光触发病毒疗法的远端控制的制作方法

相关申请案的交叉引用

本案主张于2016年11月4日提交的美国临时申请案62/417,946的权益，其内容通过引用整体并入本文中。

背景技术：

在癌症的创新性治疗中，病毒疗法是一种具潜能的癌症治疗剂，目前正在临床试验中评估几个不同病毒科的病毒(belletal.,cellhostmicrobe,2014；russelletal.,nat.biotechnol.,2012；miestetal.,nat.rev.microbiol.,2014)。在大多数病毒疗法的临床试验中，病人通过肿瘤内注射来进行病毒疗法(miestetal.,nat.rev.microbiol.,2014)。于癌症治疗中，强化病毒的全身性传递仍为有效病毒疗法的一个障碍(ledford,nature,2015；belletal.,cellhostmicrobe,2014；russelletal.,nat.biotechnol.,2012；miestetal.,nat.rev.microbiol.,2014；kottermanetal.,nat.rev.genet.,2014)。因此，实现有效且准确的全身性传递将大幅扩展病毒疗法的机会。

涉及腺相关病毒(adeno-associatedvirus,aav)介导的基因递送的临床试验已使许多单基因疾病的治疗(kottermanetal.,nat.rev.genet.,2014；naldini,nature,2015)及组织工程的发展(yooetal.,adv.healthc.mater.,2016)能够成功。定向定位降低了治疗剂量，因此也降低了aav导向的免疫反应、异位表达及导致基因突变的致癌基因活化的风险。而且，设计aav壳体(lisowskietal.,nature,2014)及从aav基因体中消除cpg基序(faustetal.,j.clin.invest.,2013)的改进方法已借由使其避免与因人类自然暴露于aav所产生的中和抗体结合，进而降低了aav的免疫原性。有趣的是，aav壳体被设计以表达光依赖性因子基序，该光依赖性因子基序结合于经核定位序列标记的光可切换式蛋白质，当在暴露于光时，该aav壳体显示显著增加的基因递送效率(gomezetal.,acsnano.,2016)。但是，准确并特定地递送合适剂量的遗传物质一直是主要的挑战。对于全身性的通过身体血液循环给药病毒，肝脏通常为预设的目的地(kottermanetal.,nat.rev.genet.,2014)，且当其它器官/组织为预期靶标时则代表屏障。

技术实现要素：

本公开至少部分地基于磁性病毒粒子的发展，举例而言，带有光敏剂蛋白质(如：killerred蛋白质)的铁化病毒粒子，其成功地定位于被施加磁场的部位。当用于光触发病毒疗法时，此种铁化aav2粒子成功地降低肿瘤的生长。

据此，本公开的一方面特征为磁性病毒粒子(如：铁化病毒粒子)，包含与磁氧化纳米粒子(如：氧化铁纳米粒子)缀合的病毒粒子。该磁氧化粒子可具有从1至100nm的直径范围。于一些情况下，该磁氧化粒子可具有5nm的平均直径。于一些具体实施例中，该病毒粒子是腺相关病毒(aav)粒子，举例而言，血清型1至9中的任一型(如：aav2)粒子、慢病毒粒子或腺病毒粒子。于一些具体实施例中，本文所述的磁性病毒粒子中的任一者可带有例如killerred蛋白质的光敏剂蛋白质，其可包含seqidno：1的氨基酸序列。

另一方面，本公开提供一种治疗肿瘤的方法，包含：(i)对有需要的受试者给药有效量的本文所述的磁性病毒粒子，其中，该磁性病毒粒子带有光敏剂，例如killerred蛋白质；(ii)对受试者的肿瘤部位施加磁场，以诱导磁性病毒粒子定位于肿瘤部位；以及(iii)于步骤(ii)之后，对受试者的肿瘤部位执行光照射。于一些具体实施例中，步骤(iii)以波长540至580nm(如：561nm)执行。或者或是此外，该肿瘤部位位于肺、肾、心脏、膀胱、皮肤、乳房或肠道。

再一方面，本公开提供一种制备磁性病毒粒子的方法，例如本文所述的铁化病毒粒子，其中，该方法包含在一种或多种交联剂的存在下，将磁氧化纳米粒子(如：氧化铁纳米粒子)化学缀合于病毒粒子。于一些具体实施例中，该化学缀合涉及乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc)介导的缀合。

于一些实施例中，本文所述的制备方法包含：(i)在羧基活化剂的存在下，将诸如氧化铁纳米粒子的磁氧化纳米粒子与羧酸混合，以形成混合物；(ii)将能够使羧基转化成胺反应性nhs酯的试剂置入该混合物中，以形成经该胺反应性nhs酯修饰的磁氧化纳米粒子；以及(iii)将该经修饰的磁氧化纳米粒子与病毒粒子培养，以形成该磁性病毒粒子。该羧基活化剂可为碳二亚胺化合物，如：edc。或者或是此外，在步骤(ii)的试剂为n-羟基磺基琥珀酰亚胺(sulfo-nhs)。

另外，本公开的范围内还包括(i)用于治疗肿瘤的医药组合物，其中该医药组合物包含本文所述的任一磁性病毒粒子及医药上可接受的载体；以及(ii)该磁性病毒粒子用于制备治疗肿瘤的药剂的用途。

本发明的一或多个具体实施例的细节阐述于下。本发明的其它特征或优点将从下述附图、具体实施例，以及所附权利要求书的详细描述中为显而易见。

附图说明

图1包括显示远端控制“铁化”病毒的示意图。图1a：借由单次尾静脉注射进行微病毒疗法的远端定向铁化病毒的概念。当铁化aav2经磁场强制定向递送时，迅速累积于标的肿瘤部位。此处，killerred由受aav2-killerred感染的肿瘤细胞表达。光启动了病毒疗法。对killerred蛋白质的照射产生ros及随后的细胞内损伤，促使细胞死亡。图1b：利用涉及edc/sulfo-nhs的两阶段缀合方法，将铁化aav2与氧化铁纳米粒子缀合的例示性方法的示意图。照片显示铁化aav2的透明黄色溶液。图1c：具有羧酸的氧化铁纳米粒子的tem图像。比例尺＝50nm。图1d：以纳米粒子/edc的摩尔比(1/20)所制备的铁化aav2展现氧化铁纳米粒子与病毒相关联的tem图像。比例尺＝200nm。图1e：借由流式细胞术分析经不同摩尔比的纳米粒子/edc与铁化aav2转导6天后gfp-表达细胞的百分比(^#,p>0.25；^##,p<0.005；基于双尾t检定，假设变异数不相等)。数据显示重复六次测量的平均值±s.d.。图1f：hek293细胞暴露于不同摩尔比的纳米粒子/edc的铁化aav2后的存活率。细胞存活率由与未暴露的细胞相比较，处理24小时后所剩余的活细胞的百分比而获得。细胞数目借由标准mts分析法测定(*,p>0.2；**,p>0.5；基于双尾t检定，假设变异数不相等)。数据显示重复六次测量的平均值±s.d.。

图2包括显示微转导的远端控制“铁化”病毒的照片及图表。图2a：于磁场暴露期间(5、10或30分钟)，aav2分布的代表性共焦图像，借由使用抗aav2抗体及缀合至alexa488的二级抗体进行免疫染色。图2b：将磁化30分钟且未修饰的aav2作为对照组。比例尺＝1000μm。经铁化aav2(图2c及图2d)或aav2(图2e)感染的gfp表达细胞暴露于磁场(直径：1,500μm)培养30分钟，并随后6天转导的荧光强度的概况曲线。借由共聚焦显微镜观察经铁化aav2或aav2感染的gfp阳性细胞的图像。借由共聚焦显微镜分析来自图像的所有荧光强度。使用dapi染色细胞以标记细胞核(调整为选择红色荧光)。数据显示重复六次测量的平均值。比例尺＝1,000μm。

图3包括显示活体外光触发病毒疗法的照片及图表。图3a：paav-killerred的序列图。aav2-killerred借由paav-killerred的表达质体及封装质体(phelper及paav-rc2)而制备。图3b至图3d：经killerred蛋白质照射后，经铁化aav2(图3b及图3c)或aav2(图3d)感染的细胞的死亡及细胞核分布的荧光强度的概况。照射前，以铁化aav2或aav2感染6天后，使用磁场(直径：1,500μm)培养细胞30分钟。照射20分钟后，利用live/可固定的远红死亡细胞染色试剂盒观察受感染的细胞。图3b至图3d的右图：显示红色荧光(细胞死亡)的代表性共聚焦图像。此外，该经处理的细胞经由dapi染色以显示细胞核，且共聚焦图像与红色荧光融合。所有图像的荧光强度借由共聚焦显微镜测定。数据显示重复六次测量的平均值。比例尺＝1,000μm。

图4包括显示活体内全身性远端控制病毒疗法的图表及照片。图4a：治疗疗程评估远端控制的传递，使用不同条件进行光触发病毒疗法。图4b：于磁化(m)及/或光照射(l)下，借由尾静脉注射经不同病毒处理的egfr-tki抗性h1975(egfr^l858r/t790m)异种移植肿瘤的肿瘤生长。肿瘤的尺寸在所述日期借由测径器测量(*,p<0.015；**,p<0.001；基于双尾t检定，假设变异数不相等)。数据显示重复六次测量的平均值±s.e.m.。图4c至图4f：于第15天的不同治疗后，每组(n＝6)小鼠的肿瘤切片的代表性图像，该肿瘤切片借由苏木素及伊红(h&e)(图4c)、终端脱氧核苷酸转移酶dutp切口末端标记(tunel)分析(图4d)、dapi(图4e)以及普鲁士蓝(图4f)染色。比例尺＝500μm。图4g：在第0天、第2天、第7天及第14天，当铁化aav2-killerred给药至无胸腺balb/c裸鼠后，从血液获得的血清中执行谷氨酸草酰乙酸转胺酶(got)、谷氨酸丙酮酸转胺酶(gpt)、总胆红素(tbil)及肌酐(cre)的生化分析。数据显示重复三次测量的平均值±s.d.。图4h：小鼠经过多种治疗后的体重。于所述日期测量小鼠的体重，对应于暴露及不暴露于m或l的情况下，借由尾静脉注射多种制剂的治疗。结果显示重复六次测量的平均值±s.d.。图4i：在利用aav2编码的荧光素酶作为检测信号并进行尾静脉注射不同制剂后，在第14天拍摄小鼠的代表性ivis图像。图4j：来自于第14天通过静脉注射以进行多种治疗的小鼠的器官的代表性ivis图像。

图5包括显示于磁场下经定位的病毒转导的照片。图5a至图5b：显示借由共聚焦显微镜观察，受铁化aav2(图5a)或aav2(图5b)感染的killerred阳性细胞的图像。细胞借由dapi染色以标记细胞核(蓝色荧光)。比例尺＝1,000μm。

图6包括显示小鼠经由不同治疗后，肿瘤生长的照片。经不同治疗后，于第15天切除h1975肿瘤的h1975异种移植肿瘤的代表性照片。比例尺＝1cm。

图7是显示活体内监测生物荧光活性水平的照片。在尾静脉注射不同制剂后，并利用aav2-荧光素酶作为检测信号，于第7天拍摄的小鼠的代表性ivis图像。

图8包括显示凝胶电泳及paav-killerred构建的照片。质体paav-killerred由pkillerred-dmito及paav-mcs所构建。killerred片段(0.71kb)利用聚合酶链式反应(pcr)及方法章节中所述的引子序列，而被添加至killerred序列中的ecori及sall位点。

图9是显示铁化aav2混合溶液的例示性纯化及溶剂交换过程的示意图。铁化aav2的合成是依据图1b中的化学缀合而制备。缀合反应后，使用以pbs溶液为交换溶剂的粒径脱盐管柱(截留分子量：100k)，以纯化铁化aav2的黄色混合溶液。

图10包括显示确定相对的病毒效价的图。aav-killerreddna借由如方法章节中所述的引子序列以进行反转录pcr(rt-pcr)而测定。借由琼脂糖凝胶电泳(上图)分析aav2-killerred于不同基因体拷贝数(gc)下的rt-pcr产物。所获得的片段对应于预期尺寸539bp。标准曲线显示aav-killerred的gc编号的数据点以及由imagej软件所获得的条带强度(下图)。然后借由线性回归定量校准纯化及溶剂交换后具有未知含量的铁化aav2-killerred的rt-pcr样品(源自图9)。梯状条带：分子尺寸标记；ntc：无模板控制。

具体实施方式

本文所述的磁化(如：铁化)病毒粒子，例如aav2病毒粒子，证实于一磁场内可成功地复位至位点。此种磁性病毒粒子带有诸如killerred的光敏剂蛋白质，当其借由磁场诱导而复位至肿瘤部位时，展现对于肿瘤的光触发毒性。

磁性病毒粒子及其制备方法

本文所述的磁性病毒粒子可为附着于诸如氧化铁纳米粒子的磁化粒子的任何病毒粒子。于一些情况下，该病毒粒子可包含封装病毒遗传物质(如：取决于病毒类型的dna或rna)的病毒蛋白质，其可促进病毒粒子的组装。该病毒遗传物质相较于野生型对应者，优选为残缺物质，使得用于本文所述的方法的病毒粒子无法自行复制。另外，该病毒粒子可被修饰以使其无法感染天然宿主细胞，举例而言，病毒蛋白质的残缺涉及与细胞受体的相互作用。或者，本文所述的病毒粒子不具病毒遗传物质。此种病毒粒子亦称为病毒样粒子(viral-likeparticles,vlps)，其可借由已知方法制备。该病毒粒子可源自合适的病毒来源。于一些具体实施例中，该病毒粒子源自慢病毒、腺病毒或腺相关病毒。

磁氧化纳米粒子，例如氧化铁纳米粒子是磁氧化粒子(如：氧化铁粒子)。本文所述的术语“纳米粒子”意指，举例而言，100nm或以下的粒子尺寸，例如，从约0.5nm至约100nm、从约1nm至约50nm、从约1nm至约25nm，或从约1nm至约10nm。该粒子尺寸意指金属粒子的平均直径，其可借由诸如tem(穿透式电子显微镜)等已知方法确定。一般而言，由本文所述的方法所获得的金属纳米粒子可存在着多种粒子尺寸。于一些具体实施例中，存在着不同尺寸的含金属纳米粒子是可接受的。

本文所述的磁氧化纳米粒子，例如氧化铁纳米粒子，可具有从1至100nm的直径。于一些情况下，该氧化铁纳米粒子可为磁铁矿(fe3o4)或其氧化型。铁氧体氧化物(磁铁矿)是一种天然存在的矿物质，其广泛地以超顺磁性纳米粒子的形式使用于多种生物学应用，例如mri、磁分离及磁性药物递送(modyetal.,appliednanoscience,2014,4(4)：pp385-392)。本公开使用的氧化铁纳米粒子可具有从1至80nm的直径，如：1至60nm、1至50nm、1至40nm、1至30nm、1至20nm、1至10nm、3至10nm或5至10nm。于一特定实施例中，本公开使用的氧化铁纳米粒子具有20nm、15nm、10nm、5nm或2nm的平均直径。于一些具体实施例中，整体中的氧化铁纳米粒子的直径在平均直径的50％内(例如，40％、30％、20％或10％)变化。

本文所述的磁性病毒粒子可借由任何已知磁氧化纳米粒子与病毒粒子(如：病毒蛋白质或病毒核酸)的缀合方法，并使用一种或多种交联剂而制得。蛋白质、核酸及药物可依据本领域周知的多种程序而与纳米粒子缀合，例如使用1-乙基-3-[3-二甲基胺基丙基]碳二亚胺或使用1-乙基-3-[3-二甲基胺基丙基]碳二亚胺与聚乙烯亚胺一层一层地层压。图1b提供制备铁化aav2病毒粒子的例示性流程图。于该例示性流程中，诸如氧化铁纳米粒子的磁氧化纳米粒子可在羧基活化剂(如：edc)的存在下，以合适的条件与羧酸一起培养一段合适的时间。可将能够将羧基转化成胺反应性nhs酯的试剂，例如n-羟基磺基琥珀酰亚胺(sulfo-nhs)加入反应混合物中，其可在合适的条件下培养一段合适的时间，以形成经胺基反应性nhs酯修饰的磁性氧化物纳米粒子，该磁性氧化物纳米粒子对病毒蛋白质的某些氨基酸侧链具有反应性以形成共价键。然后，该经修饰的磁氧化纳米粒子于合适的溶液(如：pbs)中与重组病毒粒子混合，例如磁氧化纳米粒子借由化学缀合而与病毒粒子进行缀合。

本文所述的磁性病毒粒子可带有治疗剂，其可借由已知方法封装于病毒粒子内。于一些实施例中，该治疗剂是光敏剂，是可借由光化学过程如在光照射时转化为细胞毒性剂的分子。光敏剂可用于光动力疗法以治疗各种疾病，例如，癌症。

于一些具体实施例中，本文所述的磁性病毒粒子带有诸如光毒性荧光蛋白的蛋白质型光敏剂(光敏剂蛋白)。实例包含killerred蛋白质(参阅如：fransenetal.,methodsmol.biol.,1595：165-179；2017)、killerorange蛋白质(参阅如：sarkisyanetal.,plosone,10(12)：e0145287；2015)或supernova蛋白质(参阅如：takemotoetal.,sci.rep.3：2629；2013)。下述为例示性killerred蛋白质的氨基酸序列。

mgseggpalfqsdmtfkifidgevngqkftivadgsskfphgdfnvhavcetgklpmswkpichliqygepffarypdgishfaqecfpeglsidrtvrfendgtmtshhtyelddtcvvsritvncdgfqpdgpimrdqlvdilpnethmfphgpnavrqlafigfttadgglmmghfdskmtfngsraieipgphfvtiitkqmrdtsdkrdhvcqrevayahsvpritsaigsded(seqidno：1)

在光照射时，killerred蛋白质可产生活性氧物质(ros)，其可用以杀死诸如癌细胞的疾病细胞。killerred蛋白质的光毒性受540至580nm的绿光照射而被诱导，并取决于光强度照射时间及蛋白质浓度，而该时间及浓度可借由操作规程来确定。

本公开所使用的killerred蛋白质可与seqidno：1具有至少75％(如：80％、85％、90％、95％、98％或99％)的序列同一性，并保留光毒性的活性。两个氨基酸序列的“百分比同一性”借由karlin及altschul算法测定(karlinandaltschulproc.natl.acad.sci.usa87：2264-68,1990)，并依据karlin及altschul(karlinandaltschulproc.natl.acad.sci.usa90：5873-77,1993)修饰。此种算法被纳入altschul等人(altschul,etal.j.mol.biol.215：403-10,1990)的nblast及xblast程序(版本2.0)中。可执行xblast程序进行blast蛋白质搜索，得分＝50、字长＝3，以获得与本发明的蛋白质分子同源的氨基酸序列。当两个序列之间存在间隙时，可使用altschul等人(altschuletal.,nucleicacidsres.25(17)：3389-3402,1997)所述的间隙的blast(gappedblast)。当使用blast及间隙的blast程式时，可使用各个程式(如：xblast及nblast)的预设参数。

其它例示性killerred蛋白质及光毒性荧光蛋白质是本领域所习知的，且此类氨基酸序列可从公开的基因库获得，举例而言，genbank，使用seqidno：1作为查询。实例包括，但不限于以genbank登录号aay40168、3a8s_a、2wiq_a、ban81984、3gb3_a、4b30_b及4b30_a所述者。例示性killerorange蛋白质可于genbank内，以登录号aqy79141、4zfs_a及4zbl_a获寻。例示性supernova蛋白质可于genbank内，以登录号3wck_a获寻。

本文所述的任一磁性病毒粒子可与医药上可接受的载体(赋形剂)混合，以形成用于本文所述的治疗方法的医药组合物。术语“可接受”意指该载体必须与组合物的活性成分相容(且优选地，能够稳定该活性成分)，并对接受治疗的受试者无害。医药上可接受的赋形剂(载体)包括本领域习知的缓冲剂(参阅如：remington：thescienceandpracticeofpharmacy20thed.(2000)lippincottwilliamsandwilkins,ed.k.e.hoover)。医药上可接受的载体的非限制性实例包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯树胶、磷酸钙、藻酸盐、西黄蓍胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、盐水、糖浆、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚丙烯酸、润滑剂(例如滑石粉、硬脂酸镁及矿物油)、润湿剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂(例如羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸乙酯及羟基苯甲酸丙酯)、ph调节剂(例如无机及有机酸和碱)、甜味剂及调味剂。

本方法所使用的医药组合物可包含冻干制剂或水溶液形式的医药上可接受的载体、赋形剂或稳定剂(remington：thescienceandpracticeofpharmacy20thed.(2000)lippincottwilliamsandwilkins,ed.k.e.hoover)。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在使用的剂量及浓度对受试者是无毒的，且可包含诸如磷酸盐、柠檬酸盐及其它有机酸的缓冲剂、包括抗坏血酸及甲硫胺酸的抗氧化剂、防腐剂(例如十八烷基二甲基芐基氯化铵、氯化六甲铵、羟基氯苯铵、氯化本索宁(benzethoniumchloride)、苯酚、丁醇或苯甲醇、诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯的对羟基苯甲酸烷基酯、邻苯二酚、间苯二酚、环己醇、3-戊醇及间甲酚)、低分子量(少于约10个残基)的多肽、诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白的蛋白质、诸如聚乙烯吡咯烷酮的亲水聚合物、诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸的氨基酸、包括葡萄糖、甘露糖或葡聚糖的单糖、二糖及其它碳水化合物、诸如edta的螯合剂、诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇酐的糖，、诸如钠的成盐抗衡离子(salt-formingcounter-ion)、金属络合物(例如zn-蛋白质络合物)、及/或诸如tween^tm、pluronics^tm或聚乙二醇(peg)的非离子表面活性剂。

用于活体内投予的医药组合物必须经由消毒处理。消毒方法，举例而言，可借由无菌滤膜过滤。治疗性病毒粒子组合物一般放在具有无菌入口的容器中，举例而言，具有可通过皮下注射针刺穿的瓶塞的静脉注射液袋或小瓶。

本文所述的医药组合物可呈单位剂量形式，例如胶囊、粉剂、颗粒、溶液或悬浮剂，或如非经肠道给药的栓剂。

为制备诸如片剂的固体组合物，可将主要活性成分与药物载体混合，例如：诸如玉米淀粉、乳糖、蔗糖、山梨醇酐、滑石粉、硬脂酸、硬脂酸镁、磷酸二钙或树胶的常规片剂成分，及诸如水的其它药物稀释剂，以形成包含本发明化合物的均质混合物或其无毒的医药上可接受盐的固体预制剂组合物。当称此等预配制组合物为均质时，其意指活性成分均匀地分散在整个组合物中，使得组合物可容易地再分成等效的单位剂型，例如片剂、丸剂及胶囊。然后，将该固体预制剂组合物再分成上述类型的单位剂型，其中包含从0.1至约500mg的本发明的活性成分。新组合物的片剂或丸剂可被包覆或以其它方式合成以提供赋予长效优点的剂型。举例而言，该片剂或丸剂可包含内部剂量组分及外部剂量组分，后者作为前者的包膜形式存在。这两种组分可借由肠溶层分开，该肠溶层用来抵抗于胃中崩解，并允许内部组分完整地进入十二指肠或延缓释放。多种物质可用于此种肠溶层或包衣，此类物质包括许多聚合物酸，以及聚合酸与紫胶、鲸蜡醇及醋酸纤维素等物质的混合物。

合适的表面活性剂包括，尤其是非离子型表面活性剂，例如聚氧乙烯山梨醇酯(如：tween^tm20、40、60、80或85)及其它山梨醇酯(如：span^tm20、40、60、80或85)。含界面活性剂的组合物可方便地包含0.05至5％的表面活性剂，亦可包含0.1至2.5％的表面活性剂。可理解的是，若有需要，可加入其它成分，例如甘露糖醇或其它医药上可接受的载体。

可使用市售的脂肪乳剂制备合适的乳剂，例如intralipid^tm、liposyn^tm、infonutrol^tm、lipofundin^tm及lipiphysan^tm。该活性成分可溶于预混合的乳剂组合物中，或者可溶于油(如：大豆油、红花油、棉籽油、芝麻油、玉米油或杏仁油)以及与磷脂(如：卵磷脂、大豆磷脂或大豆卵磷脂)和水混合形成的乳剂。可理解的是，可加入其它成分，例如甘油或葡萄糖，以调节乳剂的张力。合适的乳剂典型地含有高达20％的油，举例而言，介于5至20％之间。

该乳剂组合物可为由磁性病毒粒子与intralipid^tm或其成分(大豆油、卵磷脂、甘油及水)混合而制备者。

使用磁性病毒粒子进行肿瘤的光触发病毒疗法

磁性病毒粒子可经由磁场靶向或用于磁热疗法(chan(2005)；ito(2005))。带有一种或多种光敏剂的任何磁性病毒粒子皆可借由磁场靶向至所需部位(如：肿瘤部位)。当光照射时，该光敏剂将产生细胞毒性剂，其可于所需部位杀死患病细胞，例如肿瘤细胞。

为实现本文所揭示的方法，可借由合适的途径向有需要治疗的受试者(如：人)给药有效量的医药组合物，所述合适的途径例如静脉内给药，如：借由肌内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内或鞘内途径推注或连续输注一段时间。用于液体制剂的市售雾化器，包括喷射雾化器及超声波雾化器皆适用于给药。液体制剂可直接雾化，而冻干粉末可在复水后雾化。另外，本文所述的含有磁性病毒粒子的医药组合物可利用碳氟化合物制剂及定量吸入器雾化，或者经冻干及研磨成粉末后吸入。

借由本文所述方法治疗的受试者可为哺乳动物，更优选为人类。哺乳动物包括，但不限于，农场动物、运动动物、宠物、灵长类、马、狗、猫、小鼠及大鼠。需要治疗的人类受试者可为有患病风险或疑似患有诸如癌症的目标疾病/病症的人类患者。具有目标疾病或病症的受试者可借由常规医学检查，如：实验室检查、器官功能检查、ct扫描或超声波来鉴定。疑似患有任何此种目标疾病/病症的受试者可能显示疾病/病症的一种或多种症状。处于该疾病/病症风险中的受试者可为具备该疾病/病症的一种或多种风险因子的受试者。

本文所述的“有效量”意指与单独或与一种或多种其它活性剂组合，以给予受试者治疗效果所需的各种活性剂的量。如所属领域技术人员所认可的，该有效量依据所治疗的特定病症、病况的严重程度、个体患者参数(包括年龄、身体状况、体型、性别及体重)、治疗持续时间、并行治疗的性质(若有)、特定的给药途径及于医疗人员的知识及专长之内的其它因素而有所不同。这些因素对于所属领域技术人员来说是众所周知的，且可使用不超过常规的实验来解决。一般优选为使用单个成分的最大剂量或其组合，即，依据合理的医学判断的最高安全剂量。

经验考量，例如半衰期，通常将有助于确定剂量。给药的频率可于治疗过程中确定及调整，且一般而言，但不一定，是基于治疗及/或抑制、及/或改善、及/或延缓目标疾病/病症。

一般而言，为给药本文所述的任何磁性病毒粒子，初始候选剂量可为包含于磁性病毒粒子内约2mg/kg的光敏剂。为达到本公开的目的，典型的剂量范围可为约0.1μg/kg至3μg/kg、至30μg/kg、至300μg/kg、至3mg/kg、至30mg/kg、至100mg/kg或更多，此乃取决于上述所提及的因素。当有需要时，可依据病情重复给药磁性病毒粒子，持续治疗直至预期的症状抑制，或直至达到足够缓解目标疾病或病症或其症状的治疗水平。一例示性的给药方案包含给药约2mg/kg的初始剂量，接着每周约1mg/kg光敏剂的维持剂量，或者接着每隔一周约1mg/kg的维持剂量。但是，其它剂量方案亦可能是有用的，这取决于从业者希望实现的药物动力学衰减模式。举例而言，可考虑每周给药1至4次。于一些具体实施例中，该剂量范围可为从3μg/mg至约2mg/kg(例如约3μg/mg、约10μg/mg、约30μg/mg、约100μg/mg、约300μg/mg、约1mg/kg及约2mg/kg)。于一些具体实施例中，该给药频率为每周一次、每两周一次、每四周一次、每五周一次、每六周一次、每七周一次、每八周次、每九周一次或每十周一次；或每月一次、每两个月一次或每三个月一次或更久。此种疗程很容易借由常规技术及分析进行监控。该给药方案(包括使用的光敏剂)可随时间而更换。

于一些具体实施例中，对于正常体重的成年患者，可给药约0.3至5.00mg/kg的剂量。于一些实施例中，本文所述的磁性病毒粒子的光敏剂(如：killerred)的剂量可为10mg/kg。特定剂量方案，例如剂量、给药次数及重复次数将取决于特定个体及该个体的病史，以及个别药剂的性质(例如药剂的半衰期以及所属技术领域中众所周知的其它考量)。

为了本公开的目的，本文所述的光敏剂的适当剂量将取决于所使用的特定光敏剂(或其组合物)、疾病/病症的类型及严重性、先前的疗法、患者的临床病史及对光敏剂的反应，以及主治医师的判断。典型地，临床医生将施予含有光敏剂的磁性病毒粒子直到达到期望结果的剂量为止。于一些具体实施例中，该期望结果是降低血栓形成。确定剂量是否达到期望结果的方法对于所属领域技术人员而言是显而易见的。可连续或间歇的给药带有相同或不同光敏剂的一种或多种磁性病毒粒子，这取决于，举例而言，受试者的生理状况以及技术从业人员已知的其它因素。基本上可于预选的时段内连续，或者可以一系列的间隔剂量给药磁性病毒粒子，如：在产生目标疾病或病症之前、期间或之后。

可使用医学领域技术人员已知的常规方法，将医药组合物投予受试者，这取决于待治疗疾病的类型或疾病的部位。该组合物亦可借由其它常规途径，如：口服给药、非消化道给药、吸入喷雾给药、局部给药、直肠给药、鼻腔给药、口腔给药、阴道给药或借由植入的储药器给药。本文使用的术语“非消化道”包括皮下、皮内、静脉内、肌内、关节内、动脉内、滑膜内、胸骨内、鞘内、病灶内及颅内注射或输注技术。此外，可借由注射途径给药至受试者，例如使用1个月、3个月或6个月的长效注射方式或生物可降解物质及方法。于一些实施例中，该医药组合物可借由眼内或眼球玻璃体内给药。

注射组合物可含有各种载体，例如植物油、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺、乳酸乙酯、碳酸乙酯、肉荳蔻酸异丙酯、乙醇及多元醇(甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)。对于静脉内注射，可借由滴注方法施予水溶性抗体，由此注入含带有光敏剂及生理上可接受的赋形剂的磁性病毒粒子的药物制剂。生理上可接受的赋形剂可包括，举例而言，5％右旋糖、0.9％盐水、林格氏溶液或其它合适的赋形剂。可将肌内制剂(如：合适的可溶性盐形式的光敏剂的无菌制剂)溶解并施用于药物赋形剂，例如注射用水、0.9％盐水或5％葡萄糖溶液中。

在将磁性病毒粒子施用于有需要治疗的受试者(举例而言，癌症患者)后，可在该受试者的所需部位，例如肿瘤部位，施加磁场，使磁性病毒粒子可被吸引至所需部位。用于产生磁场的例示性磁体包括，但不限于，带电磁体将电脉冲递送到所需部位并静止(不带电)，且在治疗区域上滞留一段时间以递送连续治疗。可在合适的时间内施加磁场至所需部位，以使磁性病毒粒子归位至所需部位。随后，可在相同的部位施加适当的光照，激发包含在该磁性病毒粒子的光敏剂，以释放细胞毒性分子来杀死患病细胞(如：肿瘤细胞)。光照射的合适波长、强度及持续时间取决于在治疗中所使用的光敏剂的类型及/或剂量(如：光毒性荧光蛋白质)。于一实施例中，使用killerred蛋白质，且可使用绿光(如：于540至580nm的波长下)来诱导killerred蛋白质的光毒性。亦可使用其它光毒性荧光蛋白质，包括如上述的killerorange及supernova。

本文所述的光触发病毒疗法的方法可用于治疗癌症，例如实体肿瘤。本文所用的术语“治疗”意指将包含一种或多种活性剂的组合物应用或施予至患有目标疾病或病症、疾病/病症的症状、或有疾病/病症的倾向的受试者，旨在治愈、痊愈、缓和、缓解、改变、补救、改善、改进或影响该疾病、疾病的症状、或疾病或病症的倾向。

缓和目标疾病/病症包括延迟疾病的发展或进展，或减轻疾病的严重程度。缓和该疾病不一定需要治愈的结果。本文所使用的术语“延迟”目标疾病/病症的发展意指拖延、阻碍、减缓、推迟、稳定及/或延缓疾病的进展。此种延迟的时间长短可能有所不同，具体取决于疾病及/或正在接受治疗的个体的历史。“延迟”或缓和疾病发展，或延迟疾病发作的方法，相较于不使用该方法，是在给定的时间范围内降低发展症状的可能性及/或在给定的时间范围内降低症状程度的方法。此种比较典型地基于使用多个受试者，以足以提供统计上显著的结果的临床研究。

疾病的“发展”或“进展”意指疾病的初始表现及/或确定的进展。疾病的发展可使用习知的标准临床技术检测及评估。然而，发展亦意指无法检测的进展。对于本公开的目的，发展或进展意指症状的生物学过程。“发展”包括发生、复发及发作。本文所使用的目标疾病或病症的“发作”或“发生”包括初始发作及/或复发。

用于光触发病毒疗法的试剂盒

本公开也提供用于治疗涉及诸如癌症的疾病细胞的疾病/病症的试剂盒。该试剂盒可包括一种或多种包含任何本文所述的磁性病毒粒子的容器，该磁性病毒粒子带有至少一种光敏剂。

于一些具体实施例中，该试剂盒可包含遵循本文所述任何方法的使用说明书。所包含的说明书可包括用于针对目标疾病(例如癌症)的光触发病毒疗法的磁性病毒粒子的施用说明。该试剂盒可进一步包含基于鉴定该个体是否具有目标疾病来选择适于治疗的个体的说明。于另一具体实施例中，该说明书包含对处于目标疾病风险中的个体施予磁性病毒粒子的说明。

有关使用磁性病毒粒子及/或其所包含的光敏剂的说明书，一般包括关于预期治疗的剂量、给药时程及给药途径的资讯。该容器可为单位剂量、散装包装(如：多剂量包装)或次单位剂量。本发明的试剂盒中所提供的说明通常是在标签或包装夹页(如：包括在试剂盒内的纸张)上的书面指示，但亦可接受机器可读指示(如：在磁化或光储存碟上承载的指示)。

标签或包装夹页上的说明书指示该组合物用于治疗、延迟发作及/或缓和诸如癌症的目标疾病。说明书可提供实现本文所述的任何方法。

本公开的试剂盒经合适的包装。合适的包装包括，但不限于，小玻璃瓶、瓶子、罐子、软性包装(如：密封的聚脂胶膜或塑料袋)等。亦可考虑用于与特定装置，例如吸入器、鼻腔给药装置(如：雾化器)或输注装置(例如微型真空泵)结合使用的包装。试剂盒可具有无菌入口(例如，容器可为静脉内溶液袋或具有可通过皮下注射针刺穿的瓶塞的小玻璃瓶)。容器可具有无菌入口(例如，容器可为静脉内溶液袋或具有可通过皮下注射针刺穿的瓶塞的小玻璃瓶)。组合物中的至少一种活性剂是如本文所述的带有光敏剂的磁性病毒粒子。

试剂盒可选择性的提供诸如缓冲液的额外成分及解说资讯。通常该试剂盒包含容器以及在容器上或与容器相关联的标签或包装夹页。于一些具体实施例中，本发明提供了包含上述试剂盒内容物的制品。

一般技术

除非另有说明，否则本发明的实施将采用本领域技术范围内的分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学及免疫学的常规技术。此种技术在文献中皆有充分的解释，例如，molecularcloning：alaboratorymanual,secondedition(sambrook,etal.,1989)coldspringharborpress、oligonucleotidesynthesis(m.j.gait,ed.,1984)、methodsinmolecularbiology,humanapress；cellbiology：alaboratorynotebook(j.e.cellis,ed.,1998)academicpress、animalcellculture(r.i.freshney,ed.,1987)、introductiontocellandtissueculture(j.p.matherandp.e.roberts,1998)plenumpress、cellandtissueculture：laboratoryprocedures(a.doyle,j.b.griffiths,andd.g.newell,eds.,1993-8)j.wileyandsons、methodsinenzymology(academicpress,inc.)、handbookofexperimentalimmunology(d.m.weirandc.c.blackwell,eds.)、genetransfervectorsformammaliancells(j.m.millerandm.p.calos,eds.,1987)、currentprotocolsinmolecularbiology(f.m.ausubel,etal.,eds.,1987)、pcr：thepolymerasechainreaction(mullis,etal.,eds.,1994)、currentprotocolsinimmunology(j.e.coliganetal.,eds.,1991)、shortprotocolsinmolecularbiology(wileyandsons,1999)、immunobiology(c.a.janewayandp.travers,1997)、antibodies(p.finch,1997)、antibodies：apracticalapproach(d.catty.,ed.,irlpress,1988-1989)；monoclonalantibodies：apracticalapproach(p.shepherdandc.dean,eds.,oxforduniversitypress,2000)、usingantibodies：alaboratorymanual(e.harlowandd.lane(coldspringharborlaboratorypress,1999)、theantibodies(m.zanettiandj.d.capra,eds.,harwoodacademicpublishers,1995)。

虽本文没有进一步的阐述，但相信所属技术领域技术人员可基于上述说明而将本发明使用至最大范围。因此，下述具体实施例应被解释为仅用于说明，而非以任何方式限制本公开的其余部分。对于本文引用的目的或标的，本文所引用的所有刊物均以引用的方式并入本文。

实施例

临床的病毒疗法已被美国食品及药物管理局(fda)成功地批准用于癌症治疗，然而仍需多种改进以更广泛地发展病毒疗法。特别的挑战为全身性地给予病毒疗法，并克服肿瘤内注射的限制，尤其是敏感器官内的复杂肿瘤。为达成目的，构建与氧化铁纳米粒子(约5nm)化学缀合的重组腺相关病毒血清型2(aav2)，其于磁场下展现显著的远端引导能力。借由微型精度而实现转导。此外，将用于产生光敏蛋白质killerred的基因引入aav2基因体中以实现光动力治疗(pdt)；或光触发病毒疗法。活体内实验显示尾静脉注射“铁化”的aav2-killerred的磁性引导与pdt结合，通过细胞凋亡，显著地降低肿瘤生长。此原理验证证实了引导及高度定位的微型光触发病毒疗法。

材料及方法

材料及细胞培养

氧化铁纳米粒子与羧酸(批号：051413a；尺寸：5nm；ζ电位：-30mv至-50mv)从oceannanotech(sandiego,ca)购得。(1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二亚胺盐酸盐)(edc)、n-羟基磺基琥珀酰亚胺(sulfo-nhs)及2-(n-啉基)乙磺酸(mes)缓冲盐水从thermoscientificinc.(rockford,il)购得。磷酸盐缓冲液(pbs)从sigmaco.(st.louis,mo)购得。支化聚乙亚胺(pei,mw＝25,000)从aldrich(milwaukee,mi)购得。pkillerred-dmito的质体dna从evrogenjsc(moscow,russia)购得。病毒(aav2-荧光酵素)及phelper、paav-rc2、paav-gfp及paav-mcs的质体dna从cellbiolabs(sandiego,ca)购得。质体paav-killerred依据下述方式建构。首先，借由聚合酶链式反应(pcr)并使用以下引物序列：5’-ggcgaattcgccaccatgggttcagagggcggccccgccc-3’(seqidno：5)及5’-acgcgtcgacttaatcctcgtcgctaccgatggcgctggt-3’(seqidno：2)，将ecori及sali位点加入来自于pkillerred-dmito的killerred片段。然后，将pcr产生的killerredcdna(0.71kb)复制到paav-mcs的ecori-sali位点上，以产生paav-killerred(图3a及图8)。

将人胚胎肾293(hek293、crl-1573、atcc)及293t(crl-3216、atcc)细胞株培养在含10％胎牛血清(fbs)、100uml^-1青霉素及100μgml^-1链霉素的杜尔贝科改进伊格尔培养基(dulbecco'smodifiedeagle’medium,dmem))内。细胞在含有5％co2的37℃培养箱中培养。

病毒的生产、纯化及效价

利用aav-2helperfree包装系统(cellbiolabs)生产aav2-gfp或aav2-killerred。简而言之，借由pei介导的质体dna(phelper、paav-rc2及paav-转基因)共转染于293t细胞中以产生aav2-报告因子。对于每个100-mm培养皿，将20μg的phelper、10μg的paav-rc2及paav-gfp(或paav-killerred)转染至293t细胞。将三种质体dna在无血清的培养基内与40μg的pei混合，然后借由涡旋混合彻底的混合30至60秒，并放置至少20至30分钟。转染时间仅执行30分钟。转染后3天即获得经转染的细胞。依据virabind^tmaav纯化试剂盒(cellbiolabs)及quicktiter^tmaav定量试剂盒(cellbiolabs)的计划书对aav2-gfp或aav2-killerred执行纯化及效价以进行病毒转导。在每毫升的aav2-gfp或aav2-killerred原液中，各批次的病毒产量(8×100-mm培养皿)的基因体拷贝数(gc)为10¹¹至10¹²。直至使用前，纯化的病毒均储存于-80℃。

制备及铁化病毒的特征

铁化aav2借由化学缀合的方法制备(图1b)。制备在mes缓冲盐水溶液内含有氧化铁纳米粒子、羧酸(25μg，0.1725nmol)、edc(0.1725、0.865、1.73、3.46、4.325、8.65或17.3nmol)的反应混合物，且于该混合物中轻轻加入sulfo-nhs，并在25℃下搅拌15分钟，以获得氧化铁纳米粒子与胺反应性sulfo-nhs酯的均匀溶液。将在pbs中的aav2原液(0.5μl，1×10¹²gcml^-1)滴加到混合物中，然后在25℃恒温下反应120分钟。于化学缀合步骤后，借由使用pbs平衡及溶剂交换为pbs的粒径脱盐管柱(截留分子量：100k)纯化该黄色溶液(图9)。于纯化步骤后，借由使用pcr与下述aav2-killerred的引物序列：5'-gcccatgagctggaagcc-3'(seqidno：3)及5'-cgatggcgctggtgatgc-3'(seqidno：4)；图10)以获得高达约90％的回收率。所获得的aav2-killerred的pcr片段与预期的539bp尺寸一致。

对于透射电子显微镜(tem,jeoljem-1400)分析，将一滴铁化aav2溶液在formvar-碳涂覆的200筛目铜网上以空气干燥。然后，以100kv的加速电压，在jeol-1400显微镜上获得tem图像。

转导

所有病毒感染及转导的实验皆使用含有10％fbs、100uml^-1青霉素及100μgml^-1链霉素的培养基。使用aav2-gfp(绿色荧光蛋白质)作为信号指标，以测定铁化病毒或无铁化病毒在无任何磁场环境的转导能力。将hek293细胞以每孔1×10⁵个细胞接种于24孔板中，并在第二天进行感染。将各种摩尔比的纳米粒子/edc及aav2-gfp的铁化aav2样品分别加入含有10％fbs的dmem培养基中转导6天。

借由流式细胞术(beckmancoulter,fullerton,ca,usa)定量评估经病毒转导的gfp表达细胞。借由0.025％胰蛋白酶将细胞脱离，并将悬浮液转移至微管，且借由4％多聚甲醛固定。借由正向及侧向散射适当地闸控细胞，且每个样品收集10,000个结果(event)。未感染的细胞作为阴性对照组使用。

铁化病毒的毒性

将7×10⁴个hek293细胞接种于24孔板的各孔中，并使用培养基培养12小时。然后，将细胞用于测试不同摩尔比的纳米粒子/edc的铁化aav2，并在ph7.4下培养24小时。培养24小时后，移除包含测试样品的转染培养基。此外，该氧化铁纳米粒子或aav2仅在ph7.4下培养24小时。使用aqueous单溶液细胞增殖分析系统(promega，madison，wi，usa)并按照先前的研究来确定细胞的增殖。甲瓒(formazan)于490nm的光密度(od)定量细胞的活力。该试剂包含四唑鎓化合物3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺基苯基)-2h-四唑内盐(mts)，以及设定未感染细胞所达到的减少的mts为100％，且测试细胞的mts减少以未感染细胞的百分比表示。

借由外部磁场的微转导

从图1e及图1f的结果可知，随后选择用于优化铁化病毒的纳米粒子/edc摩尔比为1/20的铁化aav2，进行下述体外及活体内研究。将hek293细胞以每孔2.5×10⁵个细胞接种于35-mm培养皿中，并于第二天感染。仅将铁化aav2或aav2的试验样品与在含有10％fbs的dmem内的细胞一起培养，然后于直径1500μm的外部磁场(2,000至2,200高斯)的不同时间点(0、5、10或30分钟)进行分析。随后，以4％多聚甲醛(pfa)固定样品，并使用对aav2的主要外壳蛋白vp3的氨基酸75至86特异性的抗aav抗体(abcam，cambridge，ma)进行病毒的免疫染色，借以观察aav2的分布。使用与alexa488(abcam)缀合的山羊抗兔iggh&l将信号放大，并以共聚焦显微镜观察。或者，于6天转导后，使用共聚焦显微镜观察并分析受感染的细胞的gfp表达。该受感染的细胞借由dapi染色以标记细胞核。

根据先前的killerred激活研究(tsengetal.，nat.commun.，2015)，选用561nm氩激光照射20分钟以优化ros生成及killerred光毒性。在killerred照射后，如制造商所述，使用live/可固定的远红死细胞染色试剂盒(thermofisherscientificinc.)观察感染细胞。该受感染的细胞借由dapi染色以标记细胞核。

小鼠研究

涉及动物的所有方法均获得中央研究院实验动物管理与使用委员会(asiucuc)的许可。无胸腺balb/c裸鼠(6周龄雄性)由实验动物中心(台湾地区)所提供。小鼠养护在受控制的12小时/12小时的光照/黑暗周期的环境中，并以最多5组的方式饲养，且允许随意获取食物及水。

活体内光触发病毒疗法的效能

依据图4的试验制备方式，将带有l858r及t790m的egfr-tki抗性h1975细胞借由皮下注射方式注射2×10⁶个细胞至6周龄雄性无胸腺裸鼠的腹部，以建立异体移植肿瘤，并评估铁化aav2或未经修饰的aav2(于有或没有外部磁场的情况下)在肿瘤部位上的光触发病毒疗法的疗效。一旦肿瘤达到约200mm³体积，将小鼠随机分成五组，借由尾静脉注射100μl含有铁化aav2(5×10⁹gc小鼠^-1)或aav2(5×10⁹gc小鼠^-1)的pbs。以pbs注射处理作为对照组小鼠。在将磁场应用于靶向肿瘤的治疗时，将h1975(egfr^l858r/t790m)异体移植肿瘤在1.5t高斯的磁场中暴露2小时。

于第3天时，使用1.5mwmm^-2的总辐照度治疗动物以活化killerred。激光光纤的尖端装载在肿瘤的上方，垂直于动物。此方案是在初始优化实验后确定的(tsengetal.,nat.commun.,2015)。如图4a所述，从注射后第3天开始，每天给予肿瘤20分钟的激光治疗，并持续5天。在每天治疗后，利用测径器测量肿瘤生长。测量肿瘤的长度(l)及宽度(w)，并依据下式计算肿瘤体积：肿瘤体积＝(0.5l²)w。于最后一次治疗的24小时后，进行肿瘤尺寸的检查。

组织学及免疫组织化学分析

接种15天后，可收集h1975(egfr^l858r/t790m)异体移植肿瘤。将所收集的异体移植肿瘤在10％福尔马林中固定，并以石蜡包埋，以及使用苏木素及伊红(h&e)将5mm的切片进行染色，并借由显微镜检测。异种移植肿瘤切片亦使用alexa(molecularprobes，eugene，oregon)及普鲁士蓝或plustunel分析进行染色，以检测肿瘤内铁化aav2的氧化铁纳米粒子或观察所侦测的原位细胞凋亡。

血液分析

于第0天、第2天、第7天及第14天施用铁化aav2-killerred后，借由使用眼窝采血方式采集无胸腺balb/c裸鼠的血清。从获得的血清中进行谷氨酸草酰乙酸转胺酶(got)、谷氨酸丙酮酸转胺酶(gpt)、总胆红素(tbil)及肌酐(cre)水平的生化分析。使用测量相对天冬氨酸转胺酶(ast)及丙氨酸转胺酶(alt)活性的酶方法，以测定got及gpt的水平。另外，依据制造商的说明，使用randox诊断检验试剂盒测定tbil的水平，其包括肝癌及肝炎的肝细胞损伤的指标。使用randox诊断检验试剂盒检测cre水平作为肾功能的指标。

活体内生物荧光影像

将经无菌过滤的pbs溶液中的铁化aav2-荧光素酶或aav2-荧光素酶(100μl总体积中含有5×10⁹gcaav2)借由尾静脉注射至经或未经外部磁场处理的异种移植肿瘤的小鼠中。生物荧光影像是在治疗后的第7天及第14天取得。小鼠于充满2％异氟醚(isoflurance)的氧气室中麻醉。以腹膜内(ip)注射荧光素(约240μl，caliperlifesciencesinc.，hopkinton，ma)后，并于培育后5至10分钟，借由ivis影像系统(具有livingimage软体的xenogenivis-50)以5分钟的恒定的影像撷取时间(bin：16/4，fov：12)撷取荧光影像。活体内生物荧光信号的计算是在扣除各小鼠全身体感兴趣区域的背景(光子通量sec^-1cm^-2sr^-1)后，每只小鼠俯卧及仰卧所采集的荧光信号的总和。

统计分析

数据显示为实验重复六次的数据的平均值±标准偏差。于活体内肿瘤体积的测量中，数据显示为实验重复六次的平均值±标准误差。于统计显著性检验中，假设变异数不相等，使用双尾t检定计算p值。

结果

(1)病毒铁制剂的制备

为严格验证此种新概念，将腺相关病毒血清型2(aav2)以各种摩尔比的纳米粒子/1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc)，与具有羧酸的氧化铁纳米粒子进行缀合(尺寸：5nm)，该缀合物是经由edc/n-羟基磺基琥珀酰亚胺(sulfo-nhs)透过aav表面蛋白质的胺基进行缀合(图1b)而成。氧化铁纳米粒子或铁化aav2的透射电子显微镜(tem)的影像具有ca.5nm(图1c)或30至40nm(图1d)的直径。

于完全培养基(10％胎牛血清、100uml^-1青霉素及100μgml^-1链霉素)中进行病毒感染的体外表征及分析。使用aav2-gfp(绿色荧光蛋白质)分析及使用流式细胞术，以评估化学缀合对于aav2转导效率的影响(图1e)。相对于aav2的对照治疗，于没有磁场的转导后第6天，经铁化aav2治疗的细胞维持恒定的gfp表达，其摩尔比为1/1至1/20(p>0.25)。当摩尔比为1/25时，转导效率下降至55.6％(p<0.005)，而当摩尔比为1/100时，转导效率下降至38.7％(p<0.005)。此等数据清楚地显示，用于将氧化铁纳米粒子与羧酸共价偶联至aav2表面蛋白质的化学键的性质，由于表面配体的竞争而影响了病毒转导的效率(lochrieetal.,j.virol.,2006)。任何摩尔比的铁化aav2与人胚胎肾(hek293)细胞培养后，并未观察到细胞毒性(图1f)。总体而言，优化的1/20摩尔比的铁化aav2，适合于借由低毒性的aav2进行磁性引导的转导及光敏化而有效地感染细胞。

(2)铁化aav2分布的远端磁化控制

为进一步评估铁化aav2远端磁化控制的能力，使用免疫染色测定法与抗aav2抗体及与荧光染剂alexa488缀合的第二抗体来观察细胞培养物中aav2的分布。在暴露于磁场(2,000至2,200高斯)5、10或30分钟的时间内累积可见的荧光，以产生aav2分布的局部控制(图2a)。反之，未修饰的aav2在暴露于磁场30分钟时，具有均匀的随机分布(图2b)。同样，感染后的细胞暴露于直径为1,500μm的圆柱形磁体的相同磁场中培养最长持续30分钟后，并于转导6天后检测经铁化aav2感染的细胞的gfp表达。图2c及图2d中的荧光强度阐明表达gfp细胞的分布显示直径为2,000μm的“微转导”分布。反之，表达gfp的未经修饰的aav2感染的细胞则随机分布(图2e)。

(3)使用铁化aav2-killerred的光触发病毒疗法

以数据证实细胞微转导的成功性，利用aav2-killerred(图3a)与对应波长为561nm的光照射20分钟(tsengetal.,nat.commun.,2015)以实施光触发病毒疗法。与所观察到的经铁化aav2感染的gfp表达细胞一致，killerred表达仅产生于圆形区域(图5a)。亦与gfp表达一致，aav2-killerred对照组并无偏向的空间转导(图5b)。由于killerred具有光诱导毒性，因此在表达killerred蛋白质的细胞中，使用黄光照射后可观察到细胞死亡的情形。在未经aav2-killerred感染的情况下，死亡细胞的分布有效地累积于磁场微点中，且并不会产生光毒性(图3b及图3c)，显示相对于未经修饰的aav2的远端控制的铁化aav2用于光触发病毒疗法(图3d)。

(4)借由血流进行抗肿瘤活性及生物分布的临床前研究

在具有egfr-tki抗性h1975(egfr^l858r/t790m)异种移植肿瘤的无胸腺balb/c裸鼠中，使用远端铁化aav2-killerred执行光触发病毒疗法治疗(图4a)。值得注意的是，对比于由h&e(苏木素及伊红)染色指示的大面积肿瘤坏死(图4c)、借由tunel(末端脱氧核苷酸转移酶dutp缺口末端标记)分析进行广泛的阳性染色(图4d)，以及经由dapi(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)染色标记的核酸(图4e)，相较于其它治疗，使用铁化aav2-killerred治疗与强烈抑制肿瘤生长相关(图4b及图6)。此外，以普鲁士蓝染色的浅蓝色区域，显示暴露于磁场及铁化aav2的样品中铁的分布及铁存在量的增加(图4f)。经由尾静脉注射，单次施予铁化aav2-killerred会导致显著地抑制肿瘤生长，然而其欠缺长期抑制。令人印象深刻的是，当在第8天再次注射铁化aav2-killerred时，在额外的5天内可完全中止肿瘤体积的增长，并在此之后显著抑制肿瘤的生长(p<0.015)。反之，在没有磁化场或光照的情况下，仅传递aav2-killerred或铁化aav2-killerred并不会导致任何统计相关的抗肿瘤作用。同步递送与其它研究一致，皆为协助克服实现全身性递送固有的困难挑战(ledford,nature,2015；belletal.,cellhostmicrobe,2014；russelletal.,nat.biotechnol.,2012；miestetal.,nat.rev.microbiol.,2014；kottermanetal.,nat.rev.genet.,2014)。

使用铁化aav2-killerred治疗的动物亦须评估谷氨酸草酰乙酸转胺酶(got)、谷氨酸丙酮酸转胺酶(gpt)、总胆红素(tbil)及肌酐(cre)的水平，以检测肝及肾功能。该等生化分析并未显示任何显著的肝脏或肾脏毒性(图4g)。于所有实验组中，并未检测到显著的体重损失，这表示无任何严重的铁化病毒、磁场暴露或光照相关的毒性存在(图4h)。除了使用铁化aav2-荧光素酶以外，利用与活体内研究相同的方式，使用生物荧光的动物治疗，于第7天(图7)及第14天(图4i)探讨生物的分布。与该等发现一致的是，在使用磁性引导的第7天及第14天时，在肿瘤中观察到显著的生物荧光，且与图4b所示的肿瘤抑制一致。这加强了在递送中，对远端控制特异性的动态依赖性。如预期，在肝脏中亦观察到与病毒及纳米粒子的清除途径一致的生物荧光(图4j)(tsengetal.,nat.commun.,2015)。

综上所述，已证实借由远端引导的“铁化”病毒递送，达到光触发病毒疗法的抗肿瘤效果的特异性。此种技术概念可用于借由血流的全身性递送，以改善治疗功效及准确性。本发明的铁化aav2有几个区别的技术特征，例如靶向递送、光触发激活病毒疗法、缺乏重组与基因体整合(kottermanetal.,nat.rev.genet.,2014)以及强大的临床前安全性数据(kottermanetal.,nat.rev.genet.,2014)，其等特征定义了本发明的潜在优点。另外，可应用磁振造影(mri)仪器以在预期的方位建立脉冲磁场梯度(muthanaetal.,nat.commun.,2015)，且可提供在内部3d体积内形成积聚的前景。

其它具体实施例

本说明书中公开的所有技术特征可以任何组合方式进行组合。本说明书中公开的每个技术特征可被替换为提供相同、等同或相似目的的替代的技术特征。故，除非另有明确说明，否则所公开的每个技术特征仅为一系列等同或类似技术特征的实施例。

从上述描述中，所属领域技术人员可容易地确定本发明的基本特征，并在不脱离本发明的精神及范畴下，可对本发明进行各种改变与修改，以使其适应于各种用途及条件。故，其它具体实施亦在本发明的权利要求范围内。

等效

虽然本文已描述及说明了若干发明具体实施例，但所属领域技术人员将容易联想到用于执行该功能及/或获得结果的多种其它手段、及/或结构、及/或一或多个本文所述的优点，且每种变化及/或修改被认为在本文所述的本发明的实施例范畴内。更一般而言，所属领域技术人员将容易理解，本文所述的所有参数、尺寸、物质及配置都是例示性的，且实际参数、尺寸、物质及/或配置将取决于具体的应用或使用于本发明所教导的应用。所属领域技术人员将认定，或使用常规实验就能够确定本文所述的具体实施例中的许多等同物。因此，应该理解的是，上述具体实施例仅以实例的方式呈现，并在所述权利要求范围及其等同物的范畴内，可以不同于具体的描述及请求保护的方式来实施本发明具体实施例。本公开的发明具体实施例针对本发明所述的每一个别技术特征、系统、物品、物质、试剂盒及/或方法。此外，若此种特征、系统、物品、物质、试剂盒及/或方法不相互矛盾，那么两种或更多此种特征、系统、物品、物质、试剂盒及/或方法的任何组合皆包含于本公开的发明范畴内。

如本文所界定及使用的所有定义应理解为受控于字典的定义、借由引用方式并入的文献中的定义，及/或所界定的术语的普通含义。

借由引用方式并入本文中所公开的所有参考文献、专利及专利申请案中关于每个被引用的标的，其于一些情况下可涵盖整体文献。

在说明书及权利要求书中使用的不定冠词“一(a)”及“一(an)”，除非有相反的明确说明，其应理解为表示“至少一个”。

本文在说明书及权利要求书中使用的词组“及/或”应当理解为意指元素中的“一或两种”的结合，即，在某些情况下结合存在的元素及在其它情况下分离存在的元素。以“及/或”列出的多个元素应以相同的方式解释，即，“一或多种”元素的连接。不管与具体标识的元素相关与否，非由“及/或”子句具体标识的其它元素亦可选择性的存在。因此，作为非限制性实例，当与诸如“包含”的开放式语言结合使用时，参比“a及/或b”，在一个具体实施例中可仅限于a(可选择性地包括b以外的元素)；在另一具体实施例中，仅限于b(可选择性地包括a以外的元素)；在另一具体实施例中，涉及a及b(可选择性地包括其它要素)；等等。

如在本说明书及权利要求书中所使用的“或”应被理解为具有与如上述所定义的“及/或”相同的含义。举例而言，当于列表中分开项目时，“或”或“及/或”应被解释为包含性的，即在一些元素或元素列表中意指包含至少一个，但亦包含超过一个，且可选择性地包括未列出的其它项目。只有清楚地表明相反的术语，诸如“仅一个”或“恰好一个”，或者当在申请专利范围中使用“由...组成(consistingof)”将意指包含数个或列表元素中的恰好一个元素。一般而言，当在如本文所使用的术语“或”的前放置诸如“其中(either)”、“其中的一(oneof)”、“仅为其中之一(onlyoneof)”或“恰为其中之一(exactlyoneof)”的排他性术语，仅当被解释为排他性选择(即，“两者中的其中一个或另一个，而非两者”)。当于权利要求书中使用“基本上由...组成(consistingessentiallyof)”具有其于专利法领域中使用的普通含义。

如在本文的说明书及权利要求书中所使用的在一或多个元素列表中的词组“至少一者(atleastone)”，应该理解为意指自元素列表中的任何一个或多个元素选取至少一元素，但不一定包括元素列表内具体列出的每个元素中的至少一者，且不排除元素列表中元素的任何组合。不管与具体标识的该等元素相关与否，该“至少一者”的定义亦可为元素可选择性的存在，而非在元素列表内具体标识的元素。因此，作为非限制性实例，“a及b中的至少一者”(或者等同地，“a或b中的至少一者”，或者等效地“a及/或b中的至少一者”)可在一个具体实施例中，意指至少一个，可选择性的包括多于一个a，但无b(并且可选择性的包括除b之外的元素)；于另一具体实施例中，涉及至少一个，可选择性的包括多于一个b，但无a(并且可选择性的包括除a之外的元素)；于另一具体实施例中，涉及至少一个，可选地包括多于一个a，及涉及至少一个可选择性的包括多于一个b(以及可选择性的包括其它元素)；等等。

亦应该理解的是，除非有相反的明确说明，否则于此权利要求范围的任何方法，包括多于一个的步骤或动作，该方法的步骤或动作的顺序不一定局限于所述的该方法的步骤或动作。