一种用于防治鱼类肝脏炎症的药物组合物的制作方法

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种用于防治鱼类肝脏炎症的药物组合物。

背景技术：

当前我国水产养殖业快速发展，我国水产养殖总产量已居世界第一。然而，高密度和集约化养殖模式下投饲过量易造成水质恶化、环境污染等，进而造成水产动物免疫能力下降，鱼病频发。调查表明，鱼类大多数的疾病是由病原微生物或水质恶化引起的，且伴随着鱼类肝脏炎症或损伤的发生。肝脏是鱼体重要实质器官，参与消化、吸收、代谢、解毒和免疫等多种功能，肝脏损伤后对鱼类生长和抗病影响较大，导致鱼类营养代谢失调，饵料系数增大，免疫系统紊乱，抗病能力下降，易暴发大规模传染性疾病。目前发现鱼类肝损伤综合症已在淡水养殖中较普遍，流行时间为4-10月，表现出两个发病高峰，主要危害鲤、草鱼、鲫鱼、团头鲂、罗非鱼等。鱼类肝损伤常伴有出血、烂鳃、肠炎等症状，死亡率可达60％-90％，损失巨大，严重制约了鱼类养殖的快速发展。因此，水产养殖中保护和避免鱼类肝脏炎症或损伤对于防控鱼病发生至关重要。

氟苯尼考属于氯霉素类药物，又叫做氟甲飒霉素，是一种新型的抗革兰氏阳性菌和阴性菌的广谱抗菌药物。氟苯尼考的作用机理与氯霉素相同，是通过与细菌核糖体50s亚基上的a位结合，抑制肽基转移酶的活性，从而干扰蛋白质的合成。氟苯尼考是四种通过了美国fda认证的抗菌药物之一，可用作饲料添加剂，目前主要用于防治细菌性疾病。氟苯尼考以其体内分布广泛、吸收好、抗菌谱广及在机体内残留比较低和动物专用等特点，在国内外畜牧和水产上迅速获得广泛的认可和应用。养殖业，特别是在水产养殖业中氟苯尼考的大量使用，不可避免的带来了一系列环境和社会问题，如细菌耐药的加剧、水产品药物残留超标等。另外，氟苯尼考对水产动物的免疫系统具有一定的毒理作用，研究表明40mg/kg的氟苯尼考可降低鱼细胞和淋巴细胞的增殖，抑制多形核嗜中性粒细胞和单核细胞的嗜菌能力。氟苯尼考对原核生物和真核生物也有一定的毒性，这说明氟苯尼考不仅影响水产动物健康，也影响养殖水环境的平衡。目前国内外的研究都是针对氟苯尼考的单独使用，其联合用药对动物疾病方面的治疗效果的报道较少。因此，寻找更为高效安全的用药方法显得尤其重要。

近年来，通过小分子代谢物调节鱼体天然免疫，已被证明是一种有效的防治鱼类细菌性疾病的新策略。天冬氨酸是鱼类的前体氨基酸和重要的代谢底物之一，也是合成嘌呤核苷酸的重要底物，其衍生的代谢物可以调节鱼类免疫系统的功能，包括增强吞噬作用和细菌杀灭能力。天冬氨酸可以提高一些鱼类食物的诱食性，也可以在一定程度上增加养殖水产动物的摄食量，使养殖鱼的生长率加快，提高养殖的经济效益，如泥鳅、虹鳟、牙鲷等。最近有研究表明，氟苯尼考也具有很好的抗炎作用，能够抑制il-1β、il-8和il-10等因子的分泌，但其作用机制尚不清楚。

本发明将天冬氨酸和氟苯尼考联合使用作为一种新型的防治鱼类肝脏炎症药物，可以提高药物预防及治疗效果，延长药物在鱼体内的作用时间，缓解鱼体肝脏炎症的发生，从而大幅提高鱼体的存活率。

技术实现要素：

本发明解决的技术问题是提供了一种更加高效的用于防治鱼类肝脏炎症的药物组合物，该药物组合物能够有效预防和治疗病原引起的鱼类细菌性疾病，相比于市面现有的抗菌药物组合物，本发明不仅能够有效提高药物的治疗效果，延长药物在鱼体内的作用时间，同时还具有缓解鱼体肝脏炎症的功效。

本发明为解决上述技术问题采用如下技术方案，一种用于防治鱼类肝脏炎症的药物组合物，其特征在于所述药物组合物的有效成分包含天冬氨酸和氟苯尼考，其中天冬氨酸与氟苯尼考的质量比为0.025-20:1。

进一步优选，所述药物组合物中天冬氨酸与氟苯尼考的质量比为0.25-10:1。

进一步优选，所述药物组合物中天冬氨酸作为增效剂用于显著增加氟苯尼考的抗菌活性。

进一步优选，所述药物组合物中天冬氨酸作为增效剂用于提高氟苯尼考清除组织细菌的能力。

进一步优选，所述天冬氨酸与氟苯尼考联合作为饲料添加剂用于增强鱼体的抗细菌感染能力。

进一步优选，所述药物组合物中天冬氨酸作为增效剂用于增强氟苯尼考在鱼体内吸收，进而延长药物在鱼体内的作用时间。

进一步优选，所述天冬氨酸与氟苯尼考联合作为饲料添加剂用于降低鱼体炎症反应，进而缓解鱼体肝脏损伤症状。

进一步优选，所述药物组合物在防治由病原微生物或水质恶化引起的鱼类肝脏炎症或损伤疾病中的应用。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

1、在治疗鱼类细菌性疾病时，具有更高的抗菌活性，可有效降低药物添加量，降低生产成本；

2、在预防鱼类细菌性疾病时，能明显增强鱼类免疫力和抗病力，提高鱼体存活率；

3、增强药物在鱼体内的吸收及作用时间，有效减少给药次数；

4、从机体和病原两个角度进行疾病防控，即缓解肝脏炎症反应，又有效杀灭病原，克服了单一产品长期使用带来的耐药问题，减少药物残留和对环境的破坏；

5、本发明制备方法简单易行，安全高效，可用于动物养殖的各个周期，可以预见该药物不仅可预防细菌性疾病，对其他生物因素或环境因素导致的鱼类肝胆综合症均有一定的防治效果。

附图说明

图1是天冬氨酸联合氟苯尼考处理后的细菌存活率；

图2是天冬氨酸联合氟苯尼考给药后鱼体血液及组织的细菌含量；

图3是液相色谱-质谱联用仪检测鲤血浆中氟苯尼考的含量；

图4是天冬氨酸联合氟苯尼考给药后鱼体的累积死亡率；

图5是不同药物处理后细菌感染的组织病理观察。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明的上述内容做进一步详细说明，但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发明的范围。

实施例1

天冬氨酸增强氟苯尼考的体外抗菌活性

材料和方法

以嗜水气单胞菌为研究对象，细菌接种于lb培养基中，28℃恒定振荡16h。取适量的菌液，于8000rpm离心5min，菌体用0.85wt％生理盐水洗涤2次，最后用m9培养基(含10mm乙酸钠、1mm硫酸镁、0.1mm氯化钙)悬浮，并调od600值至0.6。在试管中加入含菌液的m9培养基、80μg/ml氟苯尼考、17-532μg/ml天冬氨酸，使总体系为5ml。试管于28℃摇床中孵育6h。取100μl样品进行10倍梯度稀释，每一个稀释浓度取10μl于固定lb平板中点板，12h后进行菌落计数，计算处理后的细菌存活率。

试验结果

试验结果见图1，从图中可以发现，与单独使用80μg/ml氟苯尼考相比，添加天冬氨酸后试管中细菌存活率显著下降，17-532μg/ml天冬氨酸能使氟苯尼考的抗菌活性增强2.8倍、4.5倍、7.2倍、13.8倍、24.6倍和69.0倍。同时也发现，药物组合物中天冬氨酸没有直接杀灭细菌的能力，但是能够显著增强氟苯尼考的药效。

实施例2

天冬氨酸促进氟苯尼考对体内细菌的清除能力

材料和方法

取健康黄河鲤(50±5g)，腹腔注射100μl1×10⁷cfu/ml嗜水气单胞菌进行感染，感染后1h，鱼随机分为4个组，分别为生理盐水对照组，10mg/kg天冬氨酸，25mg/kg氟苯尼考，10mg/kg天冬氨酸联合25mg/kg氟苯尼考，每尾口服100μl上述药物。药物处理24h后，取鱼体血、肝、脾、肾组织，按组织重量加入适量的生理盐水，研磨匀浆制备成10wt％组织液体，血液直接稀释之后进行点板，计算血液及组织细菌数。

试验结果

试验结果见图2，细菌计数结果表明，单独使用氟苯尼考并没有明显降低血液及组织的细菌含量，而使用天冬氨酸及天冬氨酸联合氟苯尼考后，血液及组织的细菌含量显著下降，特别是天冬氨酸与氟苯尼考联合药物组，细菌含量下降达15-1000倍。这说明天冬氨酸联合氟苯尼考治疗后，能有效的清除机体内的细菌含量。同时，天冬氨酸单独作用也能降低细菌含量，联合实施例1的结果，说明天冬氨酸不是直接针对病原，而是针对宿主，可能是通过提高宿主的免疫系统达到杀灭细菌的作用。在实施例2中，给药方式是通过单次口服来给药的，结果表明联合用药能显著清除体内细菌含量，而在养殖过程中的给药周期一般为5-7天，每天1-2次，这说明联合用药可增强药物的药效，减少给药次数，这使得水产养殖中使用该药更加经济、简便、高效。

实施例3

天冬氨酸增强氟苯尼考在鱼体内吸收，进而延长药物在鱼体内的作用时间

材料和方法

检测氟苯尼考在鲤中的药代动力学曲线，选取健康黄河鲤(50±5g)，口服25mg/kg氟苯尼考或10mg/kg天冬氨酸联合25mg/kg氟苯尼考药物，在不同时间点抽血，用acqμityμplc系统(waters)检测鲤血浆中氟苯尼考的浓度。色谱柱为acqμityμplcbehc18柱(1.7μm，50mm×2.1mm)，流动相由乙腈(洗脱液a)和体积分数0.1％的甲酸水溶液(洗脱液b)组成，流速为0.3ml/min。分离在40℃下进行，色谱分离梯度洗脱程序：0-1分钟，5％洗脱液a；1-4分钟，线性增加至90％洗脱液a；4-6分钟，5％洗脱液a。使用配有电喷雾电离源(esi)的三重四极杆质谱仪进行质谱分析。负离子模式(es-)扫描，毛细管电压为3.3kv，锥电压为30v，碰撞能为19ev，离子源温度为120℃，去溶剂温度为500℃。使用masslynxv4.1软件和qμanlynx程序(waters)进行数据采集。

试验结果

试验结果见图3，鱼体血浆中氟苯尼考浓度-时间曲线见图3，在氟苯尼考与天冬氨酸联合用药后，1小时达到最大浓度(cmax)，分别为5565ng/ml和12600ng/ml，24小时血药浓度分别为48ng/ml和152ng/ml。从图中可以看出，联合用药组血浆氟苯尼考浓度明显高于氟苯尼考组，这说明联合用药组中，天冬氨酸可增强鱼体中氟苯尼考的吸收，同时，结果还发现联合用药48小时后血药浓度仍然大于单独用药后24小时的血药浓度(虚线表示)。这说明联合用药可增强药物的吸收，延长药物在鱼体内的作用时间，从而减少养殖过程中的给药次数。

实施例4

天冬氨酸联合氟苯尼考增强鱼体对病原感染的抵御能力

材料和方法

黄河鲤由河南师范大学水产养殖基地提供，并在养殖基地开展药物防治效果试验。健康鲤随机分为4组，每组20尾。按1kg鱼体重拌喂10mg天冬氨酸(天冬氨酸组)，或20mg氟苯尼考(氟苯尼考组)，或15mg天冬氨酸与25mg氟苯尼考(联合用药组)，对照组为正常饵料。每天早晚投喂二次。连续投喂5天后，注射100μl5×10⁷cfu/ml嗜水气单胞菌进行攻毒。在72h内观察鱼体的死亡情况，每隔12h查看一次并记录死亡数，统计鱼体累积死亡率，并按公式：保护率＝[1-(给药组死亡率/对照组死亡率)]×100％计算相对保护率。

试验结果

试验结果见图4，连续拌喂5天不同组别药物后，与单独氟苯尼考及单独天冬氨酸组相比较，实施例4中联合用药组的累积死亡率从60％和30％下降到10％，即联合用药组保护率从33％和67％提高到89％。试验结果表明，联合用药组大大提高了鱼体对嗜水气单胞菌感染的预防效果。

实施例5

天冬氨酸与氟苯尼考联合用药降低鱼体炎症反应，缓解鱼体肝损伤症状

材料和方法

选取健康黄河鲤(50±5g)，随机分为5组，不作处理的为空白组，投喂正常饵料为对照组，按1kg鱼体重拌喂10mg天冬氨酸为天冬氨酸组，拌喂20mg氟苯尼考为氟苯尼考组，拌喂15mg天冬氨酸与25mg氟苯尼考为联合用药组。每天早晚投喂二次。连续投喂5天后，后四组分别注射100μl5×10⁷cfu/ml嗜水气单胞菌进行攻毒，细菌感染24h后取鲤肝脏组织。组织匀浆后先用生理盐水稀释成1wt％组织匀浆，再用蛋白定量试剂盒测组织样本中的蛋白含量(考马斯亮蓝法)。谷草转氨酶(ast/got)、谷丙转氨酶(alt/gpt)、乳酸脱氢酶(ldh)、总超氧化物歧化酶(t-sod)、丙二醛(mda)和过氧化氢酶(cat)酶活性检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所。同时，进行病理学组织切片观察。

试验结果

试验结果见表1和图5，从表1可以看出，嗜水气单胞菌感染鱼体后，鱼体肝脏组织的谷丙转氨酶、谷草转氨酶、乳酸脱氢酶和过氧化氢酶显著升高，而超氧化物歧化酶和丙二醛表现显著下调，这些酶的活性变化说明鱼体的氧化水平呈现整体增加的趋势。组织病理切片结果也说明鱼体呈现过量的炎症反应，肝脏组织发生严重损伤，见图5。氟苯尼考作为一种抗菌药物，单独使用时也具有一定抑制炎症反应的作用，能抑制谷丙转氨酶和乳酸脱氢酶的升高，以及超氧化物歧化酶的下降。本发明还发现天冬氨酸能抑制细菌感染导致的炎症反应。与对照组相比，天冬氨酸与氟苯尼考联合用药处理后肝脏谷丙转氨酶、谷草转氨酶、乳酸脱氢酶和超氧化物歧化酶4种酶活均恢复到正常水平，且过氧化氢酶表现显著下降，丙二醛含量显著上升，表明联合用药处理能抑制鱼体炎症反应的发生。图5的组织病理观察结果与酶活数据表现一致，这些结果说明天冬氨酸与氟苯尼考联合用药具有显著抑制嗜水气单胞菌感染引起的氧化应激作用，这可能是联合药物具有防治鱼类肝脏炎症的作用机理。

表1鲤肝脏组织中炎症反应相关酶活性

*表示差异显著(p<0.05)，**表示差异极显著(p<0.01)

以上实施例描述了本发明的基本原理、主要特征及优点，本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明原理的范围下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进均落入本发明保护的范围内。