专利名称：核苷膦酸类化合物的脂质体和脂质复合物制剂的制备方法
技术领域：
本发明涉及的是一种用于药物的制剂的制备方法，特别是一种核苷膦酸类化合物的脂质体和脂质复合物制剂的制备方法。
背景技术：
病毒感染严重威胁着人类健康，迫切需要有效的药物治疗。以乙型肝炎为例，我国的乙肝病毒携带者有超过一亿人，其中慢性乙型肝炎患者约3000万，目前的治疗用药中，α-干扰素的疗程较长，价格昂贵，而且只有30~50％的响应率，拉米呋定为核苷类似物，通过抑制逆转录酶以及DNA聚合酶的作用来阻断病毒繁殖，效果明显，但有一定的副作用，而且容易引发病毒DNA聚合酶突变而出现抗药性，停药后反弹更是严重。核苷膦酸类化合物，对逆转录酶以及DNA聚合酶有广谱的抑制性，是一类很有前途的抗病毒化合物。经对现有技术文献的检索发现，美国Gilead公司在此领域已经获得一系列专利(USP 5,935,946Nucleotide analog composition and synthesis method核苷类似物的处方和合成途径；USP 5,733,788 PMPA preparation替诺福韦的制备)。但其中某些化合物生物利用度低，特别是病灶细胞摄取率低，但代谢迅速，用药剂量较大，毒性相应变大；已上市的阿德福韦酯，因肾脏毒性较大，导致患者往往不能完成治疗。将脂质体和脂质复合物技术应用于核苷膦酸类化合物尚未见专利和文献报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种核苷膦酸类化合物的脂质体和脂质复合物制剂的制备方法。使其能够提高药物的包封率和稳定性，从而提高生产效率，降低生产成本，改善制剂在贮存中的稳定性。
本发明是通过以下技术方案实现的，本发明以核苷膦酸类化合物作为活性成分，由核苷膦酸类化合物和脂质组成，其中核苷膦酸类化合物的摩尔百分比为0.99~50.00％，脂质的摩尔百分比为50.00~99.01％，通过以下任意一种方法制备得到pH梯度法、钙离子梯度法、电性包裹法。
本发明可以通过以下方法来实现pH梯度法先以中性或弱碱性水溶液制备脂质体或脂质复合物，然后加酸降低外水相pH值，内外水相间形成pH梯度，使核苷膦酸类化合物向脂质体或脂质复合物的内水相迁移，核苷膦酸类化合物可以在制备脂质体时加入，也可以在形成pH梯度后加入，得核苷膦酸类化合物脂质体或脂质复合物。。
钙离子梯度法先制备空白脂质体或空白脂质复合物，其内外水相均为含有钙离子的水溶液，然后降低外水相钙离子浓度，内外水相间形成钙离子梯度后，加入核苷膦酸类化合物，得核苷膦酸类化合物脂质体或脂质复合物。
电性包裹法在制备脂质体或脂质复合物时，在脂质处方中使用一种或几种阳离子脂质或阳离子两亲性物质，单独或连同其它脂质形成脂质膜。
本发明所说的核苷膦酸类化合物是如下开链结构 其中，B为核苷碱基或修饰的碱基，包括腺嘌呤，胞嘧啶，胸腺嘧啶，鸟嘌呤以及它们的修饰衍生物，还包括以上结构的膦酸酯类化合物。
R为H，CH3，CF3，CH2OH，CH2F；X为O，S。
本发明所说的脂质所述的的脂质为各种天然或人工合成的阳离子磷脂、阴离子磷脂、中性磷脂、以上磷脂的聚乙二醇修饰修饰产物、胆固醇和其混合物。
本发明所说的脂质体为药剂学中常规采用的术语，其特征是，其结构为脂质双分子层构成的囊泡结构，包括单层脂质体、多层脂质体、多室脂质体，其粒径在20nm到50μm之间。
本发明所说的脂质复合物为药剂学中常规采用的术语，其特征是，其中包含的核苷膦酸类化合物与脂质间通过非共价键作用结合，包括配位键、氢键、亲水疏水作用、电荷相互作用或物理包裹。复合物的粒径在20nm到50μm之间。
本发明中所说的磷脂具有两亲性，可以形成双分子层囊泡结构装载药物，或直接形成脂质颗粒装载药物。
本发明所形成的脂质体和脂质复合物均包含脂质膜，其中包含0~100％天然或人工合成的阳离子两亲性化合物。
部分核苷膦酸类化合物带负电，本发明中所说的阳离子磷脂和阳离子两亲性化合物带正电荷，可以和带负电荷的核苷膦酸类化合物结合，通过两者间的静电作用形成复合物，大大提高载药率。
本发明中所说的磷脂的聚乙二醇修饰产物可以在脂质体或脂质复合物表面形成一个亲水性的高分子层，有助于保持其稳定性，降低了血浆蛋白与其作用，使其在血浆中的循环时间大大延长，从而维持较高的、平稳的血药浓度，在抗病毒治疗中，发挥持续的抗病毒作用防止病毒复制，抑制耐药变异株的产生。
本发明中所说的胆固醇具有调节药物从脂质复合物或脂质体中释放速度的作用。
应当说明的是，许多脂质都适合用于本发明，除以上脂质外，药学领域内的技术人员已知的任何成囊泡脂质都可以考虑。
本发明中所说的胆固醇具有调节药物从脂质复合物或脂质体中释放速度的作用。
本发明所述的阳离子脂质或阳离子两亲性物质选自1，2-二油酰氧丙基-N，N，N-三甲基溴化铵(DOTAP)、[1-(2，3-二油酰氧)丙基]-N，N，N-氯化三甲铵(DOTMA)、溴化双甲基双十八烷基胺(DDAB)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、3β-[N-(N’，N’-二甲氨基乙基)-氨甲酰]胆固醇(DC-cholestrol)或以上物质的混合物。
本发明的有益效果表现在以下方面核苷膦酸类化合物是水溶性成分，通常的脂质体和脂质复合物的制备方法如薄膜分散法等对此类药物的包封率很低，一般在10~20％以下，通过本发明所述的方法包封率有明显改善。
与普通的薄膜分散法相比，采用pH梯度法、钙离子梯度法制备的核苷膦酸类化合物脂质体或脂质复合物，药物包封率为普通的薄膜分散法的2~4倍，采用电性包裹法制备的核苷膦酸类化合物脂质体或脂质复合物，药物包封率为普通的薄膜分散法的3~10倍。
使用电性包裹法还能够提高制剂的稳定性，使制剂的贮存有效期大大延长。
具体实施例方式
实施例1将含164mg二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)和54mg胆固醇的氯仿溶液加到茄形瓶中，水浴，旋转蒸发除去氯仿，使其成膜后，继续抽真空1小时以除去残余氯仿，向茄形瓶中加入HEPES溶液(pH＝7)10ml，振摇，室温放置2h，加入盐酸溶液调节外水相至pH＝4，加入10mg替诺福韦(PMPA)，摇匀，保温2小时，形成均匀乳白的脂质体的混悬液。
本实施例中核苷膦酸类化合物的包封率为23％。
实施例2将含277mg二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、52mg二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)和108mg胆固醇的氯仿溶液加到茄形瓶中，水浴，旋转蒸发除去氯仿，使其成膜后，继续抽真空1小时以除去残余氯仿，向茄形瓶中加入HEPES溶液(pH＝7)10ml，振摇，室温放置2h，加入盐酸溶液调节外水相至pH＝4，加入10mg替诺福韦，摇匀，保温2小时，形成均匀乳白的脂质体的混悬液。
本实施例中核苷膦酸类化合物的包封率为35％。
实施例3将含652mg二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、337mgl-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(POPC)和344mg胆固醇的氯仿溶液加到茄形瓶中，水浴，旋转蒸发除去氯仿，使其成膜后，继续抽真空1小时以除去残余氯仿，向茄形瓶中加入HEPES溶液(pH＝7)10ml，振摇，室温放置2h，加入盐酸溶液调节外水相至pH＝3，加入10mg阿德福韦(PMEA)，摇匀，保温2小时，形成均匀乳白的脂质体的混悬液。
本实施例中核苷膦酸类化合物的包封率为54％。
实施例4将含174mg二月桂酰磷脂酰胆碱(DLPC)、57mg胆固醇的氯仿溶液加到茄形瓶中，水浴，旋转蒸发除去氯仿，使其成膜后，继续抽真空1小时以除去残余氯仿，向茄形瓶中加入HEPES氯化钙缓冲液(pH＝7)10ml，振摇，室温放置2h，HEPES缓冲液调节钙离子浓度，形成钙离子梯度，加入10mg阿德福韦，形成均匀乳白的脂质体的混悬液。
本实施例中核苷膦酸类化合物的包封率为28％。
实施例5将含399mg卵磷脂(EPC)、289mg甲氧基聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE-PEG2000)、163mg胆固醇的氯仿溶液加到茄形瓶中，水浴，旋转蒸发除去氯仿，使其成膜后，继续抽真空1小时以除去残余氯仿，向茄形瓶中加入HEPES氯化钙缓冲液(pH＝7)10ml，振摇，室温放置2h，HEPES缓冲液调节钙离子浓度，形成钙离子梯度，加入10mg替诺福韦，形成均匀乳白的脂质体的混悬液。
本实施例中核苷膦酸类化合物的包封率为43％。
实施例6将含1054mg二豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、401mg胆固醇的氯仿溶液加到茄形瓶中，水浴，旋转蒸发除去氯仿，使其成膜后，继续抽真空1小时以除去残余氯仿，向茄形瓶中加入HEPES氯化钙缓冲液(pH＝7)10ml，振摇，室温放置2h，HEPES缓冲液调节钙离子浓度，形成钙离子梯度，加入10mg阿德福韦，形成均匀乳白的脂质体的混悬液。
本实施例中核苷膦酸类化合物的包封率为53％。
实施例7将含54mg十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)的丙酮溶液加到茄形瓶中，水浴，旋转蒸发除去丙酮，使其成膜后，继续抽真空1小时以除去残余丙酮，向茄形瓶中加入1mg/ml阿德福韦HEPES缓冲液(pH＝7)10ml，振摇，-70℃冷冻后，室温复融，反复10次后，过高压乳匀机10次，形成半透明的脂质体的混悬液。
本实施例中核苷膦酸类化合物的包封率为63％。
实施例8将含399mg豆磷脂(SPC)、71mg[1-(2，3-二油酰氧)丙基]-N，N，N-氯化三甲铵(DOTMA)、163mg胆固醇(cholesterol)的氯仿溶液加到茄形瓶中，水浴，旋转蒸发除去氯仿，使其成膜后，继续抽真空1小时以除去残余氯仿，向茄形瓶中加入1mg/ml替诺福韦HEPES缓冲液(pH＝7)10ml，振摇，-70℃冷冻后，室温复融，反复10次后，过高压乳匀机10次，形成半透明的脂质体的混悬液。
本实施例中核苷膦酸类化合物的包封率为85％。
实施例9将含514mg二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、244mg1，2-二油酰氧丙基-N，N，N-三甲基溴化铵(DOTAP)、271mg胆固醇(cholesterol)的氯仿溶液加到茄形瓶中，水浴，旋转蒸发除去氯仿，使其成膜后，继续抽真空1小时以除去残余氯仿，向茄形瓶中加入1mg/ml替诺福韦HEPES缓冲液(pH＝7)10ml，振摇，-70℃冷冻后，室温复融，反复10次后，过高压乳匀机10次，形成半透明的脂质体的混悬液。
本实施例中核苷膦酸类化合物的包封率为90％。
权利要求
1.一种核苷膦酸类化合物脂质体和脂质复合物制剂的制备方法，其特征在于，含有核苷膦酸类化合物作为活性成分，由核苷膦酸类化合物和脂质组成，其中核苷膦酸类化合物的摩尔百分比为0.99～50.00％，脂质的摩尔百分比为50.00～99.01％，利用pH梯度法为先以中性或弱碱性水溶液制备脂质体或脂质复合物，然后加酸降低外水相pH值，内外水相间形成pH梯度，使核苷膦酸类化合物向脂质体或脂质复合物的内水相迁移，核苷膦酸类化合物在制备脂质体时加入，或者在形成pH梯度后加入，得核苷膦酸类化合物脂质体或脂质复合物。
2.一种核苷膦酸类化合物脂质体和脂质复合物制剂的制备方法，其特征在于，含有核苷膦酸类化合物作为活性成分，由核苷膦酸类化合物和脂质组成，其中核苷膦酸类化合物的摩尔百分比为0.99～50.00％，脂质的摩尔百分比为50.00～99.01％，利用钙离子梯度法为先制备空白脂质体或空白脂质复合物，其内外水相均为含有钙离子的水溶液，然后降低外水相钙离子浓度，内外水相间形成钙离子梯度后，加入核苷膦酸类化合物，得核苷膦酸类化合物脂质体或脂质复合物。
3.一种核苷膦酸类化合物脂质体和脂质复合物制剂的制备方法，其特征在于，含有核苷膦酸类化合物作为活性成分，由核苷膦酸类化合物和脂质组成，其中核苷膦酸类化合物的摩尔百分比为0.99～50.00％，脂质的摩尔百分比为50.00～99.01％，利用电性包裹法为在制备脂质体或脂质复合物时，在脂质处方中使用一种或几种阳离子脂质或阳离子两亲性物质，单独或连同其它脂质形成脂质膜。
4.根据权利要求3的核苷膦酸类化合物脂质体和脂质复合物制剂的制备方法，其特征是，所述的阳离子脂质或阳离子两亲性物质选自1，2-二油酰氧丙基-N，N，N-三甲基溴化铵(DOTAP)、[1-(2，3-二油酰氧)丙基]-N，N，N-氯化三甲铵(DOTMA)、溴化双甲基双十八烷基胺(DDAB)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、3β-[N-(N′，N′-二甲氨基乙基)-氨甲酰]胆固醇(DC-cholestrol)或以上物质的混合物。
全文摘要
一种核苷膦酸类化合物的脂质体和脂质复合物制剂的制备方法。本发明以核苷膦酸类化合物作为活性成分，由核苷膦酸类化合物和脂质组成，其中核苷膦酸类化合物的摩尔百分比为0.99~50.00％，脂质的摩尔百分比为50.00~99.01％，通过以下任意一种方法制备得到pH梯度法、钙离子梯度法、电性包裹法。本发明包封率有明显改善。与普通的薄膜分散法相比，采用pH梯度法、钙离子梯度法制备的核苷膦酸类化合物脂质体或脂质复合物，药物包封率为普通的薄膜分散法的2~4倍，采用电性包裹法制备的核苷膦酸类化合物脂质体或脂质复合物，药物包封率为普通的薄膜分散法的3~10倍。使用电性包裹法还能够提高制剂的稳定性，使制剂的贮存有效期大大延长。
文档编号A61P31/12GK1679607SQ20051002378
公开日2005年10月12日 申请日期2005年2月3日 优先权日2005年2月3日
发明者徐宇虹, 张健存, 章丽辉, 陈剑 申请人:上海交通大学