本发明属于医药制备
技术领域：
，具体涉及一种具有神经保护功能的玄参总酚提取物。【
背景技术：
】玄参(scrophularial.)为玄参科植物玄参(scrophularianingpoensishemsl)的干燥根，别名元参、黑参、浙玄参、乌元参等。玄参中含有丰富的多酚类化合物。多酚类化合物的主要功能性质是作为许多酶体系的抑制剂或激活剂、金属螯合剂以及自由基清除剂。多酚类化合物通过酚羟基的离解和自由基途径产生抗氧化作用，是医药、食品、化妆品中很有前景的一类天然抗氧化剂和自由基清除剂。所以从玄参中如何提取多酚类化合物具有重要的研究价值和广泛的应用前景。目前采用的从玄参中提取多酚类化合物的方法有回流、冷浸、回流和渗漉等方法；以粉碎的玄参药材为原料，以渗漉法和回流法等从玄参中提取多酚类化合物，存在提取总酚含量低的问题。技术实现要素：为了克服以粉碎的玄参药材为原料，以渗漉法和回流法等从玄参中提取多酚类化合物，存在提取总酚含量低的问题，本发明提供一种具有较为明显的神经保护功能的玄参总酚提取物。为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：一种具有神经保护功能的玄参总酚提取物，它是从中药玄参中提取的含酚类成分的提取物，该提取物需总酚含量在52.16％以上，才具有神经保护的功能，通过包括以下步骤的方法制得的：(1)制备玄参粗提物：取玄参药材，切片，加玄参药材6-12倍量30％-60％的乙醇进行提取1-3次，每次0.5-3h，滤过，合并提取液；(2)对步骤(1)制得的合并提取液进行超声波处理，制得处理的浆液；(3)将经步骤(2)处理的浆液采用超临界co2萃取，在co2流体中加入月桂醇硫酸钾、乙酸乙酯、聚山梨酯，所述月桂醇硫酸钾、乙酸乙酯、聚山梨酯的总用量为co2流体的18％-25％，其中月桂醇硫酸钾、乙酸乙酯、聚山梨酯的重量配比为(1.6-2.3):(0.7-1.8):(1.2-2.8)，控制萃取压力为20-30mpa，萃取温度为50-56℃，co2流量为20-25l/h，萃取时间为2-3h，得到粗品a，将粗品a与浆液分离，分离压力为8-10mpa，分离温度为42-48℃；剩余浆液再次采用超临界co2萃取，在co2流体中加入丁酮、月桂醇硫酸钾，所述丁酮、月桂醇硫酸钾的总用量为co2流体的10％-16％，其中丁酮、月桂醇硫酸钾的重量配比为(1.2-2.6)：(0.5-0.9)，控制萃取压力为25-35mpa，萃取温度为52-58℃，co2流量为20-25l/h，萃取时间为1.2-2h，得到粗品b，将粗品与浆液分离，分离压力为8-10mpa，分离温度为42-48℃，将所得粗品a和粗品b混合，添加盐酸，用量为粗品a和粗品b总量的8％-15％，调节ph值为3.6-4.8，离心分离，得到分离液；(4)将步骤(3)制得的分离液过大孔吸附树脂，吸附2h以上，先用水洗脱，将该水洗脱液弃去不用，除去极性大的杂质，再用50％-70％的乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇，浓缩，干燥，即得玄参总酚提取物。进一步地，所述的提取物总酚含量在70％以上。更进一步地，所述的提取物总酚含量在80％以上。进一步地，可将其用于制备具有神经保护功能的药物中。进一步地，所述的药物剂型包括粉剂、滴丸、片剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、颗粒剂中的一种。进一步地，步骤(2)中所述超声波的频率为35-42khz，处理时间为6-9min。进一步地，步骤(3)中所述盐酸的浓度为22％-26％。进一步地，步骤(4)中所述大孔吸附树脂包括d201大孔吸附树脂、ab-8大孔吸附树脂、d101大孔吸附树脂中的一种。进一步地，步骤(4)中用乙醇洗脱制取玄参总酚提取物，采用正丁醇进一步纯化处理精制替代。进一步地，步骤(4)中所述干燥包括真空干燥、喷雾干燥微波干燥中的一种。本发明玄参总酚提取物具有神经保护功能的原理：玄参中含有丰富的多酚类化合物，本发明通过工艺改进，采用超临界萃取法提取玄参总酚提取物，解决了现有技术存在提取总酚含量低的问题；本发明玄参提取物总酚含量在52.16％以上，通过实验证明含总酚52.16％以上的玄参总酚提取物可以对神经具有较为明显的保护功能，而低于含总酚52.16％的玄参总酚提取物，对神经保护功能极弱，这可能是玄参多酚类化合物通过酚羟基的离解和自由基途径产生抗氧化作用，而产生抗氧化作用的大小需要具有一定浓度的和含量的玄参总酚提取物，方能起到对神经具有保护作用。本发明具有以下有益效果：(1)由实施例1-3的的数据可见，采用正丁醇进一步纯化处理精制替代乙醇纯化，可提高总酚的含量；由实施例3与对比例1-6的数据可见，月桂醇硫酸钾、乙酸乙酯、聚山梨酯、盐酸均能影响提取物的总酚含量，其中影响最大的是聚山梨酯。(2)由实施例3和对比例1-3的数据可见，步骤(3)中缺少在co2流体中加入月桂醇硫酸钾、乙酸乙酯、聚山梨酯的操作步骤；步骤(3)中缺少添加盐酸，调节ph值为4.2的操作步骤，在提取玄参总酚的过程中起到了协同作用；协同提高了玄参总酚含量；另外由实施例3和对比例2、4-6的数据可见，月桂醇硫酸钾、乙酸乙酯、聚山梨酯在提取玄参总酚的过程中起到了协同作用；协同提高了玄参总酚含量；这是：由于玄参总酚在co2流体中的溶解度不大，导致其提取率不高，而月桂醇硫酸钾具有表面活化性能，可使溶液充分活化；玄参总酚易溶于乙酸乙酯；聚山梨酯作为增溶剂能在水中形成胶团，可吸附玄参总酚物质而增大玄参总酚在co2流体中的溶解度，在步骤(3)中向co2流体中加月桂醇硫酸钾、乙酸乙酯、聚山梨酯，可增大玄参总酚在co2流体中的溶解，从而进一步增大玄参总酚的提取率。玄参总酚在酸性条件下稳定，在碱性条件下易氧化，步骤(3)在玄参总酚提取分离后添加盐酸，调节ph值为4.2，可防止玄参总酚被氧化，从而提高玄参总酚的纯度，进一步提高玄参总酚含量。(3)本发明克服了以粉碎的玄参药材为原料，以渗漉法和回流法等从玄参中提取多酚类化合物，存在提取总酚含量低的问题，采用本发明的方法制备玄参总酚提取物总酚含量高达50％以上，可应用于制备具有神经保护功能的药物中。(4)在鱼藤酮模型中，均采用浓度为1000mg/l，含总酚52.16％以上的玄参总酚提取物可以提高细胞存活率，而含总酚在45％以下的玄参总酚提取物明显降低细胞存活率。说明了采用浓度为1000mg/l，含总酚52.16％以上的玄参总酚提取物可以对神经具有较为明显的保护功能。【具体实施方式】为便于更好地理解本发明，通过以下实例加以说明，这些实例属于本发明的保护范围，但不限制本发明的保护范围。实施例1一种具有神经保护功能的玄参总酚提取物，它是从中药玄参中提取的含酚类成分的提取物，通过包括以下步骤的方法制得的：(1)取玄参药材100kg，切片，加30％的乙醇回流提取2次，每次1h，第1次加800kg30％的乙醇，第2次加600kg30％的乙醇，滤过，合并提取液；(2)对步骤(1)制得的合并提取液进行超声波处理，所述超声波的频率为38khz，处理时间为9min，制得处理的浆液；(3)将经步骤(2)处理的浆液采用超临界co2萃取，在co2流体中加入月桂醇硫酸钾、乙酸乙酯、聚山梨酯，所述月桂醇硫酸钾、乙酸乙酯、聚山梨酯的总用量为co2流体的18％，其中月桂醇硫酸钾、乙酸乙酯、聚山梨酯的重量配比为2.3:1.5:1.8，控制萃取压力为20mpa，萃取温度为50℃，co2流量为20l/h，萃取时间为3h，得到粗品a，将粗品a与浆液分离，分离压力为mpa，分离温度为42℃；剩余浆液再次采用超临界co2萃取，在co2流体中加入丁酮、月桂醇硫酸钾，所述丁酮、月桂醇硫酸钾的总用量为co2流体的10％，其中丁酮、月桂醇硫酸钾的重量配比为2.2：0.6，控制萃取压力为30mpa，萃取温度为56℃，co2流量为20l/h，萃取时间为2h，得到粗品b，将粗品与浆液分离，分离压力为8mpa，分离温度为42℃，将所得粗品a和粗品b混合，添加盐酸，所述盐酸的浓度为22％，用量为粗品a和粗品b总量的10％，调节ph值为4.3，离心分离，得到分离液；(4)将步骤(3)制得的分离液过d201大孔吸附树脂，先用水洗脱至无色，将此水洗脱液弃去，再用70％的乙醇洗脱至无色，收集此70％乙醇洗脱液，回收乙醇并浓缩成相对密度为1.25的稠膏，真空干燥，即得到具有神经保护功能的玄参总酚提取物。该提取物其用于制备具有神经保护功能的药物中，所述的药物剂型为粉剂。实施例2一种具有神经保护功能的玄参总酚提取物，它是从中药玄参中提取的含酚类成分的提取物，通过包括以下步骤的方法制得的：(1)取玄参药材100kg，切片，加50％的乙醇回流提取2次，每次3h，第1次加900kg50％的乙醇，第2次加600kg50％的乙醇，滤过，合并提取液；(2)对步骤(1)制得的合并提取液进行超声波处理，所述超声波的频率为42khz，处理时间为6min，制得处理的浆液；(3)将经步骤(2)处理的浆液采用超临界co2萃取，在co2流体中加入月桂醇硫酸钾、乙酸乙酯、聚山梨酯，所述月桂醇硫酸钾、乙酸乙酯、聚山梨酯的总用量为co2流体的24％，其中月桂醇硫酸钾、乙酸乙酯、聚山梨酯的重量配比为2.3:1.8:2，控制萃取压力为30mpa，萃取温度为55℃，co2流量为24l/h，萃取时间为2.6h，得到粗品a，将粗品a与浆液分离，分离压力为10mpa，分离温度为46℃；剩余浆液再次采用超临界co2萃取，在co2流体中加入丁酮、月桂醇硫酸钾，所述丁酮、月桂醇硫酸钾的总用量为co2流体的14％，其中丁酮、月桂醇硫酸钾的重量配比为2.5：0.8，控制萃取压力为32mpa，萃取温度为55℃，co2流量为23l/h，萃取时间为1.6h，得到粗品b，将粗品与浆液分离，分离压力为9mpa，分离温度为46℃，将所得粗品a和粗品b混合，添加盐酸，所述盐酸的浓度为23％，用量为粗品a和粗品b总量的12％，调节ph值为4.5，离心分离，得到分离液；(4)将步骤(3)制得的分离液过ab-8大孔吸附树脂，先用水洗脱至无色，将此水洗脱液弃去，再用60％的乙醇洗脱至无色，收集此60％乙醇洗脱液，回收乙醇并浓缩成相对密度为1.10的清膏，喷雾干燥，即得到具有神经保护功能的玄参总酚提取物。该提取物用于制备具有神经保护功能的药物中，所述的药物剂型为片剂。实施例3一种具有神经保护功能的玄参总酚提取物，它是从中药玄参中提取的含酚类成分的提取物，通过包括以下步骤的方法制得的：(1)取玄参药材100kg，切片，加60％的乙醇回流提取2次，每次2h，第1次加600kg60％的乙醇，第2次加600kg60％的乙醇，滤过，合并提取液；(2)对步骤(1)制得的合并提取液进行超声波处理，所述超声波的频率为40khz，处理时间为8min，制得处理的浆液；(3)将经步骤(2)处理的浆液采用超临界co2萃取，在co2流体中加入月桂醇硫酸钾、乙酸乙酯、聚山梨酯，所述月桂醇硫酸钾、乙酸乙酯、聚山梨酯的总用量为co2流体的24％，其中月桂醇硫酸钾、乙酸乙酯、聚山梨酯的重量配比为2:1.6:2.5，控制萃取压力为30mpa，萃取温度为55℃，co2流量为23l/h，萃取时间为2.6h，得到粗品a，将粗品a与浆液分离，分离压力为10mpa，分离温度为48℃；剩余浆液再次采用超临界co2萃取，在co2流体中加入丁酮、月桂醇硫酸钾，所述丁酮、月桂醇硫酸钾的总用量为co2流体的14％，其中丁酮、月桂醇硫酸钾的重量配比为2.3：0.8，控制萃取压力为35mpa，萃取温度为58℃，co2流量为25l/h，萃取时间为1.5h，得到粗品b，将粗品与浆液分离，分离压力为9mpa，分离温度为45℃，将所得粗品a和粗品b混合，添加盐酸，所述盐酸的浓度为24％，用量为粗品a和粗品b总量的12％，调节ph值为4.2，离心分离，得到分离液；(4)将步骤(3)制得的分离液过d101大孔吸附树脂，先用水洗脱至无色，将此水洗脱液弃去，再用70％的乙醇洗脱至无色，收集此70％乙醇洗脱液，回收乙醇，真空干燥，即得提取物。将此提取物加5倍量水使混悬，用水饱和的正丁醇萃取4次，每次正丁醇的用量与样品体积相等，合并正丁醇层，回收正丁醇后，真空干燥，即得到具有神经保护功能的玄参总酚提取物。该提取物用于制备具有神经保护功能的药物中，所述的药物剂型为软胶囊剂。对比例1制备方法与实施例3基本相同，唯有不同的是步骤(3)中缺少在co2流体中加入月桂醇硫酸钾、乙酸乙酯、聚山梨酯的操作步骤；步骤(3)中缺少添加盐酸，调节ph值为4.2的操作步骤。对比例2制备方法与实施例3基本相同，唯有不同的是在步骤(3)中缺少在co2流体中加入月桂醇硫酸钾、乙酸乙酯、聚山梨酯的操作步骤。对比例3制备方法与实施例3基本相同，唯有不同的是在步骤(3)中缺少添加盐酸，调节ph值为4.2的操作步骤。对比例4制备方法与实施例3基本相同，唯有不同的是在步骤(3)中缺少在co2流体中加入月桂醇硫酸钾的操作步骤。对比例5制备方法与实施例3基本相同，唯有不同的是在步骤(3)中缺少在co2流体中加入乙酸乙酯的操作步骤。对比例6制备方法与实施例3基本相同，唯有不同的是在步骤(3)中缺少在co2流体中加入聚山梨酯的操作步骤。按照实施例1-3和对比例1-6所述方法制备具有神经保护功能的玄参总酚提取物，对总酚含量进行检测，结果见表1所示。表1玄参总酚含量检测结果实验项目总酚含量(％)实施例152.16实施例260.13实施例383.04对比例163.52对比例271.93对比例380.25对比例480.91对比例581.63对比例678.36由表1可知：(1)由实施例1-3的的数据可见，采用正丁醇进一步纯化处理精制替代乙醇纯化，可提高总酚的含量；由实施例3与对比例1-6的数据可见，月桂醇硫酸钾、乙酸乙酯、聚山梨酯、盐酸均能影响提取物的总酚含量，其中影响最大的是聚山梨酯。(2)由实施例3和对比例1-3的数据可见，步骤(3)中缺少在co2流体中加入月桂醇硫酸钾、乙酸乙酯、聚山梨酯的操作步骤；步骤(3)中缺少添加盐酸，调节ph值为4.2的操作步骤，在提取玄参总酚的过程中起到了协同作用；协同提高了玄参总酚含量；另外由实施例3和对比例2、4-6的数据可见，月桂醇硫酸钾、乙酸乙酯、聚山梨酯在提取玄参总酚的过程中起到了协同作用；协同提高了玄参总酚含量；这是：由于玄参总酚在co2流体中的溶解度不大，导致其提取率不高，而月桂醇硫酸钾具有表面活化性能，可使溶液充分活化；玄参总酚易溶于乙酸乙酯；聚山梨酯作为增溶剂能在水中形成胶团，可吸附玄参总酚物质而增大玄参总酚在co2流体中的溶解度，在步骤(3)中向co2流体中加月桂醇硫酸钾、乙酸乙酯、聚山梨酯，可增大玄参总酚在co2流体中的溶解，从而进一步增大玄参总酚的提取率。玄参总酚在酸性条件下稳定，在碱性条件下易氧化，步骤(3)在玄参总酚提取分离后添加盐酸，调节ph值为4.2，可防止玄参总酚被氧化，从而提高玄参总酚的纯度，进一步提高玄参总酚含量。实施例4神经保护功能应用试验pc12细胞常用于代替神经细胞的研究，去血清模型是研究神经营养因子剥夺性损伤的病理模型，鱼藤酮模型可以特异性的损伤黑质多巴胺能神经元。pc12细胞(大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞)由中国医学科学院协和医院药物研究所提供。供试品：含总酚60.13％的玄参总酚提取物(实施案例2制备的样品)。细胞培养:将置液氮中的冻存管pc12细胞取出，放入37℃下快速解冻并移入15ml离心管中，1000r/min，5min离心并弃去上清。加入5ml10％胎牛血清后重悬，移入培养瓶中，置5％co2培养箱中培养24h后换液；当细胞长至80％-90％汇合度时，先吸出培养液后，用pbs轻轻洗1遍细胞，然后用0.25％胰酶消化3min，待细胞完全消化后用10％胎牛血清的培养基终止消化，离心并弃去上清，用完全培养基(含10％es的mem/f-12和10％fbs)重悬，稳定培养3代后，按6×107l-1的细胞浓度铺板，待细胞贴壁24h后用于实验。去血清模型细胞制备：将完全培养基换成无血清培养基。鱼藤酮模型细胞制备：用4μmol/l鱼藤酮的完全培养基干预24h。分组：将种好的96孔板除去边缘孔外，分8组培养，每组6孔，设对照组、模型组和模型加药物组，其中模型加药物组分别加入10、100和1000mg/l的供试品，预处理30min。mtt法检测细胞活性：在药物处理终止时，每孔加入100μlmtt液(0.5g/l，溶于dmem)，放在5％co2、37℃的培养箱里2-4h，然后用排枪将液体吸出，再加入dmso100μl，充分振荡3min。用酶标仪在570nm波长处检测样品的吸光度。细胞相对存活率＝(实验组平均od值/对照组平均od值)x100％。结果：见表2和表3。表2去血清模型筛选结果组别剂量/浓度细胞存活率空白对照组/100.0±1.06模型组/64.7±3.89###玄参总酚提取物10mg/l33.5±4.77玄参总酚提取物100mg/l40.2±6.12玄参总酚提取物1000mg/l79.8±7.32***表3鱼藤酮模型筛选结果组别剂量/浓度细胞存活率空白对照组/99.4±2.74模型组/54.2±4.42###玄参总酚提取物10mg/l30.6±3.83玄参总酚提取物100mg/l61.3±4.08**玄参总酚提取物1000mg/l66.9±4.12***由表2和表3的数据可知，经鱼藤酮干预和去血清后，pc12细胞存活率均显著降低(p﹤0.01)。与模型组比较，去血清模型中，10和100mg/l玄参总酚提取物的细胞存活率没有明显变化，1000mg/l玄参总酚提取物的细胞存活率显著升高(p﹤0.01)；而在鱼藤酮模型中，100mg/l玄参总酚提取物组能明显提高细胞存活率(p﹤0.05)，1000mg/l玄参总酚提取物组能显著升高细胞存活率(p﹤0.01)。说明了一定含量浓度的玄参总酚提取物对神经具有保护功能。对比例7与实施例4测试方法一致，唯有不同的是供试品采用实施例1的供试品，浓度为1000mg/l，采用鱼藤酮模型处理，检测筛选结果。对比例8与实施例4测试方法一致，唯有不同的是供试品采用浓度为1000mg/l，含总酚45％的玄参总酚提取物，采用鱼藤酮模型处理，检测筛选结果。对比例9与实施例4测试方法一致，唯有不同的是供试品采用浓度为1000mg/l，含总酚35％的玄参总酚提取物，采用鱼藤酮模型处理，检测筛选结果。对比例10与实施例4测试方法一致，唯有不同的是供试品采用浓度为1000mg/l，含总酚25％的玄参总酚提取物，采用鱼藤酮模型处理，检测筛选结果。结果：见表4。表4鱼藤酮模型筛选结果组别剂量/浓度细胞存活率实施例41000mg/l66.9±4.12***对比例71000mg/l65.1±3.16对比例81000mg/l52.7±2.28对比例91000mg/l48.4±3.76对比例101000mg/l41.1±5.12由表4的数据可知，在鱼藤酮模型中，均采用浓度为1000mg/l，含总酚52.16％以上的玄参总酚提取物可以提高细胞存活率，而含总酚在45％以下的玄参总酚提取物明显降低细胞存活率，说明了采用浓度为1000mg/l，含总酚52.16％以上的玄参总酚提取物可以对神经具有较为明显的保护功能。以上内容不能认定本发明具体实施只局限于这些说明，对于本发明所属
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明由所提交的权利要求书确定的专利保护范围。当前第1页12