氯膦酸二钠脂质体在肿瘤阿霉素化疗辅助治疗方面的用途的制作方法

本发明涉及一种药物的用途，具体涉及氯膦酸二钠脂质体的新用途。

背景技术：

心衰已经日益成为心血管病中最常见、对患者危害最大的疾病，而导致心衰的原因又十分复杂多样，因此心衰已成为心血管病研究领域的重点和难点。而在肿瘤治疗过程中心脏毒副作用也会引起病人的心衰，从而严重影响肿瘤患者的生存质量，更重要的是，毒性的发展可能导致抗肿瘤治疗方案的调整甚至停止，影响患者的生存(binaschim,etal.,2001)。抗肿瘤药物引起的心脏毒性表现复杂多样，常见的表现包括心律失常、心肌缺血、冠状动脉疾病、高血压和心肌功能障碍。常见的引起心脏毒性的抗肿瘤药物主要有两大类：一类是化疗药物，包括蒽环类(多柔比星、表柔比星、柔红霉素等)、烷化剂(环磷酰胺、异环磷酰胺等)、抗细胞微管剂(紫杉醇)、抗代谢类(氟尿嘧啶)等，另一类是靶向药物，如曲妥珠单抗和拉帕替尼等。

阿霉素，属广谱高效抗肿瘤药，是临床上最为常用的一种蒽环类抗肿瘤药物，但其心脏毒性严重。阿霉素对心肌细胞具有独特的亲和力，易在心脏中特异性蓄积，并且在代谢过程中产生活性氧，过量的攻击心肌细胞，引起心肌氧化损伤(kimsy,etal.,2006)。研究表明，可增加心肌细胞内的产生和降低心肌细胞内抗氧化物酶的活性，使心肌细胞处于氧化应激状态，从而引起心肌病和充血性心力衰竭。同时研究显示，阿霉素心脏毒性涉及众多作用因素，如引起细胞凋亡、自噬、氧化应激、直接破坏核酸和蛋白合成、线粒体损伤、血管活性胺释放等(kwokjc,etal.,2003)。因此，多年来关于有效防治心脏毒性的研究一直备受研究者们的关注。

氯膦酸二钠(clodronicacid)为第一代双膦酸盐药，临床上主要用于癌症引起的溶骨性骨转移及骨质疏松症、高钙血症(peterseiler,etal.,1997)。可避免或延迟由癌症引起的溶骨性骨转移、延迟或防止溶骨性骨转移恶变的继续发展，也可以减少溶骨性骨转移导致的病理性骨折变化，并且不影响正常骨矿化作用，防止高钙血症及保持血清钙浓度的正常水平。研究发现，静脉注射含有氯膦酸二钠的脂质体可以选择性地清除体内巨噬细胞(smzeisberger,etal.,2006)。运用其这一特性，可将氯膦酸二钠的脂质体用于一些炎症疾病的治疗。

因此，对于肿瘤患者而言，在用阿霉素进行抗肿瘤治疗时，需要使用心肌保护剂。好的心肌保护剂应该是在不影响阿霉素抗肿瘤的作用下又能保护心肌细胞不受损害。

技术实现要素：

为了解决现有技术中用阿霉素进行抗肿瘤治疗时可诱导心肌细胞凋亡、坏死，心肌纤维化增多，心肌收缩力降低，并最终导致心室重塑和充血性心力衰竭的问题，本发明提供氯膦酸二钠脂质体在制备具有肿瘤阿霉素化疗辅助治疗作用药物中的应用，氯膦酸二钠脂质体性质稳定，进入体内后，降解周期较长，药效持久，具有较好的生物相容性，且已有报道氯膦酸二钠脂质体能抑制肿瘤的生长。因此，氯膦酸二钠脂质体对降低阿霉素引起的心肌毒性作用高效低毒。

为了实现以上目的，本发明的技术方案如下：

本发明提供氯膦酸二钠脂质体在制备具有肿瘤阿霉素化疗辅助治疗作用药物中的应用。

所述具有肿瘤阿霉素化疗辅助治疗作用是指对肿瘤阿霉素化疗具有增效减毒的作用。

所述具有肿瘤阿霉素化疗辅助治疗作用是指氯膦酸二钠脂质体对阿霉素引起的心肌毒性有减弱作用。

所述具有肿瘤阿霉素化疗辅助治疗作用是指氯膦酸二钠脂质体可增加阿霉素抗肿瘤的效果。

优选地，所述氯膦酸二钠脂质体的制备方法为：称取胆固醇、卵磷脂置于容器中，加入氯仿-甲醇混合液，所述氯仿-甲醇混合液中氯仿与甲醇体积比＝2:1，在50-60℃条件下，采用旋转薄膜蒸发法制备厚度为0.1-0.2mm的脂质干膜，以氮气吹干残余溶剂，再加入溶有纯度为98％的氯膦酸二钠的磷酸缓冲液，使脂质膜充分溶胀水化，在超声功率400w的条件下按照超声5秒，停5秒的频率超声5min，随后22000rpm，10℃条件下离心1小时，下层脂质体用ph＝7.2的磷酸缓冲盐溶液重悬即得；所述胆固醇与卵磷脂质量比为胆固醇：卵磷脂＝1:10；所述氯膦酸二钠与卵磷脂摩尔比为氯膦酸二钠：卵磷脂＝1:10。

优选地，上述应用中氯膦酸二钠脂质体治疗方式为局部给药或口服。

本发明通过以下实验证明氯膦酸二钠脂质体减轻阿霉素心脏毒性及增加阿霉素抗肿瘤的效果的作用：

①氯膦酸二钠脂质体预处理c57bl/6小鼠后注射阿霉素，心肌酶谱水平降低；②氯膦酸二钠脂质体预处理c57bl/6小鼠后注射阿霉素，小鼠体重降低趋势变缓；③氯膦酸二钠脂质体预处理过的荷瘤balb/c小鼠后注射阿霉素，心肌酶谱水平降低，肿瘤体积随氯膦酸二钠脂质体的浓度增高而减少。

本发明具有以下优点：

1)本发明制备氯膦酸二钠脂质体工艺成熟可靠，原料来源广泛且质量优良。

2)现有的降低心衰的药会导致诸如骨髓抑制、肝、肾功能异常等，同时该药会降低蒽环类药物的抗癌药效且其价格昂贵。氯膦酸二钠脂质体性质稳定，具有较好的生物相容性，且已有报道氯膦酸二钠能抑制肿瘤的生长。因此，氯膦酸二钠脂质体对降低阿霉素引起的心肌毒性作用高效低毒。

3)氯膦酸二钠脂质体在发挥降低心肌毒性的同时,还可以降低肿瘤细胞的骨转移。

4)氯膦酸二钠脂质体性质稳定进入体内后，降解周期较长，药效持久。

5)将氯膦酸二钠脂质体作为药物，可避免连接配基带来的免疫原性问题，同时大幅度降低制药成本。

6)本发明采用常规给药剂型，技术成熟，生产工艺简单易行。

7)本发明采用常规给药方式，给药方便，无痛苦。

附图说明

图1氯膦酸二钠脂质体减缓小鼠体重降低趋势；

图2氯膦酸二钠脂质体降低心肌酶谱水平；

图3氯膦酸二钠脂质体与阿霉素联用减小乳腺癌小鼠肿瘤体积和质量；

图4氯膦酸二钠脂质体与阿霉素联用降低乳腺癌小鼠心肌酶谱水平；

具体实施方式

通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。

【实施例1】氯膦酸二钠脂质体制备及表征检测

(一)氯膦酸二钠脂质体制备

1.制备方法：

称取胆固醇、卵磷脂和氯膦酸二钠置于容器中，加入氯仿-甲醇混合液，所述氯仿-甲醇混合液中氯仿与甲醇体积比＝2:1，在50-60℃条件下旋转薄膜蒸发法旋转制膜20-50min，制成均匀的脂质干膜；所述脂质干膜厚度为0.1-0.2mm；以氮气吹干残余溶剂，再加入溶有氯膦酸二钠的膦酸缓冲液，使脂质膜充分溶胀水化，在超声功率400w的条件下超声5min，随后22000rpm，10℃条件下离心1小时，下层脂质体用ph＝7.2的磷酸缓冲盐溶液重悬即得；所述胆固醇与卵磷脂质量比为胆固醇：卵磷脂＝1:10；所述氯膦酸二钠与卵磷脂摩尔比为氯膦酸二钠：卵磷脂＝1:10。

上述制备得到的氯膦酸二钠脂质体的粒径为224.8±4.5nm,其包封率＞

55％。

2.处方设计与优化

参照文献和单因素试验预试分析，确定正交实验的因素及水平。以药物包封率为评价指标，采用正交实验进行处方筛选和优化。

(二)氯膦酸二钠脂质体表征

1.形态学观察和粒径大小测定

采用普通光学显微镜和透射电镜磷钨酸负染法观察脂质体。采用激光粒径测量仪测定平均粒径。

2.脂质体包封率测定

1)紫外光谱扫描

将药物、含药脂质体和空白脂质体分别用甲醇-蒸馏水(1:1，v/v)混合液溶解稀释后，于200～500nm扫描，药物和含药脂质体在215nm处有最大吸收，空白脂质体在该波长范围无吸收峰。

2)标准曲线制备

精密称取在60℃干燥至恒重的氯膦酸二钠1mg置10ml容量瓶中，加甲醇少量溶解并稀释至刻度作为对照品储备液(100μg·ml^-1)，准确移取标准溶液0.125、0.25、0.5、0.75、1.0ml于10ml容量瓶中，用甲醇-蒸馏水(1:1,v/v)混合液稀释至刻度。以浓度c(μg/ml)为横坐标,吸光度a为纵坐标,绘制标准曲线。

3)包封率测定

葡聚糖凝胶柱色谱。柱层析条件：sephadexg-50柱(2.6cm×30cm)，重蒸馏水洗脱，流速为0.5ml·min^-1，室温下进行。先测得脂质体总药量(w总)，再用葡聚糖凝胶层析法分离含药脂质体与游离药物并测定游离药物的量(w游)，按照中国药典2000版的脂质体包封率计算公式计算，即：包封率﹦(w总-w游)/w总×100％。w总：总药物的量，w游：未包入脂质体的游离药物的量。具体简述如下：精密量取脂质体5ml，用重蒸馏水稀释至25ml,后将其置50ml容量瓶用甲醇稀释至刻度，摇匀待测。再取氯膦酸二钠脂质体5ml上柱，重蒸馏水洗脱，以215nm监测并收集游离氯膦酸二钠洗脱峰，用重蒸馏水稀释至25ml,再将其置50ml容量瓶用甲醇稀释至刻度并测定游离药物的量，计算包封率。

4)回收率考察

配置一系列不同浓度的氯膦酸二钠标准溶液，分别移取5ml上柱，按照上述3)的层析条件进行柱层析，收集游离药物组分，稀释，定容，于215nm处测吸收值，计算柱回收率。配置一系列不同浓度的氯膦酸二钠标准溶液，分别与空白脂质体混合，得标准混合液，分别移取5ml上柱，相同条件柱层析，测得游离药物的组分吸收值，计算柱加样回收率。

5)稳定性考察

将3批样品分别置室温的自然条件下和冰箱内℃放置1、2、3和6月考察其稳定性，具体考察指标如下：①外观：脂质体溶液属于高度分散的热力学不稳定体系，贮存过程中粒子有自发聚集和融合等倾向，导致脂质体粒径分布改变，长期放置可发生聚集、絮凝和分层沉淀。实验中根据样品外观和显微镜下粒子观察结果，对其评价。脂质体外观不分层，无沉淀，记为(-)；不分层，有少许絮凝振摇后可复原，记为(±)分层，有不可逆沉淀记为(+)度；②ph值：脂质体在储存过程中，磷脂氧化水解产生游离的脂肪酸等使ph值下降，所以有必要对脂质体的ph值进行监测，以反映脂质体的稳定包封率；③包封率是评价脂质体质量的指标之一，脂质体在储存过程中，受药物性质和膜稳定性等的影响，易渗漏，因此脂质体的包封率可以反映其稳定性。

(三)结果

1.处方设计与优化

参照文献和单因素试验预试分析结果，确定胆固醇：卵磷脂(质量比)、氯膦酸二钠:脂类(摩尔比)以及磷酸缓冲液ph值作为3个考察因素，并确定各因素的水平范围，如表1，以药物包封率为评价指标，按照正交实验表设计9个处方制备脂质体。包封率的影响因素大小为a>b>c,各因素的最优搭配为a3b1c3，即胆固醇：卵磷脂(质量比)为1:10，氯膦酸二钠：脂类(摩尔比)为1:10，pbs的ph值为7.2。因此，初步筛选出的组方为：

⑴胆固醇20mg；

⑵卵磷脂200mg；

⑶氯膦酸二钠2.5g；

⑷ph值为7.2的磷酸盐缓冲液20ml，如表2。

表1、试验因素与水平

2.氯膦酸二钠脂质体表征

1)形态学观察和粒径大小测定

由透射电镜照片可见，氯膦酸二钠脂质体混悬液适当稀释后,用质量分数为1％的磷钨酸负染,于透射电镜下观察形态,结果可见脂质体外观圆整,多为球形及类球形粒子,大小较均一。粒径分布范围窄且符合正态分布规律,粒径为224.8±4.5nm。

2)紫外光谱扫描，标准曲线制备，回收率考察

药物和含药脂质体在215nm处有最大吸收，空白脂质体在该波长范围无吸收峰。以浓度c(μg/ml)为横坐标,吸光度a为纵坐标,绘制标准曲线,得λmax＝372nm波长处的吸光度a与药物浓度c(μg·ml^-1)的回归方程为：a＝0.0456c+0.0066(r＝0.9991)，线形范围为：1.0～5.0μg·ml-1。柱回收率，其平均值为100.35％，rsd为1.24％。柱加样回收率，其平均值为99.66％，rsd为0.86％，如表3。

表2、正交设计与结果分析

表3、氯膦酸二钠脂质体回收率测定结果(n＝5)

3)包封率测定

将制备的氯膦酸二钠脂质体样品上sephadexg-50柱分离，收集游离氯膦酸二钠洗脱峰，并测定药物的量，由包封率的计算公式得到脂质体平均包封率为55.73％(n＝4)。

4)稳定性考察

脂质体在充氮气条件下分别于4℃和室温放置1、2、3和6个月均未见分层凝聚等现象，仍为均匀混悬液，且ph值和包封率无显著变化，提示其稳定性良好，如表4。

表4、氯膦酸二钠脂质体稳定性考察结果(n＝3)

注：脂质体外观不分层,无沉淀,记为(-)；不分层,有少许絮凝振摇后可复原,记为(±)分层,有不可逆沉淀记为(+)度。

(四)结论

上述实验结果表明，氯膦酸二钠脂质体的制备方法简单易行，且成功率较高，性质稳定。

【实施例2】氯膦酸二钠脂质体减弱阿霉素心肌毒性的作用研究

(一)动物分组及处理

6-8周c57bl/6雄性小鼠每组10只，分为正常对照组、模型对照组、氯膦酸二钠脂质体处理组。(1)正常对照组连续7天每天腹腔注射等量生理盐水；(2)模型对照组提前一天腹腔注射等量生理盐水，第2天腹腔注射dox(阿霉素)20mg/kg；(3)氯膦酸二钠脂质体低剂量实验组第一天腹腔注射5μl/g氯膦酸二钠脂质体，第2天腹腔注射dox(阿霉素)20mg/kg；(4)氯膦酸二钠脂质体高剂量实验组第一天腹腔注射10μl/g氯膦酸二钠脂质体，第2天腹腔注射dox(阿霉素)20mg/kg；5天后处死小鼠，取血、心脏、肝、肾待检测。

(二)实验检测

1.每天检测小鼠体重，观察小鼠状态并记录；

2.心肌酶ck、ck-mb、ldh、ast浓度检测

收集小鼠血液，按照商业试剂盒的操作说明检测血清中心肌酶谱浓度(试剂盒由南京建成生物工程研究所提供)；

(三)结果

1.体重变化

氯膦酸二钠脂质体预处理阿霉素心肌毒性模型小鼠5天的体重变化曲线，如图1可见，随着时间的增加，氯膦酸二钠脂质体预处理的小鼠与未用氯膦酸二钠脂质体处理的模型组的小鼠相比体重降低趋势缓慢。

2.心肌酶变化

如图2可见，随着时间的增加，阿霉素处理的心肌毒性模型组血清中心肌酶ck、ck-mb、ldh、ast浓度明显高于正常对照组，而用氯膦酸二钠脂质体处理过的心肌毒性小鼠心肌酶浓度比阿霉素处理的心肌毒性模型组显著下降。

(四)结论

上述实验结果表明，氯膦酸二钠脂质体可通过抑制心肌细胞的凋亡从而达到减弱阿霉素心肌毒性的作用。

综合以上实验的结果、结论，可以确信，氯膦酸二钠脂质体是减弱阿霉素心肌毒性的有效药物。

【实施例3】氯膦酸二钠脂质体在阿霉素治疗乳腺癌中的应用

(一)动物分组及处理

6-8周balb/c小鼠乳腺脂肪垫下接种4t1乳腺癌细胞(1×10⁶个/只)，待肿瘤体积达100mm³时记为第0天，随机分组，每组10只，分为对照组、模型对照组、氯膦酸二钠脂质体处理组。(1)正常对照组每天腹腔注射等量生理盐水；(2)模型对照组第1天腹腔注射等量生理盐水，之后每周注射一次生理盐水，第2天腹腔注射dox(阿霉素)4mg/kg，之后每周注射一次阿霉素，连续五周；(3)氯膦酸二钠脂质体低剂量实验组第1天腹腔注射5μl/g氯膦酸二钠脂质体，之后每周注射一次等量氯膦酸二钠脂质体，第2天腹腔注射dox(阿霉素)4mg/kg，之后每周注射一次阿霉素，连续五周；(4)氯膦酸二钠脂质体高剂量实验组第一天腹腔注射10μl/g氯膦酸二钠脂质体，之后每周注射一次等量氯膦酸二钠脂质体，第2天腹腔注射dox(阿霉素)4mg/kg，之后每周注射一次阿霉素，连续五周；每天检测瘤体积，五周后处死小鼠，取血、心脏、肝、肾待检测，取瘤称重。

(二)实验检测

1.观察并记录小鼠瘤体积、质量；

2.心肌酶ck、ck-mb、ldh、ast浓度检测

收集小鼠血液，按照商业试剂盒的操作说明检测血清中心肌酶谱浓度(试剂盒由南京建成生物工程研究所提供)；

(三)结果

1.如图3可见，正常对照组的荷瘤小鼠肿瘤体积和质量随时间逐渐增加，模型对照组肿瘤体积相对正常组有所减少，而用氯膦酸二钠脂质体预处理过的荷瘤小鼠的肿瘤体积随氯膦酸二钠脂质体的浓度增高而减少。

2.如图4可见，随着时间的增加，阿霉素处理的心肌毒性模型组血清中心肌酶ck、ck-mb、ldh、ast浓度明显高于正常对照组，而用氯膦酸二钠脂质体处理过的心肌毒性小鼠心肌酶浓度比阿霉素处理的心肌毒性模型组显著下降。

(四)结论

上述实验结果表明，氯膦酸二钠脂质体可增加阿霉素抗肿瘤的效果，同时可以通过抑制心肌细胞的凋亡从而达到减弱阿霉素心肌毒性的作用。

综合以上实验的结果、结论，可以确信，氯膦酸二钠脂质体是阿霉素增效减毒的有效药物。

应当理解的是，本说明书未详细阐述的部分均属于现有技术。

应当理解的是，上述针对较佳实施例的描述较为详细，并不能因此而认为是对本发明专利保护范围的限制，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明权利要求所保护的范围情况下，还可以做出替换或变形，均落入本发明的保护范围之内，本发明的请求保护范围应以所附权利要求为准。