两种附子生物碱联合药物的制备及其在肝癌治疗中的应用的制作方法

本发明涉及抗肿瘤药物领域，具体涉及附子总生物碱或乌头碱、联合已应用于临床的牛磺酸和polyic，构建肝癌治疗药物的制备方法和应用。

背景技术：

近年肝细胞癌(hcc)新发病例超过780000，死亡病例超过740000，其中一半来自中国。目前用于进展期hcc的药物仅索拉菲尼被美国fda批准，肝癌患者较其他癌症更难以耐受传统的化疗药物，因此局部靶向、整体调节的策略治疗肝癌更可行。

癌毒属于阴邪，附子是温阳第一要品。中药附子(aconitilateralisradixpraeparata)是毛茛科植物乌头的子根的加工品，辛、甘，大热，有毒，乌头类生物碱是附子中最主要的有效成分。附子的药理作用主要有镇痛抗炎作用、免疫调节作用等。附子在中医临床已作为一味主药用于治疗肿瘤，如李可应用附子逐渐加量的方剂，取得一定疗效。任丽娅等通过动物实验研究证实，附子提取物具有调节肝癌h22细胞相关信号传导通路，从而促进其凋亡，并发挥抑制细胞增殖的作用。附子总生物碱能用温阳的方法减慢体寒血瘀的小鼠的肿瘤的生长。附子对胃癌细胞sgc-7901的增殖抑制作用，表现出明显的浓度和时间依赖性。附子对b淋巴瘤raji细胞起到凋亡诱导作用，表现出对时间和浓度依赖的规律。乌头碱可以抑制肝癌细胞bel-7402的增殖和活力，凋亡细胞和s期细胞的百分比增加，细胞显示出超微结构的分化特征；甲胎蛋白分泌减少，而白蛋白分泌增加，对bel-7402细胞具有较强的细胞毒性。

附子生物碱抑制炎症。肝炎病毒感染导致的过度炎症是肝癌的重要危险因素。乌头碱通过抑制nf-κb和nfatc1的激活以及细胞融合分子dc-stamp的表达来抑制raw264.7细胞中rankl诱导的破骨细胞分化，抗炎治疗类分湿性关节炎。附子能通过激活erk和nrf2途径，减少慢性阻塞性肺病大鼠支气管肺泡灌洗液中炎症细胞的数量，抑制炎症因子il-1β、il-6、tnf-α、tgf-β的释放。而il-1β、il-6是肝代偿性增生的重要因子，代偿性增生与hcc成正相关。

肝癌患者往往伴有肝硬化免疫力低下，肿瘤相关因子抑制了免疫系统对肿瘤的识别、杀伤、清除，t细胞耗竭、致免疫耐受treg细胞增多、th17细胞增多；nk细胞功能抑制；肝脏微环境有大量的免疫调节细胞及抗原提呈细胞，通过改善肝脏微环境促进抗癌免疫力是可选方案。但癌症病人往往是多重免疫缺陷，靶向单一的免疫缺陷不足以诱导强烈的抗癌免疫力。因此有必要诱导多重免疫应答、多重抑瘤效应。

polyic是tlr3激动剂，肝癌瘤内tlr3的高表达与生存期延长相关。小鼠模型及hcc病人样本研究发现polyic通过tlr3信号直接诱导肿瘤细胞的凋亡，促进ifn-γ释放活化nk细胞抑制肝再生，并诱导th1、cd8+t、nk细胞的浸润对肝癌细胞发挥细胞毒作用。polyic能抑制肝纤维化及hcc细胞株的生长，其类似物polyiclc联合索拉菲尼可提高小鼠免疫活性而抑制肿瘤进展，hcc临床i期研究发现瘤内及肌肉注射polyic联合放疗可诱导肿瘤微环境的免疫反应，是安全且患者耐受的。

氧化应激在癌症中有重要作用已是共识。牛磺酸是有效的抗氧化剂，有抗炎作用。在肝脏中由甲硫氨酸和半胱氨酸合成，肝脏病人血清中牛磺酸、半胱氨酸及谷胱甘肽(gsh)浓度降低。体内一半的半胱氨酸转化为gsh，其余合成牛磺酸。预先给小鼠牛磺酸可预防过度炎症介质的释放，防止gsh及gsh合成酶rna的减少，减轻急性肝损伤。牛磺酸抑制氧化损伤防止四氯化碳诱导的肝纤维化。说明牛磺酸有肝保护作用。

技术实现要素：

本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了以附子总生物碱或乌头碱为基础，联合抗氧化剂牛磺酸、tlr3配体polyic制备的能诱导机体免疫反应的肝癌治疗药物。

为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：两种治疗肝癌的附子生物碱联合药物，所述联合药物包含有附子总生物碱或乌头碱、抗氧化剂牛磺酸和tlr3配体polyic。

进一步的，上述的两种治疗肝癌的附子生物碱联合药物，所述联合药物中，附子总生物碱(或)乌头碱、牛磺酸每日给药1次，polyic隔两日给药1次。

本发明的第二个目的是提供了上述两种治疗肝癌的附子生物碱联合药物的制备方法，包括以下步骤：

1)总生物碱的提取方法：称取附子100g，加入85％乙醇400ml，浸泡过夜；用可调式加热套热回流提取2h后过滤，2000rpm离心10min，抽滤；再重复提取4次；50～60℃减压浓缩；用12m盐酸调节ph值为4，离心；用10m氢氧化钠调节ph值为12，离心；上清用三氯甲烷(体积比为1∶1)萃取4次，减压浓缩。

2)乌头碱水溶液的配制；称取3.6mg乌头碱，溶解于480ml蒸馏水中；

3)牛磺酸水溶液的配制；称取10.75mg牛磺酸，溶解于336ml蒸馏水中；

4)polyic水溶液的配制；称取32mgpolyic，溶解于128ml蒸馏水中；

5)将步骤1)提取的总生物碱或步骤2)得到的乌头碱分别与步骤3)得到的牛磺酸每日联合应用，步骤4)得到的polyic隔2日应用，制得治疗肝癌的联合药物。

本发明的第三个目的是提供了上述两种肝癌治疗联合制剂在肝癌治疗中给药途径的应用。

进一步的，上述的两种肝癌治疗联合制剂在肝癌治疗中给药途径的应用，所述应用是：

1)附子总乌头碱及牛磺酸每日腹腔给药一次；

2)附子总生物碱每日口服给药一次；

3)polyic隔2日腹腔给药一次。

本发明的第四个目的是提供了两种肝癌治疗联合制剂在肝癌治疗中给药浓度及量的应用。

进一步的，上述的两种肝癌治疗联合制剂，所述两种肝癌治疗联合制剂在肝癌治疗中给药浓度及量的应用是将：

1)附子总生物碱浓度稀释至0.2mg/ml，给药浓度为4mg/kg·天；

2)乌头碱溶解至7.5ug/ml，给药浓度为0.15mg/kg·天；

3)牛磺酸溶解至32mg/ml，给药浓度为640mg/kg·天；

4)polyic溶解至0.25mg/ml，给药浓度为50ug/次·天。

本发明的有益效果为：本发明提供的两种治疗肝癌的附子生物碱联合药物，有效的抑制了肿瘤的生长，促进淋巴细胞的增殖、尤其是t淋巴细胞，polyic与牛磺酸促进ifn-α的释放，与附子生物碱联合有助于维持其释放，从而保证抑瘤效应。其四个成分主要特性如下：

1.附子总生物碱：是生附子按照上述方法提取的提取物，含有多种生物碱，可能靶向受体酪氨酸激酶如egfr信号，抑制炎症因子il-1β信号，il-6的释放减少，抑制肝异常再生；抑制肝癌新生血管的形成及改变其物质代谢发挥抑瘤作用；靶向treg表面egfr下调其免疫抑制；

2.乌头碱：其主要特性与附子总生物碱相同；

3.polyic：polyic是一种合成的双链rna，与tlr3特异结合，能够激活固有免疫应答，通过tlr3信号直接诱导肿瘤细胞的凋亡，促进ifn-γ释放活化nk细胞抑制肝再生，并诱导th1、cd8+t、nk细胞的浸润对肝癌细胞发挥细胞毒作用。polyic能抑制肝纤维化及hcc细胞株的生长，其类似物polyiclc联合索拉菲尼可提高小鼠免疫活性而抑制肿瘤进展，hcc临床i期研究发现瘤内及肌肉注射polyic联合放疗可诱导肿瘤微环境的免疫反应，是安全且患者耐受的；

4.牛磺酸：牛磺酸是有效的抗氧化剂，有抗炎作用。在肝脏中由甲硫氨酸和半胱氨酸合成，肝脏病人血清中牛磺酸、半胱氨酸及谷胱甘肽(gsh)浓度降低。体内一半的半胱氨酸转化为gsh，其余合成牛磺酸。预先给小鼠牛磺酸可预防过度炎症介质的释放，防止gsh及gsh合成酶rna的减少，减轻急性肝损伤。牛磺酸抑制氧化损伤防止四氯化碳诱导的肝纤维化，具有肝保护作用。

附图说明

图1为h22小鼠移植瘤抑瘤率检测(n＝5)。

小鼠接种h22细胞后第二天药物干预9天，第10天处死取肿瘤称重。生物碱灌胃组、乌头碱腹腔组及阳性对照5-fu组与阴性对照生理盐水组均有显著性差异。^*p＜0.05。

图2为小鼠脾脏淋巴细胞相对活力(n＝5)

抗原cona刺激各组小鼠脾脏淋巴细胞，每个样本设5个重复孔，孵育72h，mtt法检测，酶标仪波长490nm测定od值。^*p＜0.05，与对照组n.s组比较。

图3脾脏淋巴细胞亚型检测(n＝5)。

药物治疗后分离小鼠脾脏淋巴，流式细胞仪检测cd3、cd69的表达，cd3表达乌头碱灌胃及5-fu组与阴性对照有差异，cd3、cd69双阳性细胞各组无差异。^*p＜0.05，与对照组n.s组比较。

图4为药物治疗后血清ifn-α释放水平(n＝5)。

采用抗ifn-αelisa试剂盒检测血清ifn-α水平，polyic+牛磺酸组最高。^*p＜0.05，与polyic+牛磺酸组比较，水煎剂灌胃组与乌头碱灌胃组血清ifn-α减少，这两组无抑瘤作用，提示牛磺酸及polyic可维持ifn-α的释放，从而保证附子制剂的抑瘤效应。

具体实施方式

实施例1：

1.实验材料：

附子总生物碱由兰州大学制备，制备方法详见上述；

乌头碱购自北京伊普瑞斯科技有限公司，商品号must-17022206；

牛磺酸购自sigma-aldrich公司，商品号t0625-25g；

polyic购自开平牵牛生化制药有限公司，商品号160901；

5-fu购自甘肃省人民医院，商品号fa170301。

anti-mousecd3-fitc购自thermofisherscientific，商品号4275976；

anti-mousecd69-pe购自ebioscience公司，商品号60a353811712；

mouseifn-αelisakit购自上海纪宁实业有限公司，商品号a05115；

mtt购自solarbio公司，商品号m8180；

pbs由兰州大学以常规制备方法制备。

2.实验动物：昆明小鼠(18-22g)，购自兰州大学动物实验中心。

3.实验动物分组(共八组)

a.生理盐水组

b.水煎剂灌胃+牛磺酸+polyic

c.总生物碱灌胃+牛磺酸+polyic

d.总生物碱腹腔+牛磺酸+polyic

e.乌头碱灌胃+牛磺酸+polyic

f.乌头碱腹腔+牛磺酸+polyic

g.牛磺酸+polyic

h.5-fu组

5.小鼠皮下接种h22细胞。

1)将小鼠h22肝癌细胞株常规复苏、培养扩增，调整细胞悬液密度至1×10⁶个/ml，注入供传代的昆明种小鼠腹腔1ml，1周后抽取腹水，再腹腔注射于另外的小鼠；

2)构建模型：于腋下消毒小鼠后，将0.1ml细胞浓度为1×10⁷个/ml的h22细胞皮下接种。

6.抑瘤率检测：抑瘤率(％)＝(1-(药物组平均瘤重/模型组平均瘤重))x100％。

如图1所示，结果表明：经附子联合药物治疗后，没有附子制剂的polyic+牛磺酸组抑瘤率最低，总生物碱灌胃联合组、乌头碱腹腔联合组、5-fu抑瘤率显著高于生理盐水组(p＜0.05)。说明本发明的两种药物附子总生物碱联合polyic+牛磺酸经口服给药，乌头碱联合polyic+牛磺酸经腹腔给药可有效抑制肿瘤生长。

7.小鼠脾脏淋巴细胞的分离：在超净台中小心剪开小鼠的腹部外皮，用大头针固定。再剪开小鼠的腹腔，用镊子取出小鼠的脾脏。于35mm培养皿中加入5ml淋巴细胞分离液。固定尼龙网，然后用玻璃注射器活塞轻轻研磨小鼠脾脏。把悬有脾细胞的分离液立即转移到离心管中，离心前再覆盖一层大约200μl的1640培养基。

8.mtt法检测小鼠脾脏淋巴细胞增殖：将完全1640100ul/孔加入96孔细胞培养板，再加上述细胞悬液100ul(1x10⁶个)/孔。加入浓度为10ug/ml，10ul的cona，每个样本设5个重复孔。培养板置于37℃，5％co2培养箱中孵育72h；培养结束前4h(第68h)，每孔加入mtt工作液20ul(浓度为5mg/ml)，继续在培养箱中孵育4h，仔细吸去上清保证不要吸走细胞，每孔加入dmso溶液200ul，室温充分振荡10min后，酶标仪波长490处测定od值。

如图2所示，结果表明：除水煎剂组外，总生物碱、乌头碱联合药物两种给药途径均会促进淋巴细胞增殖(p＜0.05)，无附子生物碱的polyic+牛磺酸组及5-fu阳性对照组也促进淋巴细胞增殖(p＜0.05)。说明本发明中的两种药物促进淋巴细胞的增殖，polyic+牛磺酸在其中发挥的作用不容忽视。

9.流式细胞仪检测淋巴细胞亚型：取浓度为1×10⁷个/ml脾细胞100μl(1×10⁶个细胞)加至2mlep管，按照以下步骤操作，其中对照管(空白管)细胞除不加抗体外，其余操作同试验管细胞。

荧光抗体染色，anti-mousecd3fitc，0.5μl/test，anti-mousecd69pe，1.2μl/test。两个补偿管加100μl(1×106个细胞，任一组细胞)，分别加一种抗体按上述体积；实验管每管加脾细胞100μl(1×106个细胞)，并加0.5ulanti-mousecd3fitc和1.2ulanti-mousecd69pe。加完抗体后轻轻旋转混合，4℃冰箱内避光孵育30min。加入预冷的washbuffer/pbs1ml，然后重悬细胞，400×g(2400rpm)离心5min后用1ml微量移液器吸弃上清。同法，再洗1次。加入预冷的washbuffer/pbs1ml，然后重悬细胞，400×g(2400rpm)离心5min后用1ml微量移液器吸弃上清。同法，再洗1次。

如图3所示，结果表明：乌头碱腹腔组及5-fu组脾脏淋巴细胞cd3表达比阴性对照组高(p＜0.05)，其余组表达无差异；cd69表达及cd3、cd69双阳性表达各组间均无显著性差异。说明本发明中的乌头碱腹腔联合药物同5-fu一样，通过t淋巴细胞发挥了重要的抗肿瘤免疫作用。尽管活化标记cd69的表达无差异，但阳性对照5-fu组也同各个实验组一样，提示本发明中的两种药物诱导淋巴细胞的活化可能仍然是存在的，只是检测的时间段或其他原因导致没有检测到其活化。

10.血清ifn-α水平检测

眼球取血，处死后于75％的乙醇中浸泡1-2分钟，血样室温放置1-2h，37℃1h，离心3000转15分钟，取上清置-20℃。使用试剂盒制作标准曲线后，检测各组的od值。

如图4所示，结果表明：各组与n.s组相比，血清ifn-α释放水平无明显改变(p＞0.05)，其中polyic+牛磺酸组血清ifn-α量最高。与polyic+牛磺酸组比较，水煎剂和乌头碱灌胃组是显著减少的(p＜0.05)，且这两组恰恰没有显著性(p＜0.05)抑瘤率，有显著性抑瘤率的组，包括阳性对照组ifn-α量与n.s组相当(p＞0.05)。说明ifn-α释放量的不减少，保证了抑瘤效应，其释放是由polyic+牛磺酸诱导的；附子水煎剂与乌头碱可能有抑制其释放的作用，进一步说明本发明的两种药物中polyic+牛磺酸与附子生物碱的联合应用是必要的。