一种柯萨奇B3病毒感染导致的心脏微血管病变的靶向治疗药物的制作方法

本发明涉及生物医药技术领域，具体地说，是一种柯萨奇b3病毒感染导致的心脏微血管病变的靶向治疗药物。

背景技术：

血管内皮细胞对于血管结构完整及维持其正常生理功能的重要性日益受到重视。研究发现，心脏微血管病变是病毒性心肌炎及扩张型心肌病(vmc&dcm)等众多心血管疾病的起始过程和共同通路。病毒感染等危险因素通过对内皮细胞的损伤启动或加重了这些疾病的病理过程并贯穿始终。因此，在心脏微血管病变时做到早期诊断并积极干预治疗，及时阻断致病因子向靶器官迁移的路径，对于预防或治疗包括病毒性心肌炎在内的多种心血管疾病的发生和发展具有重要意义。

很多病毒都可引起心肌炎，尤其以柯萨奇b组病毒是致心肌炎的最主要病毒。长期以来，由病毒感染引发的病毒性心肌炎和扩张型心肌病缺乏有效的干预治疗手段。研究证明，心脏微血管病变是病毒性心肌炎及扩张型心肌病等多种心血管疾病的起始过程和共同通路，病毒感染等危险因素通过对微血管内皮细胞的损伤启动或加重了这些疾病的病理过程并贯穿始终。先前的研究证实，柯萨奇b3病毒(cvb3)感染导致心脏微血管内皮细胞(cmvecs)凋亡，致其功能受损。近年来的研究表明mirnas参与心血管系统的发育、分化和病理过程，其在心血管疾病中的调控作用日益受到重视。近期研究发现，体外培养的cmvecs感染cvb3后，mirna21表达显著上调、caspase-3活性上升、细胞凋亡显著增加；而抑制由cvb3诱导的cmvecs中mirna21异常高表达，能下调cmvecscaspase-3活性和cmvecs凋亡。进一步研究提示，cvb3诱导cmvecs凋亡是通过对mirna21-pdcd4-ap1负反馈调节环的调控进而激活下游炎症反应实现的。同时，我们发现病毒性心肌炎模型小鼠外周血及临床诊断为病毒性心肌炎的病人外周血内mirna21表达均显著上升。因此，mirna21可能是病毒性心肌炎及扩张型心肌病等心血管疾病病理过程中一个重要的靶点，通过抑制剂靶向结合mirna21，抑制其对靶基因的基因沉默效应，提高靶基因表达水平，抑制下游炎症反应，下调心脏微血管内皮细胞凋亡，从而达到保护靶器官目的，可能是病毒性心肌炎等心血管疾病的一种治疗手段。

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技术实现要素：

本发明的第一个目的是针对现有技术中的不足，提供一种柯萨奇b3病毒感染导致的心脏微血管病变的靶向治疗药物。

本发明的第二个目的是针对现有技术中的不足，提供mirna21的抑制剂在制备治疗心脏微血管病变的药物中的应用。

本发明的第三个目的是针对现有技术中的不足，提供mirna21的抑制剂在制备治疗病毒性心肌炎的药物中的应用。

为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：

一种柯萨奇b3病毒感染导致的心脏微血管病变的靶向治疗药物，所述靶向治疗药物为mirna21antagomir，其核苷酸序列为5’-ucaacaucagucugauaagcua-3’。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：

mirna21的抑制剂在制备治疗心脏微血管病变的药物中的应用，所述mirna21的抑制剂为mirna21antagomir，其核苷酸序列为5’-ucaacaucagucugauaagcua-3’；所述心脏微血管病变是指柯萨奇b3病毒感染所致的心脏微血管损伤。

为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：

mirna21的抑制剂在制备治疗病毒性心肌炎的药物中的应用，所述mirna21的抑制剂为mirna21antagomir，其核苷酸序列为5’-ucaacaucagucugauaagcua-3’；所述药物上调pdcd4蛋白表达水平，抑制下游炎症因子表达，改善心脏微血管病变，阻断致病因子迁移路径，达到改善心肌炎心肌组织病变程度，保护靶器官的目的。

在上述药物或应用中，其中所述药物除包含mirna21antagomir抑制剂，还可以包含药物学上常见的药物载体，其中所述载体是注射溶媒、等渗调节剂、ph调节剂、稳定剂、保护剂等。

所述药物可以制备成常见的剂型，例如注射剂、颗粒剂、片剂、胶囊、气雾剂等，优选所述剂型为注射剂。其中注射剂可以是溶液型、混选型、或乳剂型，可以通过皮下注射、肌肉注射、静脉注射或静脉滴注的方式给药。

注射溶媒选自注射用水、注射用油、乙醇、甘油、聚乙二醇等；所述等渗调节剂选自氯化钠、氯化钾、葡萄糖、碳酸氢钠、乳酸钠、甘油等，氯化钠常规浓度范围一般为0.5-0.9％，葡萄糖浓度范围一般为4-5％，甘油浓度范围一般为2.25％左右；所述的ph调节剂选自乳酸、柠檬酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸、碳酸钠、碳酸氢钠等，乳酸的浓度范围一般为0.1％左右，柠檬酸的浓度一般为0.5％左右，磷酸氢二钠和磷酸二氢钠的浓度一般为1.7％和0.71％左右，碳酸钠、碳酸氢钠的浓度一般为0.06％和0.005％左右；所述稳定剂选自肌酐、甘氨酸、肌酐的浓度一般为0.5-0.8％，甘氨酸的浓度一般为1.5-2.25％；所述保护剂选自乳糖、蔗糖、麦芽糖、人血白蛋白，乳糖的浓度一般为2-5％，蔗糖的浓度一般为2-5％，麦芽糖的浓度一般为2-5％，人血白蛋白浓度一般为0.2-2％。

本发明使用化学合成的专门针对心脏微血管内皮细胞中高表达mirna21的抑制剂，特异地靶向高表达mirna21分子，削弱内源性mirna21的基因沉默效应，通过提高靶基因蛋白表达量及对相关信号通路的调节，抑制血管内皮细胞凋亡，维持微血管正常生理功能。包括以下两个基本步骤：

1、mirna21antagomir抑制剂合成。采用化学修饰法，由广州锐博生物科技有限公司合成。2、mirna21antagomir抑制剂体内转染心脏微血管内皮细胞。所用主要仪器为：esco生物安全柜；日本奥林巴斯相差倒置显微镜；thermo高速冷冻离心机；美国bio-rad公司tetra蛋白电泳系统、geldoc^tmxr+图像处理系统。

小鼠模型体内实验验证了体外细胞实验的结果，进一步表明在病毒性心肌炎模型小鼠体内转染mirna21antagomir抑制剂能有效上调靶基因pdcd4蛋白表达水平，抑制下游炎症因子表达，改善心脏微血管病变，阻断致病因子迁移路径，从而达到改善心肌炎心肌组织病变程度，保护靶器官的目的。

本发明可用于治疗柯萨奇b3病毒感染所致心脏微血管病变，阻断致病因子向靶器官迁移，减轻心肌组织病变，为病毒性心肌炎干预提供一种治疗药物，也可为病毒性心肌炎等心血管疾病的干预提供一种新的药物。

本方法采用特殊设计的mirna21antagomir抑制剂，通过与体内的成熟mirna21竞争性结合，阻止mirna21与其靶基因mrna的互补配对，抑制mirna21对靶基因的沉默作用，抑制炎症反应，保护靶器官。具有使用方便、特异性强、转染效率高、对靶器官毒性较小等特点。

附图说明

附图1：尾静脉注射mirna21antagomir(100nmol/只)。

附图2：各组小鼠外周血ctni定量检测结果。

附图3：各组小鼠外周血tnf-a定量检测结果。

附图4：各组小鼠外周血il-17定量检测结果。

附图5：各组小鼠心肌组织he染色结果(200×)。

附图6：各组小鼠心肌组织he染色结果(400×)。

附图7：各组小鼠心肌组织tunnel染色结果(200×)。

附图8：各组小鼠心肌组织tunnel染色结果(400×)。

附图9-13：各组小鼠心肌组织中pdcd4、caspase-3蛋白表达结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例：

mirna21antagomir抑制剂通过抑制高表达mirna21,保护病毒性心肌炎模型小鼠心脏微血管，改善心肌炎心肌组织病变的作用。

一、病毒性心肌炎小鼠模型建立

1、病毒的传代和滴定

柯萨奇b3病毒(cvb3)(nancy株，本实验室保存)在vero细胞上传代复制，收获病毒后在hela细胞上测定病毒毒力，以reed法计算tcid50。

2、实验动物及分组

balb/c清洁级小鼠56只，4-5周龄、雄性、12-15g体重，由上海斯莱克实验动物有限公司提供。小鼠随机分为病毒对照组(n＝10)，正常对照组(n＝6)，mirna21agomir组(n＝10)，mirna21agomirnegativecontrol组(n＝10)，mirna21antagomir组(n＝10)，mirna21antagomirnegativecontrol组(n＝10)。

3、mirna21agomir及阴性对照和mirna21antagomir及阴性对照由广州锐博生物科技有限公司合成。mirna21antagomir序列(5’to3’)为：ucaacaucagucugauaagcua。

4、小鼠造模

病毒对照组、mirna21antagomir组、mirna21antagomirnegativecontrol组小鼠每只腹腔注射0.1ml100tcid50的cvb3病毒液；mirna21agomir组、mirna21agomirnegativecontrol组、正常对照组小鼠每只腹腔注射0.1ml无血清mem培养液。

实验小鼠均由复旦大学实验动物科学部提供饲养服务。

二、mirna21agomir和mirna21antagomir注射及取材

mirna21agomir组和mirna21agomirnegativecontrol组小鼠在造模第一天同时分别尾静脉注射mirna21agomir和mira21agomirnegativecontrol，20nmol/只，注射体积0.1ml/只，连续注射3天；mirna21antagomir组和mirna21antagomirnegativecontrol组小鼠在注射病毒第一天同时分别尾静脉注射mirna21antagomir和mirna21antagomirnegativecontrol，100nmol/只，注射体积0.1ml/只，连续注射3天。(图1)

小鼠造模后常规饲养15天，眼球取血后断颈处死，取出小鼠心脏，切取1/3组织放入1ml，10％中性甲醛固定，2/3组织液体氮速冻后转存入-80℃冰箱待用。

三、结果与评价

1、小鼠注射病毒后第3天出现死亡，至第15天，病毒对照组存活6只，存活率60％，正常对照组存活6只，存活率100％，mirna21agomir组存活6只，存活率60％，mirna21agomirnegativecontrol组存活10只，存活率100％，mirna21antagomir组存活8只，存活率80％，mirna21antagomirnegativecontrol组存活5只，存活率50％。

2、各组小鼠外周血ctni、tnf-a、il-17定量检测(结果见图2、图3、图4)。

小鼠外周血ctni、tnf-a、il-17定量检测elisa试剂盒均购自上海威奥生物科技有限公司，按说明书操作。

3、各组小鼠心肌组织he染色、tunnel染色(结果见图5、图6、图7、图8)。

he染色采用本实验室常规方法进行。tunnel染色采用promega公司试剂盒，按试剂盒说明书操作。

4、心肌组织中pdcd4、caspase-3蛋白表达(结果见图9、图10、图11、图12、图13)

动物实验提示，小鼠感染cvb3后进行尾静脉注射mirna21antagomir100nmol/次/只，连续注射3天，有明显保护心脏微血管，减轻病毒性心肌炎心肌病变的作用。对于临床诊断符合病毒性心肌炎诊断标准且外周血mirna21升高的病人，由临床医生依据病情决定是否需要使用该抑制剂。该抑制剂可由进行静脉注射给药。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

sequencelisting

<110>复旦大学附属中山医院

<120>一种柯萨奇b3病毒感染导致的心脏微血管病变的靶向治疗药物

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<170>patentinversion3.3

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<213>人工合成

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