel,morchellaconica(尖顶羊肚菌)，morchelladunalii,morchellagigas,morchellasemilibe(半开羊肚菌),morchellapakistan,morchellapopuliph,morchellapunctipe,morchellatridenti,morchellaquercusi,morchellaelatoide,morchellafrustrat,morchellatomentos,morchellarufobrun(红褐羊肚菌),morchellaanatolic,morchellasteppico,morchellaspongiol(小海绵羊肚菌),morchelladunensis,morchellaprava,morchelladiminuti,morchellaulmaria,morchellacryptica,morchellacastanea,morchellavulgaris(普通羊肚菌),morchellaesculent,morchellaamerican,morchellavirginia,morchellasceptrif,morchellapalazoni,morchellacrassipe(粗柄羊肚菌),morchellafluviali以及aspergillusflavus(黄曲霉)的its序列一起构建进化树，结果如图8所示。

图8显示，本发明实施例提供的超群羊肚菌morchellaeximiavouchersaas-1其他46个羊肚菌品种的亲缘关系比较，结果发现虽然morchellaeximiavouchersaas-1与超群羊肚菌(morchellaeximia)的同源相似性较高，但亲缘关系上还是存在一定的差异。

2.8.2将本实施例的morchellaeximiavouchersaas-1的its序列(seqidno.1)与其他14种超群羊肚菌(morchellaeximia)亚种的its序列采用与上述步骤相同的方法构建进化树，确定该菌株在超群羊肚菌中的地位，结果如13所示。

从图13的结果可看出，morchellaeximiavouchersaas-1与morchellaeximiavoucherfr0410亲缘关系较近。

上述结果，充分说明本发明实施例提供的超群羊肚菌(morchellaeximiavouchersaas-1)是一种新的超群羊肚菌菌株，不曾被现有技术记载。

综上结果，上述分离得到的羊肚菌菌株是一种新的超群羊肚菌菌株，该菌株于2016年1月13日保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，地址：中国武汉武汉大学，分类命名为：morchellaeximiavouchersaas-1，保藏编号为：cctccno:m2016032。

实施例2

本实施例提供的鉴定保藏编号为cctccno:m2016032的超群羊肚菌的鉴定方法，其包括：

1采用真菌通用引物its1和its4扩增待测菌种的its区序列，得到待检序列；

其中，its1的碱基序列如seqidno.2所示，its4的碱基序列如seqidno.3所示。

其中，pcr反应体系(25μl)：10×pcrbuffer2.5μl，rtaq酶(5u/μl)0.2μl，mgcl2(25mmol/μl)2μl，dntps(10mmol/μl)0.3μl，primerits40.5μl，primerits50.5μl，dna模板(待测菌种dna)2.5μl，ddh2o16.5μl。

pcr反应程序：94℃预变性5min；94℃变性45s；58℃温度梯度退火45s；72℃延伸45s；35个循环；72℃补平10min。

2将待检序列与参考序列进行比对，如果待检序列含有参考序列，则指示所述待测菌种为保藏编号为cctccno:m2016032的超群羊肚菌。

其中，参考序列如seqidno.1所示。该参考序列源自保藏编号为cctccno:m2016032的超群羊肚菌的rdna的its序列。

实施例3

本实施例提供了提取自超群羊肚菌(cctccno:m2016032)的超群羊肚菌提取物，该超群羊肚菌提取物为超群羊肚菌水提物或超群羊肚菌醇提取物。

该超群羊肚菌提取物的提取方法如下：

1取超群羊肚菌(cctccno:m2016032)新鲜子实体200g，用75％的乙醇冲洗子实体两次，子实体放置-80℃冰箱冻干4h。

2将冻干子实体转移至50ml离心管中，并按1:10(m/v)的比例加入95％(v/v)乙醇，40℃，(400w)超声破碎三次，每次破碎30min。破碎间隔时间为30min。

3于10000rpm离心(16000×g)15分钟，转移上清液(沉淀备用，用于制备超群羊肚菌水提物)至旋转真空蒸发器，60℃条件蒸干，即得超群羊肚菌醇提取物。

4步骤3中的沉淀利用热风干燥仪(60℃)处理2h提取，按照1:20(w/v)比例加入蒸馏水，在100℃水浴三次，每次2小时。过滤，收集滤液并在冷冻浓缩仪中浓缩至原体积的1/10，即得到超群羊肚菌水提物。

该提取方法步骤简单，快捷，不需要复杂仪器，并可以一次性大量提取羊肚菌多糖。

本实施例提供的超群羊肚菌提取物具有促进t细胞增殖和抑制肿瘤细胞增殖的作用，可用于制备提高免疫力药物或保健品，以及制备预防或治疗肿瘤药物等领域中。

实施例4

验证实施例3得到的超群羊肚菌提取物对t细胞增殖的促进作用，实验方法如下：

1每组实验取10只小鼠，每天灌胃1次，持续30天，

2将小鼠麻醉后分离脾脏，研磨，并将研磨后的悬浮液利用70μm滤膜过滤，

3滤液1500rpm离心5min，将细胞液放入ack裂解缓冲液中温浴10分钟，

4加入抗小鼠cd4磁性颗粒(bdbioscience,sanjose,ca,usa)，从脾细胞中分离出cd4+t细胞。

5将t细胞置入浓度为5mm的羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂溶液中，37℃温浴10min，转移至含有10％fbs的冷的rpmi1640培养基中，1000rpm离心3min，重复一次。

6分别以含有不同浓度的超群羊肚菌水提物(0μg/ml(作为对照),0.25μg/ml,2.5μg/ml,5μg/ml)的rpmi1640培养基培养和加入有不同浓度(体积比)(0％(作为对照)，0.1％，1％，10％，50％)的超群羊肚菌醇提取物的rpmi1640培养基培养t细胞，37℃，72h，收集细胞，并用流式细胞仪分析t细胞增殖情况。结果如图9和图10所示(图为流式细胞仪对t细胞的检测图谱，横坐标表示检测细胞时的荧光强度，纵坐标表示细胞计数即count)。

图9显示了不同浓度(0μg/ml,0.25μg/ml,2.5μg/ml,5μg/ml)的超群羊肚菌水提物对t细胞增殖的影响，如图9所示，超群羊肚菌水提物能够促进t细胞增殖，且浓度越大，t细胞数量越多，说明超群羊肚菌水提物促进t细胞增殖作用越明显。

图10显示了不同浓度(0％，0.1％，1％，10％，50％)的超群羊肚菌醇提物对t细胞增殖的影响，如图10所示，超群羊肚菌醇提物能够促进t细胞增殖，且加入的超群羊肚菌醇提物量越多，t细胞数量越多，促进增殖效果越明显。

由此表明，实施例3得到的超群羊肚菌提取物对t细胞增殖的具有促进作用，其可以用于制备提高免疫力的药物或保健品。

实施例5

验证实施例3得到的超群羊肚菌提取物的肿瘤细胞增殖的抑制作用，实验方法如下：

1将肿瘤细胞(daudi，namalwa，su-dhl-4，三种不同的人淋巴瘤细胞)分别置于完全培养基中，37℃，5％co2的培养箱中进行培养，每2天换液一次，每瓶加5ml培养基。

2用20ml的0.01％m磷酸钾缓冲液冲洗两次，25℃下，用含0.28％胰蛋白酶的乙二胺四乙酸(1x)消化5分钟，取长势良好对数增殖期细胞。

3利用血球计数板计数将细胞浓度调整为2.5*104个/ml,将150μl细胞悬液加入96孔板中，培养1天后，吸取培养基，加入含有不同浓度(0μg/ml(作为对照组),1μg/ml,10μg/ml,100μg/ml，1000μg/ml)超群羊肚菌醇提物的培养基和含不同浓度(体积比，0‰(作为对照组)，0.01‰，0.1‰，1‰，10‰)超群羊肚菌水提物的培养基，培养24小时。

4黑暗条件下，每孔加入30μl5mm的mtt溶液，co2培养箱中进行培养5h，吸去孔中的培养基，加入150μl的二甲基亚砜，避光静置20分钟后酶标仪检测细胞生长情况。结果图11和图12所示。

图11显示了不同浓度的超群羊肚菌醇提物对三种不同的人淋巴瘤细胞增殖的影响结果，如图11所示，超群羊肚菌醇提物具有抑制肿瘤细胞例如淋巴瘤细胞增殖的作用。浓度越大对人淋巴瘤细胞抑制作用越明显。

图12显示了不同体积的超群羊肚菌水提物对三种不同的人淋巴瘤细胞增殖的影响结果，如图12所示，超群羊肚菌水提物具有抑制肿瘤细胞例如淋巴瘤细胞增殖的作用。浓度越大对人淋巴瘤细胞抑制作用越明显。

以上结果说明，实施例3提供的超群羊肚菌提取物对肿瘤细胞例如人淋巴瘤细胞具有抑制增殖的作用，由此表明实施例3提供的超群羊肚菌提取物可以用于制备预防或治疗肿瘤的药物。

实施例6

本实施例提供的用于培养保藏编号为cctccno:m2016032的超群羊肚菌的固体培养基，含有：土豆汁，杨树叶提取物，葡萄糖，kh2po4以及琼脂。

本实施例提供的培养基通过如下方法制备：

1取土豆200g，去皮，切成2cm长的小块，煮熟，纱布过滤，留取土豆滤液。

2选取云南曲靖野生生长杨树老叶或落叶(棕色或者黄色)，晒干。取晒干杨树叶200g，切成1cm*0.5cm条状,加入500ml水，水煮20min，纱布过滤，留取滤液，即杨树叶提取物。

3将上述两种滤液混匀，向其中加入20g葡萄糖，kh2po41g，琼脂15g，加水至1l，配制成用于培养保藏编号为cctccno:m2016032的超群羊肚菌的培养基，也可理解为改良pda培养基。

实施例7

实施例6提供的培养基对保藏编号为cctccno:m2016032的超群羊肚菌的培养效果，方法如下。

将超群羊肚菌接种至实施例6提供的培养基上，作为实验组，以普通pda培养基作为对照，观察超群羊肚菌的生长情况。结果见下表1。

表1

表中：++表示菌丝长势一般,++++表示菌丝长势很好,**表示菌核数量一般,****表示菌核数量很多。

由表1结果可知，采用实施例6的培养基进行培养，超群羊肚菌(cctccno:m2016032)的长势、日平均生长速度、菌丝浓密度、满板时间、菌核形成时间、菌核数量等生长指标均优于普通pda培养基。

形态观察结果显示，在实施例6提供的培养基上，接种后6h开始萌发，生长初期菌丝紧贴培养基，向培养基外缘方向生长，菌丝颜色为半透明，有光泽，一般为不分支的较粗的菌丝体，2天后生长缓慢，菌丝颜色变深，气生菌丝增加，菌丝呈白色且有“y”或树杈状分支，4天后，菌丝由淡黄色逐渐呈棕褐色，菌丝多扭结，多处聚集成片状；6天后，菌核呈现，呈褐色，菌核直径为1.2-4.3mm之间，质地坚硬，呈深褐色。

实施例8

本实施例提供了本实施例提供的用于培养保藏编号为cctccno:m2016032的超群羊肚菌的液体培养基，含有：黄豆粉，杨树叶提取物，葡萄糖，kh2po4以及琼脂。

该液体培养基的制备方法如下：

选取普通杨树老叶或落叶(棕色或者黄色)，晒干；

取晒干的杨树叶200g，切成1cm*0.5cm条状，加入500ml水，水煮20min，纱布过滤，留取滤液；

向滤液中添加5g黄豆粉，20g葡萄糖，加水至1l，用于培养保藏编号为cctccno:m2016032的超群羊肚菌的液体培养基。

实施例9

实施例8提供的液体培养基对保藏编号为cctccno:m2016032的超群羊肚菌的培养效果，方法如下。

将固体斜面培养基上生长旺盛的菌株接种到盛有100ml实施例8提供的液体培养基的500ml的三角瓶中，25℃条件下培养4天，培养期间，150rpm与静置培养按照24h/24h周期进行，防止形成菌球，观察菌丝生长情况；以普通的pda液体培养基作为对照。结果如下表2所示。

表2

表中：++表示菌丝长势一般，++++表示菌丝长势很好。

由表2可知，与普通的pda液体培养基相比，采用实施例8提供的液体培养基培养，菌丝生长速度快，生物量高，抗杂菌能力强，污染率少，菌核生成时间短。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

sequencelisting

<110>上海市农业科学院

<120>超群羊肚菌的应用

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