治疗嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法的副作用的方法与流程

本发明涉及治疗嵌合抗原受体(car)t细胞疗法的副作用。
背景技术：
：免疫疗法是一种生物疗法，旨在改善受试者的天然免疫系统以抵抗疾病。通常，免疫疗法是指癌症免疫疗法。癌症免疫疗法的一个发展领域是过继细胞转移(act)，过继细胞转移中将t细胞分离，工程化以识别和攻击癌细胞，然后扩增并重新引入患有癌症的受试者。这可能涉及分离和工程化受试者自身的t细胞以进行自体act，但也正在研究将供体t细胞用于同种异体(有时称为同源)act。对于act，将t细胞或nk细胞工程化为表达可识别在癌细胞上表达的抗原的受体。所述受体可以是t细胞受体(tcr)或嵌合抗原受体(car)。表达car的t细胞被称为cart细胞。迄今为止，尽管对实体瘤的试验非常有限，但act和cart细胞疗法已主要用于血液癌，并且仅限于小型临床试验。尽管如此，cart细胞疗法在晚期癌症受试者中已展现出印象深刻的反应。已经受cart细胞疗法(通常使用针对cd19(b细胞上存在的一种细胞表面抗原)的car)的癌症包括急性成淋巴细胞性白血病(all)、慢性淋巴细胞性白血病(cll)、一些类型的非霍奇金淋巴瘤(nhl)(包括弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)和滤泡性淋巴瘤)、以及多发性骨髓瘤。cart细胞疗法尽管具有前景，但并非没有副作用和重大风险。观察到的副作用包括与巨噬细胞活化综合征(mas)有关的细胞因子释放综合征(crs)，靶标上的癌外效应(其导致类似于移植物抗宿主病(gvhd)和b细胞发育不全的结果)，肿瘤溶解综合征(tls)，神经毒性(如脑水肿)，和由受试者的对包括非人抗原的car的igg反应引起的过敏反应。已经用包括类固醇在内的标准支持疗法治疗crs。但是，类固醇可影响受试者的cart细胞活性或增殖。crs的另一种疗法是给予在crs中升高的促炎症细胞因子的抑制剂。抗il-6受体抗体托珠单抗和tnf抑制剂依那西普已被用于治疗crs。导致抗体产生减少的b细胞发育不全已通过静脉注射免疫球蛋白来治疗以防止感染。已通过标准支持疗法管理tls，所述标准支持疗法包括水合、利尿、给予别嘌呤醇和重组尿酸氧化酶，以及根据需要进行血液透析。尽管这些副作用得到了不同程度的成功管理，但还没有完全成功，在许多临床试验中，不良事件有规律地发生，并且甚至有受试者死亡。显然，需要针对act副作用的改善的预防和/或疗法，特别是cart细胞疗法。应当理解，如果本文提到了任何现有技术公开案，则这一参考文献在澳大利亚或任何其他国家并不构成承认所述公开案构成本领域一般常识的一部分。技术实现要素：第一方面提供了一种用于治疗cart细胞疗法的副作用的方法，所述方法包括向已经或正在接受cart细胞疗法的受试者给予间充质干细胞(msc)。第一方面的替代或另外的实施方案提供了间充质干细胞(msc)在制造药物中的用途，所述药物用于在已经或正在接受cart细胞疗法的受试者中治疗cart细胞疗法的副作用。第一方面的另外的替代或另外的实施方案提供了一种间充质干细胞(msc)，其用于在已经或正在接受cart细胞疗法的受试者中治疗cart细胞疗法的副作用。在一个实施方案中，所述msc具有cd73+cd105+cd90+cd146+cd44+cd10+cd31-cd45-表型。在一个实施方案中，所述msc表达mir-145-5p、mir-181b-5p、和mir-214-3p，但不表达mir-127-3p和mir-299-5p。在一个实施方案中，治疗包括向所述受试者给予约1x106至约1x107个msc。在一个实施方案中，治疗包括在所述受试者接受所述cart细胞疗法之前、期间或之后给予一种或多种所述msc。在一个实施方案中，治疗包括在所述受试者接受所述cart细胞疗法后给予一种或多种所述msc。在一个实施方案中，治疗包括在所述受试者接受所述cart细胞疗法后24小时至72小时内给予一种或多种所述msc。在一个实施方案中，所述副作用或症状是：细胞因子释放综合征(crs)，任选地白细胞介素6(il-6)、干扰素-γ(ifn-γ)、肿瘤坏死因子(tnf)、il-2、il-2-受体α、il-8、il-10、或粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(gmcsf)的释放；巨噬细胞活化综合征(mas)；靶标上的癌外效应，任选地b细胞发育不全；肿瘤溶解综合征(tls)；神经毒性，任选地脑水肿；或过敏反应。在一个实施方案中，所述cart细胞疗法用于治疗：弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)；非霍奇金淋巴瘤(nhl)；原发性纵隔b细胞淋巴瘤(pmbcl)；慢性淋巴细胞性白血病(cll)；转化的滤泡性淋巴瘤(tfl)；多发性骨髓瘤(mm)；套细胞淋巴瘤(mcl)；急性骨髓性白血病(aml)；或急性成淋巴细胞性白血病(all)。在一个实施方案中，所述car是抗cd19car。在一个实施方案中，所述受试者是哺乳动物，任选地是人。第二方面提供了一种在哺乳动物受试者中用于治疗、改善、或减轻cart细胞疗法副作用的治疗组合物，其中所述治疗组合物包含间充质干细胞(msc)，其中通过包括以下的方法制备所述msc：(a)在含氧量正常的条件下在包含licl和fgf2但不包括pdgf的间充质细胞集落形成培养基(m-cfm)中培养原始中胚层细胞持续足够的时间以形成间充质细胞集落；以及(b)贴壁培养(a)的间充质细胞集落，以产生所述msc，其中(b)的msc表达mir-145-5p、mir-181b-5p、和mir-214-3p但不表达mir-127-3p和mir-299-5p，和/或具有表型cd73+cd105+cd90+cd146+cd44+cd10+cd31-cd45-。第三方面提供了包括第二方面的治疗组合物的容器。附图说明图1是鉴定为seqidno:7的核酸序列，其编码来自人cd28的共刺激信号传导元件，所述共刺激信号传导元件包括跨膜和细胞外部分。图2是鉴定为seqidno:8的编码人cd3ζ链胞质结构域的核酸序列。图3是实施例18的实验设计的示意图。图4是示出实施例18的对照和测试小鼠的直肠温度的图。图5是示出实施例18的对照和测试小鼠的临床得分的图。0＝正常活动；1＝正常活动，立毛，脚尖步态；2＝弯腰，活动减少，但仍可以移动；3＝运动力不足，但在激励时移动；4＝垂死，被安乐死。图6是一组图，其示出了实施例18的小鼠外周血中的小鼠cd45+细胞百分比、人cd45+细胞百分比、cd4+细胞(作为占人cd45+细胞的百分比)、以及cd8+细胞(作为占人cd45+细胞的百分比)。图7是示出实施例18的小鼠的外周血中人cd4+t细胞上的cd69表达的一组图。图8是示出实施例18的小鼠的外周血中人cd8+t细胞上的cd69表达的图。图9是一组图，其示出了实施例18的小鼠脾脏中的小鼠cd45+细胞百分比、人cd45+细胞百分比、cd4+细胞(作为占人cd45+细胞的百分比)、以及cd8+细胞(作为占人cd45+细胞的百分比)。图10是示出实施例18的小鼠的脾脏中人cd4+t细胞上的cd69表达的一组图。图11是示出实施例18的小鼠的脾脏中人cd8+t细胞上的cd69表达的图。具体实施方式除非在本说明书中另外定义，否则本文中使用的技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常理解的相同含义，并且参考已出版的文本。应当注意的是，术语“一个”或“一种”是指一个/种或多个/种，例如，“一种msc”应当理解为代表一种或多种msc。因此，术语“一个/一种(a或an)”、“一个/一种或多个/多种(oneormore)”以及“至少一个/一种(atleastone)”在本文中可以互换使用。在本发明的随附权利要求书和描述中，除了由于表达语言或必要的暗示而使上下文另外要求之外，词语“包含(comprise)”或变化如“包含(comprises或comprising)”是以包括意义使用的，即用于指明在本发明的各种实施方案中存在所陈述的特征但是不排除存在或加入另外的特征。如本文所用的术语“约”考虑了给定数字的一系列值(此数字的±25％大小)。在其他实施方案中，术语“约”考虑了给定数字的一系列值(此数字的±20％、±15％、±10％或±5％大小)。例如，在一个实施方案中，“约3克”表示2.7克至3.3克的值(即3克±10％)等。类似地，所述事件的时间或持续时间可以变化至少25％。例如，尽管在一个实施方案中特定事件可以被公开为持续一天，但是所述事件可以持续多于或少于一天。例如，“一天”可以包括约18小时至约30小时的时段。在其他实施方案中，时间段可以在此时间段的±20％、±15％、±10％或±5％之间变化。如本文所使用的，“过继细胞转移”或“act”是指一种过程，其中将t细胞或nk细胞分离，工程化以识别特异性抗原，然后扩增并重新引入受试者。用于act的t细胞或nk细胞可以是“自体的”，源自待治疗的受试者；也可以是“同种异体的”(有时称为“同源的”)，源自供体受试者，其免疫原性特征足够相似到不会被接受act的受试者排斥。如本文所用，要在act中转移的细胞是“嵌合抗原受体t细胞”、“嵌合抗原受体nk细胞”、或“cart细胞”。如本文所用，“cart细胞”包括t细胞或nk细胞。如本文所用，“cart细胞”包括经工程化以表达car或t细胞受体(tcr)的细胞。cart细胞可以是任选地处于限定比例的t辅助cd4+和/或t效应cd8+细胞。cart细胞可包含总cd3+细胞。产生car-t细胞可以通过使用基因组整合载体(例如病毒载体，包括逆转录病毒、慢病毒或转座子)、或非基因组整合(附加型)dna/rna载体(例如质粒或mrna)来产生cart细胞。基因组整合载体是稳定的，但可能会对接受者t或nk细胞中的内源基因表达产生负面影响。附加型载体不太可能对接受者t或nk细胞中的内源基因表达产生负面影响，但不稳定，因为car表达通常在约1周内丢失。另一种附加型方法依赖于包含支架/基质附着区(s/mar)元件的非整合型慢病毒(nilv)载体。此方法具有在cart细胞中稳定维持/长期表达的益处，而无需基因组整合。car和cart细胞的产生是本领域已知的，并且描述于：(i)众多专利公开案，包括us7,446,190、us7,741,465、和us9,181,527；以及(ii)期刊出版物，包括kalos等人scitranslmed.2011,3(95):95ra73，milone等人molther.2009,17(8):1453-64，和maude等人nengljmed.2014,371(16):1507-17；以及(iii)本公开文本的实施例1至4。(i)和(ii)的每个例子均通过此交叉引用而完全并入。不希望受到理论的束缚，car可包含四个结构域：(1)靶向一种或多种特定细胞表面抗原的单链抗体可变片段(scfv)细胞外结合结构域(2)铰链结构域(3)跨膜结构域(4)触发t细胞增殖、存活和细胞因子产生的胞质信号传导结构域同样，不希望受到理论的束缚，car可能属于以下几类之一：第一代(最早)、第二代、第三代、或第四代(最新)。第一代car具有源自cd3ζ链(cd3ζ)的单个信号传导结构域。第二代car具有信号传导结构域和共刺激结构域，二者例如分别源自cd3ζ和cd28或4-1bb(cd137)。第三代car具有信号传导结构域(例如源自cd3ζ)、以及多个共刺激结构域(例如源自cd28和4-1bb(cd137))。第四代car将第二代car和另外的序列(例如激活t细胞的核因子(nfat))组合，以诱导编码细胞因子(例如il-12、或共刺激配体)的盒的表达，从而增强cart细胞的细胞杀伤能力。car所针对的相关抗原可以是例如αvβ6整合素、caix、cd19、cd20、cd22、cd30、cd33、cd138、cd171、cea、egfr、erbb(her)、erbb2(her2)、fap、叶酸受体-α、gd2、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3、il-13、κ轻链、路易斯y、间皮素、muc16、nkg2d、psma、rori(rorα)、或vegfr。适应症cart细胞可用于治疗：弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)；非霍奇金淋巴瘤(nhl)；原发性纵隔b细胞淋巴瘤(pmbcl)；慢性淋巴细胞性白血病(cll)；转化的滤泡性淋巴瘤(tfl)；多发性骨髓瘤(mm)；套细胞淋巴瘤(mcl)；急性骨髓性白血病(aml)；急性成淋巴细胞性白血病(all)。此列表并非详尽无遗。另外，cart细胞可用于治疗：b细胞恶性肿瘤；小儿或青壮年b细胞恶性肿瘤；b细胞白血病；cd19+淋巴瘤；cd19+b细胞淋巴瘤；cd19阳性恶性b细胞源性白血病或淋巴瘤；复发性或难治性cd19+淋巴瘤；难治性/复发性b细胞血液系统恶性肿瘤；同种异体干细胞移植后复发或持续的b细胞恶性肿瘤；化疗耐药或难治性all；复发性b细胞all的小儿或青壮年患者；胶质母细胞瘤；多形性胶质母细胞瘤；复发性多形性胶质母细胞瘤；cd7阳性白血病或淋巴瘤；cd30阳性淋巴瘤；egfrviii+胶质母细胞瘤；晚期肝癌；肝细胞癌；神经母细胞瘤；难治性和/或复发性神经母细胞瘤；儿童复发性或难治性神经母细胞瘤；gd2+实体瘤；小儿实体瘤；muc1阳性复发性或难治性实体瘤；乳腺癌；晚期肉瘤；癌胚抗原(cea)阳性癌症；表达cd70的癌症；复发和难治性侵袭性b细胞nhl；复发/难治性cd30+霍奇金淋巴瘤或cd30+nhl；复发性或难治性cd19+cll或小淋巴细胞淋巴瘤(sll)；恶性神经胶质瘤；复发/难治性cd33+aml；鼻咽癌；间皮素阳性晚期恶性肿瘤；复发性或转移性恶性肿瘤；不可切除的胰腺癌；转移性胰腺癌；晚期胰腺癌；晚期ror1+恶性肿瘤；复发性或难治性dlbcl；cd19阳性系统性红斑狼疮(sle)；难治性或转移性gd2阳性肉瘤；骨髓瘤；骨髓增生异常综合征；胃癌；复发性或难治性急性非t淋巴细胞白血病；表达cd5抗原的t细胞恶性肿瘤；复发性或难治性肺鳞状细胞癌；晚期肝细胞癌；gpc3阳性晚期肝细胞癌(hcc)；晚期mg7阳性肝转移；持续性/复发性原始浆细胞样树突状细胞瘤(persistent/recurrentblasticplasmacytoiddendriticcellneoplasm)；头颈癌；her2阳性恶性肿瘤；化疗难治性人表皮生长因子受体2(her-2)阳性晚期实体瘤；化疗耐药或难治性cd20+淋巴瘤；(fap)阳性恶性胸膜间皮瘤；慢性骨髓性白血病(cml)；化疗难治性egfr(表皮生长因子受体)阳性晚期实体瘤；腺癌；或1型糖尿病。在一个实施方案中，cart细胞的剂量可以是1×105个细胞/kg。在另一个实施方案中，cart细胞的剂量可以是1×1010个细胞/kg。在其他实施方案中，cart细胞的剂量可以是5x105个细胞/kg、1x106个细胞/kg、5x106个细胞/kg、1x107个细胞/kg、5x107个细胞/kg、1x108个细胞/kg、5x108个细胞/kg、1x109个细胞/kg、或5x109个细胞/kg。在一个实施方案中，cart细胞的剂量可以是1×105个细胞/m2。在另一个实施方案中，cart细胞的剂量可以是1×1010个细胞/m2。在其他实施方案中，cart细胞的剂量可以是5x105个细胞/m2、1x106个细胞/m2、5x106个细胞/m2、1x107个细胞/m2、5x107个细胞/m2、1x108个细胞/m2、5x108个细胞/m2、1x109个细胞/m2、或5x109个细胞/m2。在一个实施方案中，cart细胞的剂量可以是1×105个细胞。在另一个实施方案中，cart细胞的剂量可以是1×1010个细胞。在其他实施方案中，cart细胞的剂量可以是5x105个细胞、1x106个细胞、5x106个细胞、1x107个细胞、5x107个细胞、1x108个细胞、5x108个细胞、1x109个细胞、或5x109个细胞。可以按单剂量、分割剂量、或多剂量给予cart细胞。cart细胞的剂量将与所述靶抗原和表达所述靶抗原的靶细胞有关，并且因此可能因待治疗的适应症而异。cart细胞的剂量将根据cart细胞疗法的原则，由管理临床医生来决定。副作用和症状细胞因子释放综合征(crs)是cart细胞疗法的严重副作用。认为crs是由增殖的t细胞所致，这些增殖的t细胞释放大量细胞因子，包括白细胞介素6(il-6)、干扰素-γ(ifn-γ)、肿瘤坏死因子(tnf)、il-2、il-2-受体α、il-8、il-10、和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(gmcsf)。crs的症状包括：高烧、不适、疲劳、肌痛、恶心、厌食、心动过速/低血压、毛细血管渗漏、心功能障碍、肾损害、肝衰竭和弥散性血管内凝血。因此，患有crs的受试者可能经历发烧，心血管症状(包括心动过速、低血压、心律失常、心脏射血分数降低)，肺部症状(包括水肿、缺氧、呼吸困难、和肺部炎症)，通常由肾脏灌注减少引起的急性肾损伤，肝和胃肠道症状(包括血清转氨酶和胆红素升高、腹泻、结肠炎、恶心、和腹痛)，血液系统症状(包括血细胞减少症如3-4级贫血、血小板减少症、白细胞减少症、嗜中性粒细胞减少症、和淋巴细胞减少症，凝血紊乱-包括凝血酶原时间延长和活化部分凝血活酶时间(ptt)延长、d-二聚体升高、低纤维蛋白原、弥散性血管内凝血、巨噬细胞活化综合征(mas)、出血)，b细胞发育不全，和低丙球蛋白血症，感染性疾病(包括菌血症、沙门氏菌属、尿路感染、病毒感染(例如流感、呼吸道合胞病毒、带状疱疹病毒))，肌肉骨骼症状(包括肌酸激酶升高、肌痛和无力)，神经系统症状(包括谵妄、意识错乱、和癫痫)。类固醇和抗细胞因子疗法已用于治疗crs，抗细胞因子疗法例如依那西普、和抗tnf分子、以及抗il-6受体抗体托珠单抗。mas在临床上与crs重叠，受试者可能经历肝脾肿大、淋巴结病、全血细胞减少症、肝功能不全、弥散性血管内凝血、低纤维蛋白原血症、高铁蛋白血症、和高甘油三酯血症。像crs一样，患有mas的受试者表现出升高的细胞因子(包括ifn-γ和gmcsf)水平。靶标上的癌外效应可能导致类似于移植物抗宿主病(gvhd)和b细胞发育不全的结果，这是当靶癌抗原在其他健康/正常细胞类型上内源性表达时引起的。例如，发生b细胞发育不全是因为抗cd19car也靶向表达cd19的正常b细胞。b细胞发育不全的结果是由于低免疫球蛋白血症造成的抵抗感染能力降低。静脉免疫球蛋白替代疗法可用于预防感染。cart细胞疗法的另一种副作用是肿瘤溶解综合征(tls)，当因疗法导致细胞死亡而释放出细胞内含物时肿瘤溶解综合征发生，通常在淋巴瘤和白血病的情况下发生。tls的特征在于血液离子和代谢物失衡，并且症状包括恶心、呕吐、急性尿酸肾病、急性肾衰竭、癫痫、心律失常、和死亡。cart细胞疗法可导致神经毒性，并且症状可包括脑水肿、谵妄、幻觉、言语障碍症、运动不能性缄默症、头痛、意识错乱、觉醒改变、共济失调、失用症、面神经麻痹、震颤、辨距不良、和癫痫。过敏反应可源于非宿主蛋白，例如形成car一部分的鼠源蛋白。副作用的治疗通常，对于任何出现的症状，可通过标准支持疗法来管理cart细胞疗法的副作用。但是，鉴于cart细胞疗法可能会产生种种副作用和症状，因此可能需要同时采取多种支持疗法。间充质干细胞因此，本发明提供了一种改进的疗法，用于通过给予cart细胞和间充质干细胞(msc)来减少由cart疗法引起的副作用的数量、严重性和持续时间。msc通过其免疫调节特性发挥作用，因此对于许多副作用和症状，msc能够直接作用于副作用或症状的免疫原性原因。msc分泌生物活性分子，如细胞因子、趋化因子和生长因子，并且具有调节免疫系统的能力。已显示msc促进再生和对免疫系统产生影响而不依赖于移植。换言之，所述msc本身不一定会被纳入宿主中-相反，它们发挥它们的作用并且然后在短时期内被消除。但是，可以植入msc。如本文所用，“间充质干细胞”或“msc”是指可以从各种组织(包括骨髓、脂肪组织(脂肪)、胎盘和脐带血)中分离的特定干细胞类型。可替代地，msc可以由多能干细胞(psc)产生。msc也称为“间充质基质细胞”。为了避免疑问，如本文所用，“副作用”包括“症状”，并且这两个术语均指代定性确定的cart细胞疗法的不希望的或不良(即以任何形式的不希望的)作用，或定量确定的不希望的超出或低于特定阈值的作用。此类症状也可以称为“不良症状”，以将一种作用与cart细胞疗法的必要或期望作用区分开来。cart细胞疗法的副作用或症状也可以称为“不良事件”、“免疫介导的不良事件”或“免疫相关的不良事件”。由psc产生msc在2017年3月14日提交的国际专利申请pct/au2017/050228中有所描述，将此文献通过此交叉引用而完全并入，并在实施例5和6中进行了描述。已显示msc对t细胞、b细胞、树突细胞、巨噬细胞和自然杀伤细胞发挥免疫调节活性。虽然不希望受到理论的束缚，但潜在的机制可能包括免疫调节介质，例如一氧化氮、吲哚胺2,3-双加氧酶、前列腺素e2、肿瘤坏死因子诱导基因6蛋白、ccl-2、和程序性死亡配体1。这些介质以低水平表达直至被例如炎症性细胞因子如ifnγ、tnfα和il-17刺激。可以将msc在全身或外周给予，例如通过包括以下的途径给予：静脉内(iv)、动脉内、肌内、腹膜内、脑脊髓内、颅内、皮下(sc)、关节内、滑膜内、鞘内、冠状动脉内、经心内膜、外科手术植入、局部给予和吸入(例如肺内)。可以将msc与生物相容性材料的支架组合给予。在一个实施方案中，在给药前对msc进行预处理。预处理可以使用生长因子或通过基因编辑进行，例如，其中生长因子可以引发msc，并且基因编辑可以赋予msc新的治疗特性。如本文所用，“多能干细胞”或“psc”是指具有无限繁殖其自身并分化成任何其他细胞类型的能力的细胞。存在两种主要类型的psc：胚胎干细胞(esc)和诱导多能干细胞(ipsc)。如本文所用，“胚胎干细胞”或“esc”是指从已经完成体外受精疗法并且具有多余胚胎的受试者同意捐献的五至七日龄胚胎中分离的细胞。esc的使用在某种程度上受到关于从人胚胎中提取细胞的伦理问题的阻碍。合适的人psc包括h1和h9人胚胎干细胞。如本文所用，“诱导多能干细胞”或“ipsc”是指源自成体细胞的esc样细胞。ipsc与esc具有非常相似的特征，但是避免了与esc相关的道德问题，因为ipsc并非源自胚胎。相反，ipsc通常源自完全分化的成体细胞，所述成体细胞已被“重新编程”回到多能状态。合适的人ipsc包括但不限于源自成纤维细胞的ipsc19-9-7t、mirjt6i-mnd1-4和mirjt7i-mnd2-0，以及源自骨髓单核细胞的ipscbm119-9。其他合适的ipsc可以从美国威斯康星州麦迪逊(madison,wi,usa)的cellulardynamicsinternational(cdi)获得。在一个实施方案中，根据本发明使用的msc由原始中胚层细胞形成。所述原始中胚层细胞可具有间充质成血管细胞(mesenchymoangioblast，mca)潜能。所述原始中胚层细胞可具有emhlin-kdr+aplnr+pdgfrα+表型。在一个实施方案中，根据本发明使用的msc由具有mca潜能的emhlin-kdr+aplnr+pdgfrα+原始中胚层细胞形成。如本文所用，“具有mca潜能的emhlin-kdr+aplnr+pdgfrα+原始中胚层细胞”是指表达典型的原条和侧板/胚胎外中胚层基因的细胞。这些细胞具有响应于成纤维细胞生长因子2(fgf2)在无血清培养基中形成mca和成血管细胞集落的潜能。当根据实施例6培养时，这些细胞成为msc。术语emhlin-表示cd31、ve-钙粘蛋白内皮标记物、cd73和cd105间充质/内皮标记物、以及cd43和cd45造血标记物的表达缺失。在一个实施方案中，根据本发明使用的msc展现出cd73+cd105+cd90+cd146+cd44+cd10+cd31-cd45-表型。在一个实施方案中，根据本发明使用的msc表达微小rnamir-145-5p、mir-181b-5p、和mir-214-3p中的每一个，但不表达mir-127-3p和mir-299-5p。msc具有“免疫调节活性”，其可以在体外被评估为msc抑制t辅助(cd4+)淋巴细胞增殖的能力。可以相对于参考物在体外将免疫调节活性量化，例如使用免疫效价测定(immunopotencyassay)确定。合适的免疫效价测定使用辐照的测试msc(例如根据本文公开的方法产生的ipsc-msc)和辐照的参考样品msc，二者分别以不同的浓度与从健康供体外周血中纯化的羧基荧光素琥珀酰亚胺酯标记的白细胞一起铺板。通过添加cd3和cd28抗体来刺激代表参考样品子集的t辅助(cd4+)淋巴细胞。使用流式细胞术计数cd4标记的t细胞，以评估t细胞增殖。ic50值报告为参考样品的函数。较高的ic50值表示更大程度地抑制了t辅助(cd4+)淋巴细胞的增殖，并且因此指示优越的t细胞免疫调节特性。在用于此测定之前，对msc样品进行辐照，以消除其增殖潜力的混杂因素。本领域技术人员将理解，向受试者给予治疗有效量的msc以用于治疗受试者中cart细胞疗法的副作用或症状的确切方式将由医学从业者决定。给药方式(包括剂量、与其他药剂的联合使用、给药时间安排和频率等)可受到受试者的状病症和病史的影响。所述msc可以作为治疗组合物给予。如本文所用，术语“治疗组合物”是指包含经配制用于给予至受试者的如本文所述的msc或msc群的组合物。优选地，治疗组合物是无菌的。在一个实施方案中，所述治疗组合物是无热原的。在一个实施方案中，将所述治疗组合物提供在容器中，优选在无菌容器中，优选在无热原的容器中。在一个实施方案中，所述容器是例如适合于推注给药的注射器。在另一个实施方案中，所述容器是适合于输注的输注袋。所述msc将以符合良好医学实践的方式配制、配量和给予。在这种情况下，需要考虑的因素包括正在治疗的特定障碍类型和预期的副作用或症状、正在治疗的特定受试者、受试者的临床病症、给药部位、给药方法、给药时间表制定、和医学从业人员已知的其他因素。待给予的msc的治疗有效量将由此类考虑因素决定。msc的剂量范围可以为约103个细胞/m2至约1010个细胞/m2，例如约106个细胞/m2至约2x108个细胞/m2、或约103个细胞/m2、约5x103个细胞/m2、约104个细胞/m2、约5x104个细胞/m2、约105个细胞/m2、约5x105个细胞/m2、约106个细胞/m2、约5x106个细胞/m2、约107个细胞/m2、约5x107个细胞/m2、约108个细胞/m2、约5x108个细胞/m2、约109个细胞/m2、约5x109个细胞/m2、约1010个细胞/m2、或约5x1010个细胞/m2。msc的剂量范围可以为约103个细胞/kg至约1010个细胞/kg，例如约106个细胞/kg至约2x108个细胞/kg、或约103个细胞/kg、约5x103个细胞/kg、约104个细胞/kg、约5x104个细胞/kg、约105个细胞/kg、约5x105个细胞/kg、约106个细胞/kg、约5x106个细胞/kg、约107个细胞/kg、约5x107个细胞/kg、约108个细胞/kg、约5x108个细胞/kg、约109个细胞/kg、约5x109个细胞/kg、约1010个细胞/kg、或约5x1010个细胞/kg。msc的剂量范围可以为从约103个细胞到约1010个细胞，例如约106个细胞至约2x108个细胞、或约103个细胞、约5x103个细胞、约104个细胞、约5x104个细胞、约105个细胞、约5x105个细胞、约106个细胞、约5x106个细胞、约107个细胞、约5x107个细胞、约108个细胞、约5x108个细胞、约109个细胞、约5x109个细胞、约1010个细胞或约5x1010个细胞。可以按单剂量、分割剂量、或多剂量给予所述msc。可以通过包括以下的任何合适的方法将msc给予受试者：静脉内(iv)、动脉内、肌内、腹膜内、脑脊髓内、颅内、皮下(sc)、关节内、滑膜内、鞘内、冠状动脉内、经心内膜、外科手术植入、局部给予和吸入(例如肺内)途径。最优选地，通过iv给予msc。可以在受试者接受cart细胞疗法之前、期间或之后向受试者给予msc。在一个实施方案中，在炎症期间给予msc。因此，在一个实施方案中，在给予cart细胞之后，任选地在炎症已经开始和/或促炎症细胞因子释放已经开始或增加(相对于对照例如相对于给予cart细胞之前而言)之后给予msc。不希望受到理论的束缚，认为在给予cart细胞疗法后给予msc将获得最大的益处。这是因为cart细胞疗法本质上是一种免疫/炎症应答，而msc发挥免疫调节和抗炎作用。因此，在给予cart细胞疗法之前、期间或之后太早给予msc可削弱cart细胞疗法的作用。尽管有此理论，但本发明不受此限制。但是，这种明显的矛盾是本领域技术人员所理解和接受的。例如，对于由cart细胞疗法引起的crs的主要治疗是给予具有强烈免疫抑制作用的类固醇。msc的优势例如可包括：与类固醇的全身性免疫抑制(缺乏体内持久性)相比具有局部免疫调节，在对类固醇或其他免疫抑制疗法无反应的受试者中提供了另外一道防御力；与类固醇相比毒性降低和特异性增加；以及与类固醇相比msc可自我调节。毒性降低、特异性增加、和自我调节是相关的，并且自我调节意为在cart细胞疗法的副作用或症状的免疫应答消退时，认为msc具有降低其免疫调节活性的能力；而类固醇例如必须由医师撤回，随后经历半衰期，之后类固醇浓度才能降至低于治疗浓度。因此，在一个实施方案中，可在给予cart细胞后约1周向接受cart细胞疗法的受试者给予msc。在另一个实施方案中，可以在给予cart细胞后约5min向接受cart细胞疗法的受试者给予msc。在另一个实施方案中，可以在给予cart细胞后约6天、约5天、约4天、约72小时、约48小时、约36小时、约24小时、约16小时、约12小时、约8小时、约4小时、约2小时、约60min、约45min、约30min、约15min、或约5min向接受cart细胞疗法的受试者给予msc。在一个实施方案中，可在给予cart细胞后约24小时至约72小时内向接受cart细胞疗法的受试者给予msc。在一个实施方案中，可在给予cart细胞前约1周向接受cart细胞疗法的受试者给予msc。在另一个实施方案中，可以在给予cart细胞前约5min向接受cart细胞疗法的受试者给予msc。在另一个实施方案中，可以在给予cart细胞前约6天、约5天、约4天、约72小时、约48小时、约36小时、约24小时、约16小时、约12小时、约8小时、约4小时、约2小时、约60min、约45min、约30min、或约15min向接受cart细胞疗法的受试者给予msc。在另一个实施方案中，可以在给予cart细胞的大约同时或期间向接受cart细胞疗法的受试者给予msc。术语“治疗有效量”是指msc有效治疗受试者中cart细胞疗法的副作用或症状的量。术语“治疗(treat、treating或treatment)”是指治疗性处理和预防性(prophylactic或preventative)措施，其中目的是预防、减轻、或改善受试者中cart细胞疗法的副作用或症状，或减慢(减轻)受试者中cart细胞疗法的副作用或症状的进展。需要治疗的受试者包括已经具有cart细胞疗法副作用或症状的那些，以及要预防或改善cart细胞疗法副作用或症状的那些。术语“预防(preventing、prevention)”、“预防性(prophylactic或preventative)”是指防止发生、或阻止、抵抗、或保护免于cart细胞疗法副作用或症状的发生。需要预防的受试者可能易于发生cart细胞疗法的副作用或症状。术语“改善(ameliorate或amelioration)”是指减少、降低或消除cart细胞疗法的副作用或症状。cart细胞疗法的副作用或症状可以量化为二元事件，即存在或不存在，0或1。可替代地，可以用半定量量表将cart细胞疗法的副作用或症状量化，半定量量表例如0至5，其中0表示不存在，1至4表示严重程度的可鉴别的增加，并且5表示最大程度。临床试验通常使用1至5的量表，其中：1表示轻度不良事件(副作用)；2表示中度不良事件(副作用)；3表示严重不良事件(副作用)；4表示危及生命或致残的不良事件(副作用)；并且5表示与不良事件(副作用)有关的死亡。其他半定量量表对于本领域技术人员将易于明白。在另一个实施方案中，可以用定量量表将cart细胞疗法的副作用或症状量化，例如：每体积质量，例如每体积组织液中细胞因子的质量；温度；持续时间；速率；酶活性；氧饱和度；等等。本领域技术人员将容易理解如何评估和量化cart细胞疗法的任何副作用或症状，并且能够在没有困难或不适当负担的情况下进行评估和量化。例如，本领域技术人员将能够测量：血浆或血清中的细胞因子浓度；温度(发烧)；心率(心动过速)；血压(低血压)；心功能障碍；肾损害；血清或血浆酶浓度(肝功能)；等等。可以将对cart细胞疗法副作用或症状的任何量化与对照进行比较；对照为例如既不接受cart细胞疗法也不接受msc的健康对照受试者，用cart细胞疗法治疗但未用msc治疗的受影响的对照受试者，或人群。通过给予msc来治疗cart细胞疗法的副作用或症状可以是使cart细胞疗法的副作用或症状降低约1％、降低约2％、降低约3％、降低约4％、降低约5％、降低约6％、降低约7％、降低约8％、降低约9％、降低约10％、降低约20％、降低约30％、降低约40％、降低约50％、降低约60％、降低约70％、降低约80％、降低约90％、降低约100％、或者更大程度地降低。可替代地，治疗cart细胞疗法的副作用或症状可以是使cart细胞疗法的副作用或症状降低约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍、约10倍、或更多。如本文所用，术语“受试者”可以指哺乳动物。哺乳动物可以是灵长类动物(特别是人)，或者可以是家养动物、动物园动物或伴侣动物。尽管特别考虑到本文公开的方法适合用于人的医学治疗，但也适用于兽医治疗，包括治疗家养动物(如马、牛和绵羊)、伴侣动物(如狗和猫)、或动物园动物(如猫科动物、犬科动物、牛科动物和有蹄动物)。以下实施例有助于描述本发明，但本发明不限于这些实施例。实施例实施例1.car和逆转录病毒载体这些实施例中的所有car都包含源自j591杂交瘤的scfv，如所述(gong,m.c.等人neoplasia1,123-127(1999))，所述杂交瘤针对前列腺特异性膜抗原(psma)有特异性。为便于检测转导的细胞，所有构建体均包含插入sfg载体中的脑心肌炎病毒内部核糖体进入位点(emcv-ires)和egfp基因。在pz1中，j591scfv(p)通过人cd8α铰链和跨膜序列与人tcrζ(z)的胞内结构域偶联(gong等人)。p28包含j591scfv(p)与人cd28(28)的融合物，如所述(krause,a.等人j.exp.med.188,619-626(1998)和krause,a.等人mol.ther.1,s260,713(2000))。为了构建p28z，使用引物5′-ggcggccgcaattgaagttatgtatc-3′(seqidno:1)和5′-tgcgctcctgctgaacttcactctggagcgataggctgctaagtcgcg-3seqidno:2)扩增cd28的核苷酸336-660。使用引物5′-agagtgaagttcagcaggagcgca-3′(seqidno:3)和5′-ctcgagtggctgttagccaga-3′(seqidno:4)扩增tcrζ的细胞内结构域。将产物在由seqidno:1和4的引物驱动的单独pcr反应中融合，用taq聚合酶在尾部加a，并以noti/xhoi系带亚克隆到sfg-pz1中。为了产生pz28，使用5′-gcacttcacatgcaggctctgccacctcgcaggagtaagaggagcaggctcctgcac-3′(seqidno:5)和5′-cgctcgagtcaggagcgataggctgcgaagtcgcgt-3′(seqidno:6)(引入的两个沉默突变可中断胞嘧啶重复序列，以下划线标出)来扩增cd28的细胞内结构域。所得的pcr产物代表tcrζ的远端九个密码子(负终止密码子)与cd28的细胞内结构域的融合物，并且包含便利的5'nspi位点。将此片段亚克隆，用nspi/xhoi消化，并连接到sfg-pz1中。sfg-c-fms编码人巨噬细胞集落刺激因子受体。这导致一系列受体，所述受体包含psma特异性scfv片段，所述psma特异性scfv片段与源自tcrζ和/或cd28的信号传导元件偶联。pz1和p28被设计为分别以psma依赖性方式传递信号。在p28z中，tcrζ的细胞内部分已连接到p28的c末端，而在pz28中，cd28信号传导结构域被添加到pz1的c末端。将所有嵌合互补dna(cdna)克隆到增强的绿色荧光蛋白上游的双顺反子肿瘤逆转录病毒载体中。实施例2.原代人t细胞的培养和逆转录病毒转导将来自健康供体的外周血单核细胞建立在rpmi+10％(vol/vol)人血清中，并用植物凝集素(2μg/ml)激活两天，转移至预先涂有retronectin(15μg/ml；takarabiomedicals，shiga，日本)的非组织培养板(falcon，bectondickinson，franklin，lakes，n.j.)。产生包含car构建体的长臂猿白血病病毒包膜假型逆转录病毒颗粒，如所述(gallardo,h.f.等人blood90,952-957(1997)和rivière,i.等人mol.biotechnol.15,133-142(2000))。转导丝裂原激活的pbl后三天，基因转移效率范围为20％至70％。cd4+和cd8+t细胞亚群以相似的效率被转导。还通过蛋白质印迹法分析了包含ζ链的融合受体的表达，证实形成了同二聚体以及与内源性cd8或cd28的异源二聚化(如果有的话)很少。p28z和pz28受体二者均介导表达人psma的成纤维细胞的特异性裂解，但p28不介导。当在表达psma的nih3t3细胞上刺激t细胞时，在psma和b7.1存在的情况下，pz1、p28z、和pz28引发il-2分泌。在没有共刺激配体的情况下，仅在p28z转导的t细胞培养物中观察到il-2产生。当仅由表达psma的nih3t3细胞提供刺激时，表达pz1的t细胞经历有限的扩增。pz28转导的细胞也生长不良。相比之下，p28z转导的t细胞持续增殖，并且在共培养到psma+成纤维细胞单层上7天后，表达p28z的t细胞保留了特异性裂解psma+靶标的能力。实施例3.cd19特异性scfv为了构建cd19特异性scfv，使用描述的简并引物从杂交瘤细胞系sj25c1中克隆了重链(vh)和轻链(vl)可变区(orlandi等人procnatlacadsciusa86,3833-3837(1989))。将这些编码区与编码(gly3ser)4间隔区的dna片段融合。将来自人cd28的共刺激信号传导元件(包括跨膜和细胞外部分)(seqidno:7)连接至所得scfv的3'端，并将人ζ的胞质结构域(seqidno:8)连接至cd28部分的3'端，以形成融合基因19-28z。测试了19-28z融合物在注射nalm6t细胞的小鼠中减少肿瘤生长和增强生存的能力。nalm6细胞表达cd19、mhci、和mhcii，但不表达b7.1或b7.2。大部分(约80％)未经治疗的scid-beige小鼠在注射肿瘤细胞后4-5周出现后肢瘫痪，其余小鼠出现体重减轻和/或其他cns症状(即前庭症状)。当存在19-28z融合物时，与用pz1(psma特异性构建体)或19z1(一种缺乏共刺激信号传导元件的cd19特异性构建体)治疗的小鼠相比，t细胞刺激增强了近十倍，并且一些小鼠的存活期大大延长。实施例4.cd19特异性car将使用实施例1的方法制备按顺序包含cd19结合元件、4-1bb(cd137)(作为共刺激区域)、和cd3ζ链的细胞内结构域的car。将使用以下引物gcggccgca-ccatctccagccgac(seqidno:9)和cttcactct-cagttcacatccttc(seqidno:10)扩增4-1bb，以生成4-1bb扩增子以及cd19scfv和ζ尾部，带有限制性切割位点的，以促进与cd19scfv和ζ链部分的连接。序列中的连字符表示从4-1bb序列到尾部的过渡。相同的引物可用于以相同序列结尾的其他结合元件，例如psma。将使用实施例1的方法制备按顺序包含cd19结合元件、icos(作为共刺激区域)、和cd3ζ链的细胞内结构域的car。将使用以下引物gcggccgca-ctatcaatttttgatcct(seqidno:11)和cttcactct-tagggtcacatctgtgag(seqidno:12)扩增icos，以生成icos扩增子以及cd19scfv和ζ尾部，带有限制性切割位点，以促进与cd19scfv和ζ链部分的连接。序列中的连字符表示从icos序列到尾部的过渡。相同的引物可用于以相同序列结尾的其他结合元件，例如psma。将使用实施例1的方法制备按顺序包含cd19结合元件、dap-10(作为共刺激区域)、和cd3ζ链的细胞内结构域的car。使用以下引物gcggccgca-cagacgaccccagga(seqidno:13)和cttcactct-gcccctgcctggcatg(seqidno:14)扩增dap-10，以生成dap-10扩增子以及cd19scfv和ζ尾部，带有限制性切割位点，以促进与cd19scfv和ζ链部分的连接。序列中的连字符表示从dap-10序列到尾部的过渡。相同的引物可用于以相同序列结尾的其他结合元件，例如psma。实施例5.用于产生msc的试剂表1.试剂表1中列出的试剂是本领域技术人员已知的并且具有可接受的组成，例如imdm和哈氏f12。glutamax包含l-丙氨酰-l-谷氨酰胺二肽，通常在0.85％nacl中以200mm提供。glutamax在被培养的细胞裂解二肽键时释放l-谷氨酰胺。化学定义的脂质浓缩物包含花生四烯酸2mg/l、胆固醇220mg/l、dl-α-生育酚乙酸酯70mg/l、亚油酸10mg/l、亚麻酸10mg/l、肉豆蔻酸10mg/l、油酸10mg/l、棕榈酸10mg/l、棕榈油酸10mg/l、普朗尼克(pluronic)f-6890g/l、硬脂酸10mg/l、2.2g/l、和乙醇。h-1152和y27632是高度有效力的、细胞可渗透的、选择性的rock(rho关联的形成卷曲螺旋的蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶)抑制剂。表2.if6s培养基(10x浓度)表3.if9s培养基(1x浓度；基于if6s)if9s数量最终浓度if6s5ml1x聚乙烯醇(pva；20mg/ml溶液)25ml10mg/ml全铁转铁蛋白(10.6mg/ml溶液)50μl10.6μg/ml胰岛素100μl20μg/ml胚胎移植级水至50mlna表4.分化培养基(1x浓度；基于if9s)分化培养基数量最终浓度if9s36ml1xfgf21.8μg50ng/mllicl(2m溶液)36μl2mmbmp4(100μg/ml溶液)18μl50ng/ml激活素a(10mg/ml溶液)5.4μl1.5ng/ml表5.间充质细胞集落形成培养基(1x浓度)间充质细胞集落形成培养基(m-cfm)数量最终浓度es-cultm312040ml40％stemspansfem30ml30％人内皮sfm30ml30％glutamax1ml1xl-抗坏血酸(250mm溶液)100μl250μmlicl(2m溶液)50μl1mm1-硫代甘油(100mm溶液)100μl100μmfgf2600ng20ng/ml表6.间充质无血清扩增培养基(1x浓度)间充质无血清扩增培养基(m-sfem)数量最终浓度人内皮sfm5l50％干细胞系iihsfm5l50％glutamax100ml1x1-硫代甘油87μl100μmfgf2100μg10ng/ml实施例6.人psc分化成msc的方案1.在玻连蛋白涂覆的(0.5μg/ckg)塑料器皿上在e8完全培养基(dmem/f12基础培养基+e8补充剂)+1μmh1152中将ipsc解冻。将铺板的ipsc在37℃、5％co2、20％o2(含氧量正常)下孵育。2.在玻连蛋白涂覆的(0.5μg/ckg)塑料器皿上在e8完全培养基(没有rock抑制剂)中扩增ipsc三代，并在开始分化过程之前在37℃、5％co2、20％o2(含氧量正常)下孵育。3.收获ipsc并在胶原蛋白iv涂覆的(0.5μg/ckg)塑料器皿上在e8完全培养基+10μmy27632中将其以5x103个细胞/ckg作为单细胞/小集落接种，并且在37℃、5％co2、20％o2(含氧量正常)下孵育24h。4.用分化培养基替代e8完全培养基+10μmy27632，并在37℃、5％co2、5％o2(缺氧)下孵育48h，以产生原始中胚层细胞。5.将来自分化培养基贴壁培养的集落形成原始中胚层细胞收获作为单细胞悬浮液，转移至m-cfm悬浮培养并在37℃、5％co2、20％o2(含氧量正常)下孵育12天，直到形成间充质细胞集落。6.收获间充质细胞集落，并在纤连蛋白/胶原蛋白i涂覆的(0.67μg/ckg纤连蛋白、1.2μg/ckg胶原蛋白i)塑料器皿上将其接种在m-sfem中，并且在37℃、5％co2、20％o2(含氧量正常)下孵育3天以产生msc(第0代)。7.收获集落，并在纤连蛋白/胶原蛋白1涂覆的塑料器皿上以1.3x104个细胞/ckg以单细胞(第1代)接种在m-sfem中，并且在37℃、5％co2、20％o2(含氧量正常)下孵育3天。8.将其收获，并在纤连蛋白/胶原蛋白1涂覆的塑料器皿上以1.3x104个细胞/ckg以单细胞(第2代)接种在m-sfem中，并在37℃、5％co2、20％o2(含氧量正常)下孵育3天。9.将其收获，并在纤连蛋白/胶原蛋白1涂覆的塑料器皿上以1.3x104个细胞/ckg以单细胞(第3代)接种在m-sfem中，并在37℃、5％co2、20％o2(含氧量正常)下孵育3天。10.将其收获，并在纤连蛋白/胶原蛋白1涂覆的塑料器皿上以1.3x104个细胞/ckg以单细胞(第4代)接种在m-sfem中，并在37℃、5％co2、20％o2(含氧量正常)下孵育3天。11.将其收获，并在纤连蛋白/胶原蛋白1涂覆的塑料器皿上以1.3x104个细胞/ckg以单细胞(第5代)接种在m-sfem中，并在37℃、5％co2、20％o2(含氧量正常)下孵育3天。12.收获为单细胞并冷冻最终产物。进行了两项实验(tc-a-96和dad-v-90)，以研究用pdgf-bb(10ng/ml)和/或licl(1mm)补充m-cfm对ipsc-msc的t细胞抑制的影响。使用waisman生物制造免疫效价测定(ipa)对产生的t细胞抑制作用进行了评价。如表7所概括，评价了血小板衍生生长因子(pdgf)和licl的以下组合：pdgf+/licl+、pdgf-/licl-、pdgf+/licl-和pdgf-/licl+。应注意，在tc-a-96实验中比较了分化培养基(1xaa＝15ng/ml和0.1xaa＝1.5ng/ml)中两种不同的dneg1种子密度(5x103个细胞/ckg和1x104个细胞/ckg)和两种不同浓度的激活素a(aa)。dad-v-90实验使用单个dneg1种子密度(5x10e3个细胞/ckg)和激活素a浓度(1.5ng/ml)。另外注意，第一个ipa(ipa1)中使用了单一leukopak(lpk7)，并且第二个ipa(ipa2)中使用了两种leukopak(lpk7和lpk8)。此测定旨在评估每个msc系可抑制t辅助(cd4+)淋巴细胞增殖的程度。使用从健康个体的外周血(源自leucopak(lpk)的外周血单核细胞(pbmc))中纯化的冷冻保存的白细胞测试经冷冻保存的msc。这样，预期lpk细胞群体在供体之间变化。将每个msc测试样品均针对用于临床级材料的来自两个不同个体的pmbc进行了测试，其中可以选择将测试样品限于用于研究级材料的单个pmbc样品。将每个msc测试样品的测定与参考标准msc系一起运行，以确保测定的完整性/可重复性并使测试样品归一化。所述测定描述于bloom等人cytotherapy,2015,17(2):140-51。简而言之，将测试的msc暴露于21gy的γ射线辐照下。在48孔组织培养板中，将4x10e5、2x10e5、4x10e4和2x10e4个经辐照的msc铺板到各个孔中。将pmbc单独用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯标记。将标记的pmbc细胞以每孔4x105个包含上述msc的细胞铺板。这导致pbmc:msc的滴定比率为1:1、1:0.5、1:0.1、和1:0.05。另一孔仅铺有经刺激的pbmc，另一孔仅铺有msc，并且另一孔铺有无刺激的1:0.05比率的pbmc:msc，这些全部用作对照。随后，将t细胞刺激性单克隆抗体、抗人cd3-ε和抗人cd28(r&dsystems，inc.，minneapolis，mn)添加到每个孔中。在培养的第四天，从各个孔中收获细胞。将来自每个孔的细胞与别藻蓝蛋白标记的抗人cd4孵育。然后使用流式细胞仪通过羧基荧光素强度分析cd4+细胞的增殖。单独msc对照用于将msc从共培养孔中选出。单独pbmc对照用作最大t细胞增殖的阳性对照，针对其测量msc介导的抑制程度。未刺激的1:0.05比率的孔用于产生阴性对照门，针对其测量增殖。根据测试样品比率，使用最佳拟合曲线生成ic50值。将ic50值针对参考标准归一化(ic50refstd/ic50测试样品)。对于更有效(抑制性更高)的样品，此归一化的ic50值较大，而对于不太有效的样品，此值较小。结果表7呈现的ic50数据显示，补充licl但不包括pdgf(即pdgf-/licl+)的m-cfm对于使ipsc分化产生免疫调节性ipsc-msc是最佳的。此外，较低浓度的激活素a也改善了ipsc-msc的免疫抑制。表7.免疫效价测定根据此实施例产生的msc展现出cd73+cd105+cd90+cd146+cd44+cd10+cd31-cd45-表型。实施例7.msc微小rna分析对于根据实施例6产生的msc，针对包含1194个mirna和由mir-127-3p、mir-145-5p、mir-181b-5p、mir-214-3p、mir-299-5p组成的专有mirna组的微小rna(mirna)微阵列进行了分析，针对71个msc样品和94个非msc样品进行了验证。根据实施例6产生的msc表达mir-145-5p、mir-181b-5p、和mir-214-3p中的每一个，但不表达mir-127-3p和mir-299-5p。实施例8.替代性免疫效价测定1如下评价msc的免疫效价：将来自各种供体的人pbmc合并(以最大程度减少个体间的免疫应答差异)在磷酸盐缓冲盐水中，并在37℃在黑暗中用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(cfse，2μm)在2x107个pbmc/ml的细胞密度下染色15分钟。通过添加等量的补充有10％人血型ab血清的rpmi-1640培养基来终止反应。将3x105个经cfse标记的pbmc重悬在rpmi-1640培养基中，所述培养基补充有10％合并的人血小板裂解物、2iu/ml不含防腐剂的肝素(biochrom)、2mml-谷氨酰胺、10mm(4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸(hepes；gibco)、100iu/ml青霉素(sigma)和100μg/ml链霉素(sigma)，然后将这些pbmc每孔一式三份地接种在96孔平底板(corning)中。将使用gallios10色流式细胞仪和kaluzag1.0软件(均来自coulter)确定t细胞增殖。将在4至7天后分析存活的7-氨基放线菌素d排除的(7-aad-；bdpharmingen)cd3-apc+(ebioscience)t细胞。将使用modfit4.1软件(verity)分析增殖动力学和种群分布。实施例9.替代性免疫效价测定2如下评价msc的免疫效价：将t辅助(cd4+)淋巴细胞按照制造商的说明用celltrace紫(ctv；invitrogen)染色，并且然后在t细胞/珠粒比率为5:1的96孔u型底板中，用抗cd3/cd28包被的珠粒(dynabeads，invitrogen)刺激。然后将应答者cd4t细胞与作为参考标准的经辐照(100gy)的karpas299细胞(k299细胞；sigma)一起孵育。将共培养的细胞在rpmi-1640培养基中在5％co2中于37℃孵育72h。然后将细胞用膜联蛋白v结合缓冲液(bdbiosciences)洗涤，并用膜联蛋白v-异硫氰酸荧光素或apc(bdbiosciences)在黑暗中于室温下染色15min。此孵育后，将细胞用碘化丙啶(pi)(molecularprobes)染色，并且然后立即在lsriifortessa(bdbiosciences)上采集数据。将使用flowjo软件(版本8.8.6；treestar)对收集的数据进行分析。通过膜联蛋白v阴性和pi阴性t细胞的群体来测量生存力。将分析此比例的活细胞的ctv暗淡(增殖％)。t细胞增殖的抑制将通过以下公式计算：抑制％＝100-(a/b*100)，其中a是存在抑制细胞的情况下的增殖百分比，并且b是不存在抑制细胞的情况下的增殖百分比。实施例10.减少用于all的cart细胞疗法的副作用发生将患有难治性all的受试者分为两组，并且每组iv灌注对cd19有特异性的自体cart细胞。用编码cd19car的慢病毒载体转导cart细胞。给受试者每公斤体重灌注0.76×106至20.6×106个cd19cart细胞的剂量。将监测患者的反应、毒性和副作用、以及循环cd19cart细胞的扩增和持久性。灌注cd19cart细胞后3小时内，向一组受试者iv灌注1x106至1x107个msc。预计约90％的受试者的all会完全缓解。预期cd19cart细胞会在有反应的受试者的血液、骨髓、和脑脊液中增殖并检测到。预期all持续缓解，预计6个月无事件生存率约为67％，并且预计总体生存率约为80％。预期所有未灌注msc的受试者发生crs。预计此组中约25％的受试者会发生严重的crs，其将用托珠单抗治疗。与未用msc治疗的受试者相比，所有灌注msc的受试者预期展现出降低的crs，呈现为降低的症状严重性。还预期此组中的受试者展现出除crs以外更少更小的严重副作用。实施例11.治疗用于all的cart细胞疗法的副作用将患有难治性all的受试者分为两组，并且每组iv灌注对cd19有特异性的自体cart细胞。用编码cd19car的慢病毒载体转导cart细胞。给受试者每公斤体重灌注0.76×106至20.6×106个cd19cart细胞的剂量。将监测患者的反应、毒性和副作用、以及循环cd19cart细胞的扩增和持久性。灌注cd19cart细胞后24小时至72小时，将向一组受试者iv灌注1x106至1x107个msc。预计约90％的受试者的all会完全缓解。预期cd19cart细胞会在有反应的受试者的血液、骨髓、和脑脊液中增殖并检测到。预期all持续缓解，预计6个月无事件生存率约为67％，并且预计总体生存率约为80％。预期所有未灌注msc的受试者发生crs。预计此组中约25％的受试者会发生严重的crs，其将用托珠单抗治疗。与未用msc治疗的受试者相比，所有灌注msc的受试者预期展现出降低的crs，呈现为降低的症状严重性。还预期此组中的受试者展现出除crs以外更少更小的严重副作用。实施例12.减少用于cll的cart细胞疗法的副作用发生将根据实施例10治疗患有难治性cll的受试者。相似但不完全相同的是，与用msc治疗的all受试者比未用msc治疗的all受试者的改善相比，预期用msc治疗的cll受试者比未用msc治疗的cll受试者有改善。实施例13.治疗用于cll的cart细胞疗法的副作用将根据实施例11治疗患有难治性cll的受试者。相似但不完全相同的是，与用msc治疗的all受试者比未用msc治疗的all受试者的改善相比，预期用msc治疗的cll受试者比未用msc治疗的cll受试者有改善。实施例14.减少用于nhl的cart细胞疗法的副作用发生将根据实施例10治疗患有nhl的受试者。相似但不完全相同的是，与用msc治疗的all受试者比未用msc治疗的all受试者的改善相比，预期用msc治疗的nhl受试者比未用msc治疗的nhl受试者有改善。实施例15.治疗用于nhl的cart细胞疗法的副作用将根据实施例11治疗患有nhl的受试者。相似但不完全相同的是，与用msc治疗的all受试者比未用msc治疗的all受试者的改善相比，预期用msc治疗的nhl受试者比未用msc治疗的nhl受试者有改善。实施例16.减少用于肉瘤或gd2阳性实体瘤的cart细胞疗法的副作用发生将患有复发性/难治性gd2阳性肉瘤的受试者分为两组。收集t细胞后，受试者将接受1800mg/m2/d的环磷酰胺作为淋巴清除方案。用编码gd2car的慢病毒载体转导cart细胞。然后将每组受试者iv灌注1x105至1x107个cart细胞/kg。将监测受试者的反应和副作用、以及循环gd2cart细胞的扩增和持久性。在灌注cart细胞之前三天，受试者将每天两次经2小时接受iv环磷酰胺1800mg/m2/天；每天两次接受连续ivmesna1800mg/m2/天。在cart细胞灌注当天，即30-60分钟之前，受试者被iv或口服给予苯海拉明1mg/kg/d(最大50mg)，被口服给予对乙酰氨基酚15mg/kg/剂(最大650mg)。将经15-30分钟灌注gd2-cart细胞。灌注gd2cart细胞后3小时内，将向一组受试者iv灌注1x106至1x107个msc。预期所有未灌注msc的受试者出现至少一种crs症状或除crs以外的副作用。预期所有灌注msc的受试者展现出至少一种crs症状或除crs以外的副作用的严重性和/或持续时间降低。实施例17.治疗用于肉瘤或gd2阳性实体瘤的cart细胞疗法的副作用将患有复发性/难治性gd2阳性肉瘤的受试者分为两组。收集t细胞后，受试者将接受1800mg/m2/d的环磷酰胺作为淋巴清除方案。用编码gd2car的慢病毒载体转导cart细胞。然后将每组受试者iv灌注1x105至1x107个cart细胞/kg。将监测受试者的反应和副作用、以及循环gd2cart细胞的扩增和持久性。在灌注cart细胞之前三天，受试者将每天两次经2小时接受iv环磷酰胺1800mg/m2/天；每天两次接受连续ivmesna1800mg/m2/天。在cart细胞灌注当天，即30-60分钟之前，受试者被iv或口服给予苯海拉明1mg/kg/d(最大50mg)，被口服给予对乙酰氨基酚15mg/kg/剂(最大650mg)。将经15-30分钟灌注gd2-cart细胞。灌注gd2cart细胞后24小时至72小时，将向一组受试者iv灌注1x106至1x107个msc。预期所有未灌注msc的受试者出现至少一种crs症状或除crs以外的副作用。预期所有灌注msc的受试者展现出至少一种crs症状或除crs以外的副作用的严重性和/或持续时间降低。实施例18.预防或治疗细胞因子释放综合征此实施例使用严重免疫缺陷的nod.cg-prkdcscidil2rgtm1wjl/szj(nsg)小鼠，使得可以将这些小鼠通过植入和分化外周血单核细胞(pbmc)进行人源化，从而导致小鼠外周血和脾脏中的人cd4+和cd8+t细胞的百分比较高。okt3抗体与人t细胞结合并导致强烈诱导人细胞因子，从而建立人crs模型。在第0天，对8至12周大的雌性nod.cg-prkdcscidil2rgtm1wjl/szj(nsg)小鼠通过尾静脉静脉注射20x106个人pbmc(hupbmc)。实验设计的示意图提供于图3中。冷冻的人pbmc购自stemcelltechnologies，并且nsg小鼠购自thejacksonlab。将冷冻的hupbmc样品按照制造商的说明进行存储和解冻。简而言之，将冷冻细胞的小瓶在37℃水浴中解冻，小瓶的外部用70％乙醇清洗，将细胞转移到在37℃下预热的含有10mlrpmi10％fbs的15ml锥形管中，以1500rpm离心10min，用10mlpbs洗涤一次，并悬浮在1mlpbs中，以用于通过台盼蓝染料排除进行细胞计数。制备在150μlpbs中的20x106个hupbmc的等分试样，并置于冰上，同时准备用于注射的小鼠。将小鼠置于笼中，并用灯加温2至3分钟，以诱导尾静脉扩张。接下来，将小鼠置于小鼠限制器中，用70％乙醇清洗尾巴，并通过尾静脉向小鼠注射20x106个hupbmc，其是用1ml注射器、27g针头给予的。注射后，向注射部位施加轻微压力以防止出血。每天监测小鼠的疾病体征，直到安乐死的那天为止。hupbmc植入后10-12天，将小鼠分为对照组群(n＝2)或测试组群(n＝5)。对照组群通过腹膜内注射接受10μg剂量的莫罗单抗-cd3(okt3)抗体。okt3抗体是抗cd3抗体，用作免疫抑制剂以治疗器官移植后的急性排斥。okt3抗体可从商业供应商购买，商业供应商例如abcam(产品目录号ab86883)或thermofisherscientific(产品目录号14-0037-82)，或其他来源，例如沃尔特与伊丽莎研究所(walterandelizahallinstitute)的抗体工厂。在给予hupbmc后12小时，对照组群和测试组群通过腹膜内注射接受okt3抗体。在给予okt3前5小时(即给予hupbmc后7小时)，测试组群通过尾静脉注射接受2x106个msc。在其他实施例中，将在给予okt3的同时或给予okt3后1h、3h、5h或24h给予msc(图3)。给予okt3抗体后0小时、1小时、3小时、5小时、和24小时获取小鼠的温度。使用非接触式红外测温仪进行温度测量，所述非接触式红外测温仪已针对标准直肠测温仪进行了校准，以调整直肠和表面/皮肤温度之间的差异。给予okt3抗体后五小时，使用无菌4mmgoldenrod动物柳叶刀经脸颊静脉穿刺或通过从尾静脉抽血获得外周血样品。给予okt3后5小时或24小时将小鼠处死，这具体取决于临床得分和体温。安乐死后立即通过心脏穿刺获得外周血样品，然后收获脾脏。通过标准流式细胞仪染色和分析确定在循环和脾脏中发现的人cd45、cd4和cd8t细胞百分比。通过表面染色和流式细胞仪分析来评估循环和脾脏cd4和cd8t细胞上的cd69表达。对给予okt3后5小时和24小时收集的血浆样品评价il-1β、il-2、il--6、ifnγ、tnf、il-10、以及任选的il-4和il-5的表达。在这种crs模型中，与对照小鼠相比，测试小鼠展现出更高的直肠温度(图4)。同样，在这种crs模型中，与测试小鼠相比，测试小鼠展现出降低的临床得分(图5)。在对照组与测试小鼠之间，外周血(图6)或脾脏(图9)中cd45+细胞的百分比没有差异。但是，与对照小鼠相比，测试小鼠的外周血(图7)和脾脏(图10)二者中的人cd4+细胞中以及外周血(图8)和脾脏(图11)二者中的人cd8+细胞中的cd69表达均有所降低。鉴于相对于对照小鼠，测试小鼠的人cd4+细胞和人cd8+细胞中的cd69表达有所降低，预期相对于对照小鼠，测试小鼠的il-1β、il-2、il-6、ifnγ、tnf、il-10、il-4和il-5中的一种或多种的表达有所降低。当前第1页1 2 3