本发明涉及一种花椒提取物及其应用，属于医药领域。
背景技术：
抑郁症是一个重要的公共卫生问题。它是一种情感性精神障碍，表现为持久的情绪低落或悲痛欲绝，对日常生活丧失兴趣，精神萎靡不振，食欲减退和睡眠障碍等症状，严重者对自身心理健康、家庭和社会关系均产生危害。抑郁症发生机制尚不完全明确。研究发现抑郁症与遗传、心理、神经、内分泌等因素诱发中枢去甲肾上腺素(ne)或(和)5-羟色胺(5-ht)、多巴胺(da)和神经肽等神经递质含量降低及其受体功能下降有关。近年来还发现与下丘脑-垂体-肾上腺轴负反馈失调，谷氨酸传导障碍，神经免疫异常等因素有关。
抑郁症的治疗方法很多，以往主要给予心理治疗，近20年来才逐步确立了药物治疗的主导地位。目前抗抑郁药物主要以西药为主。但是现有西药治疗只在一定程度上有效，且不良反应严重。抑郁症在中医辨证符合肝郁气结，忧郁伤神，心脾两虚证。近年来中西联合用药在抑郁症的治疗中收效良好。因此开发中药资源，寻找疗效可靠、依赖性低、剂量易于控制、安全耐受性好的新型抗抑郁用药势在必行。
花椒的化学成分丰富，主要包括生物碱、酰胺、木质素、香豆素、黄酮类、挥发油和脂肪酸等，具有镇痛、麻醉、抑菌、杀虫、抗癌、抗氧化等功效。同时花椒在民间常被用作芳香调味品，是常见的药食两用中药，这些性质使其成为寻求植物提取物或有效活性成分的理想来源。
而在本技术领域内，虽然对于花椒的提取方法或所适用的化学提取方法众多，但不同的方法所获得的提取物无论是在有效成分或有效成分的含量上都是具有差异的，不同的提取物具有不同的药理活性。甚至通过某种提取方法提取出来的提取物，由于其有效成分含量过于低，几乎无法检测出其所具有的药理活性。因此，针对花椒的提取，迫切需要一种统一规范的提取方法，可以依次提取出具有药理活性的提取物，不仅可以直接使用，更适合于后期的分离和活性成分的制备工作。
技术实现要素：
以花椒为研究对象，针对目前花椒类植物提取适用的提取方法众多，莫衷一是，发明人经过自己的研究和不断的实验摸索，提出来一种成分稳定，制备方便，却具有显著药理活性的一种花椒提取物，其中，
1)称取花椒的不同部位，粉碎，然后使用提取溶剂进行冷浸，原料与提取溶剂体积比为1:2～20，过滤合并溶液，得到提取液；
2)浓缩，将步骤1)所得提取液经浓缩后形成浸膏，得到提取物1；
3)精制，将步骤2)所得提取物1使用硅藻土或硅胶进行吸附，充分干燥后装柱并使用流动相a进行洗脱，收集洗脱液，分别浓缩得到系列流动相a的提取物2；或将提取物1用水分散后吸附于大孔树脂并使用流动相b进行洗脱，收集洗脱液，分别浓缩得到系列流动相b的提取物3，所述提取物1，2和3为所述的花椒提取物。
本发明还提供了一种花椒提取物，其中，所述花椒的不同部位优选：果皮、茎、叶和根。果皮优选干燥果皮。
在上述步骤1中，所述花椒的不同部位优选粉碎至10-20目。
本发明还提供了一种花椒提取物，其中，所述提取溶剂为含水低级醇，即碳原子个数小于4的各种醇类，优选体积分数为90％-95％的乙醇水溶液。更优选体积浓度95％的乙醇水溶液。
有专利公开了一种花椒属植物的提取方法，目的为提取花椒属植物中的总多酚类化合物，使用提取溶剂为40％-80％的乙醇水或纯水溶液来提取花椒属植物。而本发明中优选了90％-95％的乙醇水溶液，目的在于更为全面地提取花椒内各种极性的化合物，更倾向于提取极性相对较小的化合物，而不仅仅侧重于花椒属植物中的多酚类化合物。
本发明还提供了一种花椒提取物，其中，步骤1)的提取溶剂的提取方式优选为冷浸提取法。
为提高冷浸提取的效果，所述冷浸提取法优选：提取溶剂为95％的乙醇水溶液，所述花椒的不同部位经过粉碎后，所述花椒的不同部位与提取溶剂的体积比优选为1:2-20，优选1:5-10；冷浸提取时间每次5-10天，优选7天，提取溶剂温度为：20-25℃，共提取三次，过滤，合并滤液，得到提取液。
在步骤2)中，将步骤1)所得提取液经浓缩后形成浸膏，将浸膏浓缩至无液体旋出即可，得到提取物1；
提取物1进入步骤3)前的技术要求：所述提取物1在进入步骤3之前需要进行预处理，如果使用硅藻土或硅胶进行吸附时，所述提取物1需要将水除尽，以保证硅胶或硅藻土柱的柱效果。如果所述提取物1需要使用大孔树脂或聚酰胺树脂进行吸附时，则需将提取物1中有机溶剂除尽，以保证流动相起始梯度不受影响。
步骤3)中将所述提取物1与硅藻土或硅胶进行装柱吸附处理，优选硅藻土，为保证吸附效果和实验成本，此时提取物1与硅藻土的质量比应为1:1-3，优选1:1.5-2。当硅藻土或硅胶吸附提取物1完成后进行装柱，形成硅藻土或硅胶柱，此时需要流动相a进行逐一洗脱，洗脱后进行浓缩，所述流动相a依次为石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇和水，流动相a各组分用量为所述吸附完成后的硅藻土柱或硅胶柱体积的3-5倍。所述流动相a各组分用量并不恒定，依据tlc结果进行确定流份。
因柱层析过程中影响因素较多，所以，该过程中优选通过薄层检测法(tlc)来确定所需流份。即，tlc薄层硅胶板可根据工具书自配薄层硅胶板或商用薄层硅胶板，10％浓硫酸显色(115℃烘2分钟)显色。以此为确定流份标准进行不同流份的洗脱。所述tlc基本采用柱子洗脱液系统作为展开剂，针对不同的化合物，优选二氯甲烷-甲醇、石油醚-丙酮系统等系统；系统的比例可以根据所要洗脱的化合物极性进行主动调整，寻找最优的展开配比。所述系统展开剂比例调配属于常规的tlc操作步骤。
在上述花椒提取物中，在上述提取物中的提取步骤中，所述流动相a依次为石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇和水，流动相a各组分用量为所述吸附完成后的硅藻土柱或硅胶柱体积的3-5倍。
经过流动相a洗脱浓缩后，得到系列流动相a的提取物2，也称为流动相a的活性部位，分别为石油醚活性部位、二氯甲烷活性部位、乙酸乙酯活性部位、正丁醇活性部位、甲醇活性部位和水活性部位。
所述流动相a的种类和顺序均是根据发明人研究后，经过大量的探索所得到，其目的就是为了尽可能获得具有生物活性的提取物。
具体实施例中研究发现，二氯甲烷、正丁醇、乙酸乙酯的活性部位在生物活性上优于或接近与上述提取物1(即花椒95％乙醇冷浸提取物)的生物活性水平。其他活性部位提取物也具有生物活性，说明二氯甲烷、正丁醇、乙酸乙酯的活性部位已将花椒内具有生物活性的物质较好地富集起来，优于了提取物1(粗提取物)的生物活性效果。活性部位进一步优选二氯甲烷和乙酸乙酯的活性部位。
本发明进一步提供一种花椒提取物，在上述提取物中的提取步骤中，所述流动相b依次为水、5-95％体积分数的乙醇-水梯度溶液或5-95％体积分数的丙酮-水梯度溶液或5-95％体积分数的甲醇-水梯度溶液。
当提取物1采用大孔树脂或聚酰胺树脂进行层析分离时，需要将提取物1进行水分散，方便柱吸附。当采用开放式大孔树脂或，采用流动相b进行洗脱，洗脱后进行浓缩，得到提取物3。
所述大孔树脂优选大孔树脂的填料为型号d系列、hpd系列、hp系列、xad系列或ab-8型的大孔树脂。优选d101系列。
所述流动相b依次为水、5-95％体积分数的乙醇-水梯度溶液或5-95％体积分数的丙酮-水梯度溶液或5-95％体积分数的甲醇-水梯度溶液。
所述流动相b进一步优选依次为水、20％乙醇水溶液、50％乙醇水溶液、70％乙醇水溶液、90％乙醇水溶液和无水乙醇浓度的梯度洗脱液。
在上述使用流动相b洗脱大孔树脂中，所述大孔树脂的柱体积与流动性b的体积比为：1:3-5。
经过流动相b洗脱浓缩后，得到系列流动相b的提取物3，也称为流动相b的活性部位。
具体实施例中研究发现，大孔树脂20％乙醇洗脱部位组、大孔树脂50％乙醇洗脱部位组和大孔树脂70％乙醇洗脱部位组在生物活性上优于或接近上述提取物1(即花椒95％乙醇冷浸提取物)的生物活性水平。而其他洗脱部位组也具有生物活性，说明大孔树脂20％乙醇洗脱部位组、大孔树脂50％乙醇洗脱部位组和大孔树脂70％乙醇洗脱部位组已将花椒内具有生理活性的物质较好地富集起来，优于了提取物1(粗提取物)的生物活性效果。优选大孔树脂50％乙醇洗脱部位组和大孔树脂70％乙醇洗脱部位组。其中大孔树脂70％乙醇洗脱部位所具有的生物活性效果最好。
为进一步具体化所述花椒提取物的制备过程，本发明进一步提供一种花椒提取物，其中，所述提取物由以下步骤制备得到：
1)称取花椒干制果皮，粉碎至20目，使用95％乙醇水溶液冷浸提取，固液体积比为1:5，每次冷浸7天，共提取3次，提取温度为23-25℃，过滤合并滤液，得到提取液；
2)浓缩，将提取液经浓缩至浸膏，得到提取物1，所述提取物1将水除尽；
3)精制，将提取物1使用硅藻土进行吸附，提取物1和硅藻土的质量比1:1.5-2，吸附完制备硅藻土柱，使用流动相a依次为石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇、水进行洗脱，流动相a各组分的体积为所述硅藻土柱体积的3-5倍，收集洗脱液，分别浓缩得到系列流动相提取物2；或所述提取物由以下步骤制备得到：
1)称取花椒干制果皮，粉碎至20目，使用95％乙醇水溶液回流，过滤合并滤液，得到提取液；
2)浓缩，将提取液经浓缩至浸膏，得到提取物1，所述提取物1将有机溶剂除尽；
3)精制，将提取物1使用少量水分散后，使用大孔树脂d101柱进行吸附完全后，使用流动相b洗脱，所述流动相b分别依次为水、20％乙醇水溶液、50％乙醇水溶液、70％乙醇水溶液、90％乙醇水溶液及无水乙醇洗脱液，各个流动相组分的体积为3-5倍的大孔树脂d101柱体积，收集各个部分洗脱液，浓缩后得到系列流动相提取物3。得到的系列流动相提取物3又称为流动相b的活性部位。
上述大孔树脂技术方案中的所述少量水的技术要求：可以将提取物1分散，便于上柱吸附操作，但水量不能影响到洗脱中流动相b的洗脱梯度效果，属于本领域人员常见操作技术。
在大孔树脂提取技术方案中，所述步骤1)的干制果皮提取方式优选95％乙醇水溶液回流提取。
在上述的花椒提取物中，无论是采取硅藻土层析或是大孔树脂层析，所述步骤2)和3)的浓缩优选减压浓缩。将提取液浓缩至浸膏，至无液体旋出为止。
当提取物1使用大孔树脂进行层析时，所述流动相b分别依次为水、20％乙醇水溶液、50％乙醇水溶液、70％乙醇水溶液、90％乙醇水溶液及无水乙醇洗脱液，各个流动相组分的体积为3-5倍的大孔树脂d101柱体积时，所得流动相b的活性部位分别具有以下特征：
花椒提取物大孔树脂水洗脱活性部位主要含有多糖及多酚类成分，tlc检测展开剂为二氯甲烷：甲醇＝3：1条件下，rf值小于0.1。
花椒提取物大孔树脂20％乙醇洗脱活性部位主要含有黄酮苷类及酚苷类化合物。具体含有金丝桃苷，槲皮苷，其中酚苷类多为小分子酚酸类连糖，如arbutin、
1-β-d-glucopyranosyloxy-3-methoxy-5hydroxybenzene、3-methoxyphenethyl
alcohol-4-o-β-d-glucopynanoside，orcinol-3-o-β-d-glucopyranoside，syringin等。
花椒提取物大孔树脂50％乙醇洗脱活性部位主要含有羟基或羧基取代的含有多不饱和脂肪链酰胺类化合物。tlc检测展开剂为石油醚：丙酮＝3：1条件下rf值为0.3-0.7，具体含有zp-amidea、zp-amideb、zp-amidec、zp-amided、zp-amidee、zp-amidef、qinbunamidea，qinbunamide、bungeanumamidea、bungeanumamideb等。
花椒提取物大孔树脂70％乙醇洗脱活性部位主要含有多不饱和脂肪链酰胺及挥发油类，其中以hydroxy-α-sanshool含量最高，其他多不饱和脂肪链酰胺如bungeanool、isobungeanool等。挥发油类主要含有醇类，如芳樟醇、松油；酮类，如胡椒酮和薄荷酮等。
花椒提取物大孔树脂90％乙醇及无水乙醇洗脱活性部位主要含有脂肪酸，挥发油类化合物。tlc检测展开剂为石油醚：乙酸乙酯＝4：1的条件下，rf值为0.6-1。
由此可见，所述提取物的活性部位含有的成分各不相同，因此具有不同的生物活性。
本发明提供了一种花椒提取物，对于花椒进行了全面细致的提取，该提取物既是现有药物存在的不足进行很好的补充，也对于花椒目前的提取物和提取流程的重要指导。
本发明的另一个目的在于，提供一种抗抑郁药物组合物，该组合物由有效剂量的本发明所述花椒提取物及药学上可接受的辅料组成。所述的药学上可接受的辅料，是指为制成适用于人类或动物使用的任何药物剂型所需的辅料，如制成口服固体制剂时，药学上可接受的辅料指稀释剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、助流剂；制成注射液时，药学上可接受的辅料指ph调节剂、助溶剂、抗氧剂、等渗剂等。所述的药物是指制成片剂、丸剂、胶囊剂、悬浮剂、软膏剂或乳剂等。
体外或体内药效学试验结果表明，本发明花椒植物提取物能保护神经细胞，不同浓度的花椒提取物均能显著提高皮质酮损伤的pc12细胞的存活率；且对与抑郁相关的单胺氧化酶a(mao-a)具有抑制作用；同时可显著缩短小鼠“行为绝望抑郁模型”中小鼠悬尾和强迫游泳不动时间。
因此本发明还进一步提供了上述花椒提取物在制备抗抑郁药物中的应用。
发明人通过以下实验来验证本发明中花椒提取物及不同活性部位的有益效果。
再次重申：以下实验只是本发明研发过程中众多实验中的举例性实验，并未涵盖和穷尽了发明人为本发明所做的所有实验，目的仅仅在于用那些数据来阐述本发明花椒提取物及活性部位的抗抑郁活性。
具体实施方式
实施例1
花椒95％乙醇冷浸提取物的制备
花椒干燥果皮23.5kg，粉碎后用5倍体积的95％乙醇冷浸(温度：20-25℃)提取3次，每次7天，合并提取液，过滤，滤液减压浓缩得到95％乙醇提取物5.1kg。
实施例2
花椒95％乙醇提取物石油醚部位制备
实施例1所得95％乙醇提取物均匀的拌于10kg硅藻土上，充分吸附并干燥后装柱，用石油醚洗脱2-4个柱体积，回收溶剂后，得到石油醚部位1250g。标记为p部位。
实施例3
花椒95％乙醇提取物二氯甲烷部位样品制备
将实施例2洗脱后的柱子，使用二氯甲烷洗脱，回收溶剂后，得到二氯甲烷部位470g。标记为c部位。
实施例4
花椒95％乙醇提取物乙酸乙酯层样品制备
将实施例3洗脱后的柱子，使用乙酸乙酯洗脱，回收溶剂后，得到乙酸乙酯部位301g。标记为e部位。
实施例5
花椒95％乙醇提取物正丁醇层样品制备
将实施例4洗脱后的柱子，使用正丁醇洗脱，回收溶剂后，得到正丁醇部位268g。标记为b部位。
实施例6
花椒95％乙醇提取物甲醇层样品制备
将实施例5洗脱后的柱子，使用甲醇洗脱，回收溶剂后，得到甲醇部位302g。标记为m部位。
实施例7
花椒95％乙醇提取物水层样品制备
将实施例6洗脱后的柱子，使用水洗脱，回收溶剂后，得到水部位2000g。标记为w部位。
实施例8
花椒95％乙醇回流提取物的制备
花椒干燥果皮5kg，粉碎后用5倍体积的95％乙醇加热回流(80℃)提取3次，每次2h，合并提取液，过滤，滤液减压浓缩得到95％乙醇提取物1.2kg。
实施例9
花椒95％乙醇提取物大孔吸附树脂水洗脱部位样品制备
花椒95％乙醇提取物1.2kg分散于2l水后吸附于体积为25l的d101大孔吸附树脂，用蒸馏水洗脱3个柱体积，收集洗脱液，减压浓缩得到花椒95％乙醇提取物大孔吸附树脂水洗脱部位321g。
实施例10
花椒95％乙醇提取物大孔吸附树脂20％乙醇洗脱部位样品制备
将实施例9洗脱后的大孔吸附树脂柱，使用20％乙醇洗脱，浓缩回收溶剂后，得到花椒95％乙醇提取物大孔吸附树脂20％乙醇洗脱部位209g。
实施例11
花椒95％乙醇提取物大孔吸附树脂50％乙醇洗脱部位样品制备
将实施例10洗脱后的大孔吸附树脂柱，使用50％乙醇洗脱，浓缩回收溶剂后，得到花椒95％乙醇提取物大孔吸附树脂50％乙醇洗脱部位72g。
实施例12
花椒95％乙醇提取物大孔吸附树脂70％乙醇洗脱部位样品制备
将实施例11洗脱后的大孔吸附树脂柱，使用70％乙醇洗脱，浓缩回收溶剂后，得到花椒95％乙醇提取物大孔吸附树脂70％乙醇洗脱部位93g。
实施例13
花椒95％乙醇提取物大孔吸附树脂90％乙醇洗脱部位样品制备
将实施例12洗脱后的大孔吸附树脂柱，使用90％乙醇洗脱，浓缩回收溶剂后，得到花椒95％乙醇提取物大孔吸附树脂90％乙醇洗脱部位112g。
实施例14
花椒95％乙醇提取物大孔吸附树脂无水乙醇洗脱部位样品制备
将实施例13洗脱后的大孔吸附树脂柱，使用无水乙醇洗脱，浓缩回收溶剂后，得到花椒95％乙醇提取物大孔吸附树脂无水乙醇洗脱部位235g。
实施例15
花椒提取物及其活性部位的小鼠“行为绝望抑郁模型”实验
1材料与动物分组
1.1实验动物
icr小鼠，雄性，体重18-22g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证编号：scxk(京)2016-0009。小鼠每笼10只群养，自由摄食饮水，室温23-25℃，湿度50±10％，7:00-19:00光照。动物在新环境中适应7天后开始实验。
1.2实验仪器
透明玻璃缸，自制小鼠悬尾实验观察箱，秒表，剪刀，胶带等。
1.3实验样品
见实施例1至实施例14
1.4实验分组
小鼠随机分为5组，每组12只，对照组(control，给予生理盐水)；阳性药组(氟西汀)(20mg/kg)；
花椒提取物及其活性部位药剂量为：(低剂量)1.5g生药量/kg，(中剂量)4.5g生药量/kg，(高剂量)13.5g生药量/kg。小鼠应激实验前连续灌胃给药14天，每天一次，分别于第14天末次给药后1小时进行实验。
1.5数据处理及统计学分析
实验数据采用(平均值±标准偏差)表示。spss16.0数据处理软件进行统计分析。组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。p<0.05时，组间存在显著性差异。
2实验方法
2.1小鼠悬尾应激实验
实验采用luciensteru等建立的方法加以改进：悬尾箱为30×30×30cm，顶部中心设置一个小夹子，将胶布粘在小鼠尾端2cm处，用夹子夹住胶布，使小鼠呈倒悬姿势，头部离箱底约10cm，观察6min，记录后4min的累计不动时间。判断标准为动物静止不同、不挣扎。实验采用盲法，实验人员不知道动物的给药情况，且实验前统一训练实验人员和统一实验评判标准，操作方式和实验命令口号等，并且保证实验环境的隔离和安静。
2.2小鼠强迫游泳实验
实验依据porsolt建立的方法，将小鼠放入高20cm，直径14cm的圆柱形玻璃缸中，每缸测量1只小鼠，缸中水深根据实验要求15cm，水温(25±1)℃，训练组小鼠实验前训练游泳15min，随后取出放回笼中，24h后进行实验。对照组灌胃给予生理盐水。实验时，小鼠在缸中游泳6min，记录后4min内小鼠的累计不动时间。不动时间(immobilitytime)是指小鼠在水中停止挣扎、呈漂浮状态，或仅有细小的肢体运动以保持头部浮在水面。实验采用盲法，实验人员不知道动物的给药情况，且实验前统一训练实验人员和统一实验评判标准，操作方式和实验命令口号等，并且保证实验环境的隔离和安静。参照药理实验方法学(第四版)项下相关内容进行实验。
3.花椒提取物及其活性部位对小鼠悬尾和强迫游泳不动时间的影响
在小鼠悬尾应激实验中，与对照组比较盐酸氟西汀悬尾不动时间均显著缩短(p<0.05)；除石油醚部位外花椒95％乙醇冷浸提取物及其活性部位，中剂量及高剂量组小鼠悬尾不动时间均显著缩短(p<0.05)；低剂量组小鼠悬尾不动时间未见明显改变(见表1)；花椒95％乙醇回流提取物中剂量级高剂量组小鼠悬尾不动时间均显著缩短(p<0.05)，其中大孔吸附树脂50％乙醇和70％乙醇洗脱部位效果最显著(见表2)。
在小鼠强迫游泳实验中，与对照组比较盐酸氟西汀强迫游泳不动时间均显著缩短(p<0.05)；除石油醚部位外花椒95％乙醇冷浸提取物及其活性部位中剂量级高剂量组强迫游泳不动时间均显著缩短(p<0.05)；低剂量组小鼠强迫游泳不动时间未见明显改变(见表1)；花椒95％乙醇回流提取物中剂量级高剂量组强迫游泳不动时间均显著缩短(p<0.05)，其中大孔吸附树脂50％乙醇和70％乙醇洗脱部位效果最显著(见表2)。表1花椒95％乙醇冷浸提取物及活性部位不同剂量小鼠悬尾和强迫游泳不动时间(n＝10)
注：与对照组比较：*p<0.05
表2花椒95％乙醇回流提取物及活性部位不同剂量小鼠悬尾和强迫游泳不动时间(n＝10)
注：与对照组比较：*p<0.05
本实验采用小鼠悬尾和强迫游泳实验模型，给予icr小鼠不同剂量花椒提取物及其不同活性部位，观察各组小鼠不动时间，对花椒提取物及其不同活性部位的抗抑郁活性做出评价。结果表明，花椒提取物及其不同活性部位在中剂量及高剂量可以显著缩短小鼠悬尾和强迫游泳不动时间；并且二氯甲烷部位和乙酸乙酯部位在高剂量时与阳性药作用相似；大孔吸附树脂50％乙醇洗脱部位以及70％乙醇洗脱部位中高剂量作用仅次于阳性药。
实施例16
花椒提取物及其不同活性部位对皮质酮损伤pc12细胞保护作用研究
1实验材料与仪器
1.1药品与试剂
二甲基亚砜(dmso)，购于fisher公司(hplc级)；25％胰蛋白酶、皮质酮，购于sigma公司；dmem培养基(内含青链霉素)，购于美国invitrogen公司；胎牛血清，购于gibco公司；马血清，购于hyclone公司；pbs购于hyclone公司
1.2细胞株及器械
大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤(pc12)细胞株由中国医学科学院药用植物研究所孙晓波课题组惠赠，细胞培养瓶(coring公司)，无菌96孔板，细胞计数板，载玻片，盖玻片，玻璃移液管，尼龙过滤器，不锈钢滤器，各种规格玻璃瓶、移液枪、枪头、枪头盒和离心管。
1.3仪器
dhg-9070a电热恒温鼓风干燥箱(北京陆希科技有限公司)，mco-15ac型co2恒温细胞培养箱(日本sanyo公司)，zhjh-c1115b型超净工作台(上海智成分析仪器制造有限公司)，ckx41型倒置相差显微镜(日本olympus公司)，mqx200型酶标光度计(美国biotek仪器有限公司)，legendmicro17r型高速低温离心机(美国thermo公司)，ql-901微型涡旋混合器(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)，-80℃超低温冰箱(美国thermo公司)，kq-250b型超声波清洗器(昆山市超声波仪器厂)，ssw-420-2s型恒温水浴锅(上海博迅有限公司)，cy50945型locator液氮罐(美国thermo公司)。
2实验方法
2.1pc12细胞培养
pc12细胞按常规培养于含10％胎牛血清、5％马血清及含抗生素(青霉素100u/ml，链霉素100μg/ml)的dmem培养基中，置于5％co2，饱和湿度，37℃培养箱内培养48-72h。根据细胞生长情况，当细胞培养至对数生长期，一般贴壁约80％时，用25％的胰蛋白酶消化传代。细胞存活率筛选实验用细胞：将细胞制成细胞悬液，调细胞浓度为1×104个/ml接种于96孔培养板，每孔加100μl细胞液。置于co2培养箱，5％co2、饱和湿度、37℃条件下培养24h，待细胞长满孔底后即可。
2.2皮质酮损伤浓度和时间的优化
精密称取适量皮质酮，加入少量dmso溶解后用dmem细胞培养液稀释(dmso为0.05％)，配制成不同浓度(10、20、40、100、200和400μmol/l)的皮质酮溶液(corticosterone，cort)，同一浓度设5个复孔。同时分别设置6个空白调零孔和6个正常对照孔，均不加入皮质酮溶液。吸出培养液，加入皮质酮溶液，分别在37℃，5％co2条件下孵育培养24h和48h。
皮质酮给药剂量和时间的优化结果：200μmol/l皮质酮，作用48h。
2.3皮质酮损伤及药物保护
待细胞长满孔后，吸出培养液，按照不同分组分别加入不同浓度花椒提取物及其不同活性部位保护，置于37℃、5％co2培养箱培养24h，吸出培养液后每孔分别加入200μmol/l的皮质酮，置于37℃、5％co2培养箱中孵育48h。
2.4mtt法检测细胞活性
取出96孔板，吸出培养液，用pbs轻轻清洗两遍后，每孔加入20μl的5g/l(即0.5％)的mtt溶液。活细胞可以吸收mtt，并在线粒体中将其还原成蓝紫色颗粒。继续培养4h后，吸去培养基，每孔加入150μldmso，置振荡器上混匀10min，以使蓝紫色颗粒充分溶解。在自动酶联免疫分析仪上以波长570nm测各孔吸光度(a)，每组设置5个复孔，同时设5个空白对照孔，只加培养液不加细胞。按如下，公式计算细胞活力。
细胞活力(％)＝[a(损伤)-a(空白)]/[a(正常)-a(空白)]×100
注：a(损伤)：具有细胞、mtt溶液和皮质酮溶液的吸光度
a(空白)：具有培养基和mtt溶液而没有细胞的吸光度
a(正常)：具有细胞、mtt溶液而没有皮质酮溶液的吸光度
2.5统计分析
实验结果用均数±标准方差
3花椒提取物及其不同活性部位对皮质酮损伤pc12细胞保护作用
本研究利用皮质酮诱导的pc12细胞损伤作为细胞模型，研究花椒提取物及其不同活性部位对皮质酮损伤的保护作用。当皮质酮浓度为200μmol·l-1时，作用48h后pc12细胞生长状态差，悬浮细胞明显增多，细胞存活率低于正常细胞。而加入花椒提取物及其不同活性部位后，上述情况得到明显的改善(见表3，表4)。与皮质酮损伤模型组对比，细胞存活率显著上升。体现了花椒提取物及其不同活性部位显著的神经保护作用。
表3花椒95％乙醇冷浸提取物及其活性部位在不同浓度对皮质酮损伤pc12细胞的保护作用
表4花椒95％乙醇回流提取物及其活性部位在不同浓度对皮质酮损伤pc12细胞的保护作用
表5花椒提取物及其活性部位对皮质酮损伤pc12细胞的保护作用评判标准
实施例17
花椒提取物及其活性部位对单胺氧化酶的抑制作用
1.材料与实验动物
1.1药品与试剂
mao活性测试试剂盒：购于南京建成生物工程研究所；帕吉林：sigma公司产品，规格1g/瓶；磷酸钠，蔗糖均购于北京化学试剂公司；吗氯贝胺购自中国药品生物制品鉴定所。
1.2实验仪器
冷冻干燥机，紫外分光光度计(mapada，uv-3100，china)，at201型十万分之一电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)；buchiheatingbothb旋转蒸发仪(德国heidolph公司)；shh-w21-420三用恒温电热水箱(北京精科华瑞仪器有限公司)；ql-901涡旋混匀器(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)，ependrofcentrifuge5810r冷冻离心机(德国eppendorf公司)；组织粉碎机(ika，staufen，germany)。
1.3实验动物
wistar鼠，雄性，体重180～220g，购自北京维通利华实验动物有限公司，许可证：scxk(京)2017-0003。大鼠每笼4只群养，自由摄食饮水，室温23-25℃，湿度50±10％，7:00-19:00光照。动物在新环境中适应7天后开始实验。
2.实验方法
2.1大鼠肝线粒体单胺氧化酶粗酶(mao)的制备
大鼠断头处死，快速取出肝脏，4℃缓冲液(0.2m磷酸钠缓冲液，ph＝7.6)反复冲洗干净；称取10g，剪碎，在冰浴中用组织粉碎机匀浆，以1:20(w/v)加入预冷的0.3m蔗糖溶液，涡旋5min；4℃，3000rpm离心10min；吸取上清液，4℃，10000rpm离心30min；弃去上清液，取沉淀溶于40ml缓冲液中，涡旋使其均匀分散，分装至1ml管中，并使用双缩脲法测定粗酶蛋白含量，-80℃储存备用。
2.2测试样品溶液配制
花椒提取物及其不同活性部位40mg，于10ml容量瓶中超声溶解，定容，从该标准液中分别吸取不同体积的溶液，配制成一系列不同浓度的供试溶液，使其加入酶液和试剂一以及试剂二后花椒提取物及其不同活性部位浓度分别为浓度分别为300.0，200.0，100.0，50.0，25.0μg/ml。
精密称取吗氯贝胺40mg，于10ml容量瓶中超声溶解，定容，从该标准液中分别吸取不同体积的溶液，配制成一系列不同浓度的供试溶液，使其加入酶液和试剂一以及试剂二后花椒酰胺的浓度分别为浓度分别为300.0，200.0，100.0，50.0，25.0μg/ml。
2.3mao-a活性抑制测定方法
首先加入b型抑制剂帕吉林pargyline(500nmol/l)至30ml大鼠肝线粒中，37℃温浴半小时，以抑制mao-b的活性。后加入不同浓度的花椒提取物及其不同活性部位和试剂一(苄氨基质液0.3ml)，试剂二(ph7.6tris缓冲液)3ml，空白管以生理盐水代替酶液，其余相同。以37℃水浴中混匀反应40min，3h后取出各加10％过氯酸0.3ml，环己烷3.0ml，涡旋2min，4℃离心沉淀(2000rpm/min)15min，取上清液于石英比色皿内，以空白调零，测定波长242nm下的吸光度，计算mao-a活性。以只加底物不加抑制剂的对照组的酶活性为100％，计算待测部位对mao-a活性的抑制率
mao-a活性抑制率＝(对照组吸光度-测试组吸光度)/对照组吸光度×100％
2.4数据处理及统计学分析
实验数据采用(平均值±标准偏差)表示。spss16.0数据处理软件进行统计分析。组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。p<0.05时，组间存在显著性差异。
3.实验结果
经紫外分光光度法检测得到花椒提取物及其活性部位在不同浓度下对mao-a活性抑制结果(表6，表7).
表6花椒95％乙醇冷浸提取物及其活性部位在不同浓度时对mao-a活性的抑制率％
表7花椒95％乙醇回流提取物及其活性部位在不同浓度时对mao-a活性的抑制率％
如表格所示，花椒提取物及其不同活性部位在不同浓度对mao-a均有显著的抑制作用，显示出花椒提取物及其活性部位在抗抑郁治疗的突出作用。