包含护脑素的防止脱发或毛发生长促进用组合物的制作方法

本发明涉及包含护脑素(humanin)的防止脱发或毛发生长促进用组合物。

背景技术：

护脑素是由24个氨基酸形成的多肽(poly-peptide)，其在幸存于阿尔茨海默氏病(alzheimer'sdisease)患者的大脑中的神经元中发现。由于护脑素对细胞凋亡具有保护作用，因而可使脑神经元存活而不被破坏(hashimotoy.，etal，.2001a)。原护脑素(hn)的第14个氨基酸碱基由丝氨酸(serine)被取代为甘氨酸(glycine)的护脑素(hng)其强度比原护脑素(hn)的活性高1000倍，因而具有很强的效果(hashimotoetal.，2001a，b，c)。据报道，当用这种护脑素(hng)处理细胞时，有57种蛋白质被磷酸化。被护脑素(hng)磷酸化的57种蛋白质根据其功能分为激酶(kinase)、转录调节剂(transcriptionregulator)、平移调节剂(translationalregulator)、跨膜受体(transmembranereceptor)、转运蛋白(transporter)等(su-jeongk.，etal.，themitochondrial-derivedpeptidehumaninactivatestheerk1/2，akt，andstat3signalingpathwaysandhasage-dependentsignalingdifferencesinthehippocampus.oncotarget.7.46899-46912.(2016))。

人体的毛发在“毛囊”中形成，其数量约为10万～15万根。毛囊中具有毛乳头，在此部位中分布有小血管，用于供给毛发生长中所需的营养成分，在毛乳头上的旁边具有皮脂腺，用于供给使毛发润泽的油脂。毛囊(hairfollicle)由多种不同的皮膜细胞(epithelialcells)及毛乳头细胞(dermalpapillacells，dpcs)形成。毛乳头细胞为位于毛囊的基底部的间充质由来成纤维细胞(mesenchymally-derivedfibroblasts)，对毛发生长起到重要的作用。尤其，据报道，米诺地尔(minoxidil)对毛乳头细胞具有增殖及抗细胞凋亡的效果。类似地，其他报告书中提出可通过毛乳头细胞的增殖促进毛发生。毛发分别具有不同的周期，经过生长期(anagen)、退化期(catagen)、休止期(telogen)生长并脱落。这种周期经过3～6年反复进行，正常情况下每日平均脱落50～100根毛发。通常，所谓的脱发症是指在这种周期中，生长期毛发的比率减少，而退化期或休止期毛发增多，从而导致所脱落的毛发的数量非正常地增加。

作为脱发的原因被议论中的有男性荷尔蒙作用过量论点、皮脂分泌过量论点、血液循环不良论点、因过氧化物、细菌等引起的皮质功能降低论点、遗传因素、老化、精神压力等。作为其原因之一的男性荷尔蒙的一种的睾丸素(testosteron)通过称之为5α-还原酶(5α-reductase)的酶激活为二氢睾丸酮(dihydrotestoserone；dht)，上述二氢睾丸酮与特定受体相结合来诱导引起脱发的蛋白质，从而产生脱发。并且，因这种机制，还形成过多皮脂，并且引起粉刺、脂溢性皮肤炎等，因此皮质中显现出伴随着炎症的脱发。众所周知，脱发症(alopecia)是由疾病、营养不良、老化、荷尔蒙失衡等导致的。

像这样，尽管一直以来进行着有关脱发的诸多研究，但对于根本性的有关脱发的机制尚不清楚。并且，尽管一直以来还致力于脱发的治疗，但至今为止，美国食品药品管理局(fda，foodanddrugadministration)(u.s.a)仅认可两种用于治疗脱发的药物(菲那雄胺(finasteride)及米诺地尔(minoxidil))。菲那雄胺作为5α-还原酶(5α-reductase)，一直以来用于促进男性的雄激素性脱发症(androgeneticalopecia)中的毛发生长。米诺地尔作为抗高血压剂(anti-hypertensiveagent)，可通过atp-敏感性k⁺-通道开放来促进毛发生长。然而，因无法预测的效果及副作用，药物的效果是有限性和暂时性的。因此，需要可预防脱发并促进毛发生长的疗效更好的新治疗药物。对于至今为止被公知为具有防止脱发且促进毛发生长效果的米诺地尔(minoxidil)或粘多糖生长素(trichosaccharide)等制剂而言，正在出现缺乏显著疗效及人体稳定性、引发皮肤刺激等副作用，因此当前实际情况为，急需开发一种确保稳定性及疗效的组合物。

为此，本发明人通过确认护脑素(hng)的防止脱发及促进毛发生长的效果来完成了本发明。

技术实现要素：

技术问题

本发明的目的在于，提供包含护脑素作为有效成分的用于防止脱发的药学组合物。

并且，本发明的目的在于，提供包含护脑素作为有效成分的用于促进毛发生长的化妆品组合物。

并且，本发明的目的在于，提供包含护脑素作为有效成分的用于防止脱发或促进毛发生长的保健食品。

解决问题的方案

本说明书中“脱发”意味着毛发从头皮脱落的现象或毛发变稀少或变细的状态，所谓“防止脱发”意味着预防且防止如上所述的脱发现象，所谓“促进毛发生长”意味着不仅促进新的毛发的生成，还使以往毛发健康生长。

通常，“毛发生长”在生长期中形成，通过从休止期向生长期的诱导及从生长期向退行期的延迟来进行促进。毛发周期可分为周知的生长期、退行期及休止期的3个主要步骤。在生长期中，与细胞的快速增殖一同，通过向皮肤内深处生长来完成毛囊毛发的形成。其次的现象为退行期，上述退行期为细胞分裂的中断脱颖而出的过渡期，在此过程中毛囊逐渐退化，并且毛发生长中断。在作为其次的现象的休止期中，退化毛囊包含具有稠密地充满的毛乳头(dermalpapilla)细胞的胚芽(germ)。在休止期中新的生长期现象的开始通过从上述胚芽的快速细胞增殖、毛乳头的膨胀及基底膜要素的合成来进行诱导。

因此，需要生长期的促进或延长来防止毛发的损失，即，引起防止脱发或毛发的再生长，即，需要促进毛发生长，本发明的组合物包含使已存在的毛发不再脱落的效果、使已存在毛发改善成变粗等的效果及生长新的毛发的效果中的一种以上。毛乳头细胞(dermalpapillacell)作为位于毛囊的基底的中胚层由来成纤维细胞，被认为通过与毛囊的毛基质细胞的相互作用，在毛发的生长中起到重要的作用(jahodaca，etal.，1984；oliverrf，etal.，1986)。因此可知，由于本发明的组合物激活毛乳头细胞，因而可以防止脱发并诱导毛发生长。

本发明提供包含护脑素作为有效成分的用于防止脱发的药学组合物。

上述护脑素是指由24个氨基酸形成的多肽(poly-peptide)，其在幸存于阿尔茨海默氏病(alzheimer'sdisease)患者的大脑中的神经元中发现。具体地，本发明中所使用的护脑素(hng)可以是原护脑素(hn)的第14个氨基酸碱基由丝氨酸(serine)被取代为甘氨酸(glycine)的护脑素(hng)。已知相对于原护脑素(hn)的活性，上述本发明中所使用的护脑素(hng)具有1000倍以上的优秀的预防阿尔茨海默氏病的效果(hashimotoetal.，2001a，b，c)。

优选地，上述护脑素的浓度可以是0.01μm至10μm，具体是0.05μm至1μm，但不限于此。

在药学组合物中，相对于全部组合物的总重量，可以包含0.01重量百分比至70重量百分比的上述护脑素。

本发明的药学组合物可以为口服或非口服的各种剂型。在制剂化的情况下，利用通常使用的填充剂、增量剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、表面活性剂等的稀释剂或赋形剂来进行制备。用于口服给药的固体制剂中包含片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂等，这种固体制剂在一种以上的化合物中混合至少一种的赋形剂，例如，淀粉、碳酸钙、蔗糖(sucrose)或乳糖(lactose)、明胶等来进行制备。并且，除了单纯的赋形剂之外，还使用硬脂酸镁、滑石等的润滑剂。悬浮液、内用液剂、乳剂、糖浆等属于作为用于口服给药的液体制剂，除了作为通常使用的单纯稀释剂的水、液体石蜡之外，可包含多种赋形剂，例如，润湿剂、甜味剂、芳香剂、防腐剂等。用于非口服给药的制剂中包含已灭菌的水溶液、非水溶剂、悬浮液、乳剂、冻干制剂、栓剂。

作为非水溶剂、悬浮溶剂可使用丙二醇(propyleneglycol)、聚乙二醇、橄榄油等的植物油、油酸乙酯等的可进行注射的酯等。作为栓剂的基质可使用甘油明胶(witepsol)、聚乙二醇、吐温(tween)61、可可油脂、梓、甘油明胶等。

本发明的组合物的药学上的给药形态能够以上述组合物的药学上允许使用的盐的形态使用，并且能够以单独地或不仅与其他药学上的活性化合物相结合，还能够以适当的集合来使用。作为上述盐只要是药学上允许使用的，就不做特别限定，可使用例如，盐酸、硫酸、硝酸、磷酸、氢氟酸、氢溴酸、蚁酸、酒石酸、乳酸、柠檬酸、富马酸、马来酸、琥珀酸、甲磺酸、苯磺酸、甲苯磺酸、萘磺酸等。

本发明的组合物可根据所要达到的目的而进行非口服给药或口服给药，可在一日分1至数次来进行给药，使每1kg的体重以0.1mg至500mg的量进行给药。对于特定患者的给药量可根据患者的体重、年龄、性别、健康状态、膳食、给药时间、给药方法、排泄率、疾病的严重程度等来变化。

本发明的药学组合物分别根据常规的方法，包含粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、悬浮液、乳剂、糖浆、气雾剂等的口服型剂型、软膏、霜剂、凝胶、贴剂、喷雾剂、硬膏剂、洗剂等的外用剂、栓剂及灭菌注射用液等的适合于药剂学上的制剂的任意形态，都可进行剂型化来使用。

本发明的药学组合物可通过给大鼠、小鼠、家畜、人类等的哺乳动物进行非口服、口服等的多种路径来进行给药，给药的所有方法可预想，例如，可通过口服、直肠或静脉、肌肉、皮下、子宫内硬膜或脑血管内(intracerebroventricular)注射来进行给药。

另一方面，本发明的组合物因不存在太严重的毒性及副作用，因此当以预防为目的长时间使用时，也可放心使用。

并且，本发明提供包含护脑素作为有效成分的用于促进毛发生长的化妆品组合物。

优选地，上述护脑素的浓度可以是0.01μm至10μm，具体是0.05μm至1μm，但不限于此。

优选地，上述组合物为选自由生发水、润发乳、护发精华素、头发洗剂、头发营养水、洗发水、护发素、焗油膏、发乳、营养发乳、头发保湿霜、头发按摩霜、发蜡、头发喷雾剂、发膜、营养发膜、洗发皂、洗发奶、发油、毛发干燥剂、毛发防腐处理剂、染发剂、烫发剂、毛发脱色剂、发胶、毛发釉、美发剂、粘发剂、头发保湿剂、摩丝及定发剂组成的组中的剂型，但不限于此。

上述化妆品组合物可包含脂肪物质、有机溶剂、溶剂、增稠剂、胶凝剂、软化剂、抗氧化剂、悬浮剂、稳定化剂、发泡剂(foamingagent)、芳香剂、表面活性剂、水、离子型或非离子型乳化剂、填充剂、多价螯合剂、螯合剂、防腐剂、维生素、阻隔剂、润湿剂、必要的油、染料、颜料、亲水性或疏水性活化剂、脂质囊泡或化妆品中通常使用的任意其他成分等的化妆品学或皮肤科学领域中通常使用的助剂。上述助剂以化妆品学或皮肤科学领域中通常使用的量来导入。

根据上述的化妆品组合物可以为例如化妆品组合物，化妆品组合物的外形包含化妆品学或皮肤科学上允许使用的介质或基质。这作为适合局部应用的所用剂型，能够以例如，溶液、凝胶、固体、捏合无水生成物、在水相中分散油相所取得的乳胶、悬浮液、微乳剂、微囊剂、细颗粒剂或离子型(脂质体)及非离子型的囊泡分散剂的形态或霜剂、化妆水、乳液、散剂、软膏、喷雾剂或遮瑕棒的形态来提供。这些组合物可根据该领域的常规的方法来制备。本发明的组合物还能够以发泡(foam)的形态或还包含压缩的推进剂的气溶胶组合物的形态来使用。

本发明的化妆品组合物在剂型方面不受特别限制，可剂型化为例如，柔软化妆水、收敛化妆水、营养化妆水、营养霜、按摩霜、精华素、眼霜、眼部精华、洁面乳、洁面泡沫、洁面水、面膜、粉、润肤露、润肤乳、润肤油、美肌精华液等的化妆品。

如上所述的化妆品组合物能够以涂抹于皮肤的形态来利用，还可利用微型针等以向皮肤内部吸收的形态来适用。

并且，本发明的组合物可通过包含适合于涂敷毛发中的载体或载体混合物来制备成毛发组合物。载体包含与溶剂不同的载体或通常用于毛发保护组合物的赋形剂(vehicle)成分，在全部组合物的总重量中以约0.5％至99.5％，优选地，以约5.0％至95.0％，更优选地，以约10.0％至90.0％存在。作为载体，溶剂由共聚物来选择，上述共聚物无关于剂型化的毛发组合物与发胶、摩丝及发根营养液一同使用后残留于毛发或与洗发液、护发素等一同清洗而使用。优选地，在本发明中使用的适当的溶剂包含水、低级醇(乙醇、异丙醇等)、水醇类混合物、烃(异丁烷、己烷、葵烯等)、丙酮、卤代烃(氟利昂等)、烃酯(乙酸乙酯、邻苯二甲酸二丁酯等)、挥发性硅氧烷衍生物、硅氧烷(苯基五甲基二硅氧烷、甲氧基丙基甲基庚环四硅氧烷、氯丙基五甲基二硅氧烷、羟丙基五甲基二硅氧烷、八甲基环四、十甲基环戊硅氧烷等)及它们的混合物。

并且，本发明提供包含护脑素作为有效成分的用于防止脱发或促进毛发生长的保健食品。

优选地，上述护脑素的浓度可以是0.01μm至10μm，具体是0.05μm至1μm，但不限于此。

优选地，上述保健食品为粉末、颗粒、片剂、胶囊或饮料，但不限于此。

本发明的食品可以按原样添加上述护脑素或与其他食品或食品成分一同使用，并且可以根据常规方法适当地使用。

上述食品的种类不受特别限制。可添加上述护脑素的食品有例如肉类、香肠、面包、巧克力、糖果类、零食类、饼干类、比萨、拉面、其他面类、口香糖类、包括冰淇淋在内的乳制品、各种汤、饮用水、茶、饮料、酒精饮料及微生物复合剂等，并包括常规意义上的所有食品。

如同普通饮料，本发明的饮料组合物可以包含多种香味剂或天然碳水化合物作为附加成分。上述天然碳水化合物为诸如葡萄糖和果糖之类的单糖、诸如麦芽糖和蔗糖之类的二糖、诸如糊精和环糊精之类的多糖、以及木糖醇、山梨醇和赤藓糖等糖醇。作为甜味剂，可以使用诸如索马甜、甜叶菊提取物之类的天然香味剂或诸如糖精和阿斯巴甜之类的合成香味剂等。上述天然碳水化合物的比例通常为在每100ml的本发明的组合物中约0.01～0.04g，优选约0.02～0.03g。

除上述之外，本发明的食品可以包含多种营养素、维生素、电解质、风味剂、着色剂、果胶及其盐、藻酸及其盐、有机酸、保护性胶体增稠剂、ph调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、醇、碳酸饮料中所使用的碳酸化剂等。另外，可以包含用于制备天然果汁、果汁饮料、及蔬菜饮料的果肉。这种成分可以单独或混合使用。这种添加剂的比例不太重要，但通常在每100重量份的本发明的组合物中包含0.001～0.1重量份的范围内选择。

并且，本发明提供用于防止脱发或促进毛发生长的方法，包括将包含护脑素(humanin)作为有效成分的组合物给药的步骤。

作为本发明的另一实例，提供包含护脑素(humanin)作为有效成分的用于制备脱发防止或治疗剂、或毛发生长促进剂的组合物的用途。

由于本发明的上述方法及用途按原样利用包含上述护脑素的组合物，因而为了避免本说明书的过度复杂性，将省略对它们两者之间的相同内容的描述。

发明的效果

护脑素被认定为通过促进毛发生长中重要的毛乳头细胞的增殖来具有抑制及预防脱发且促进毛发生长的功效，因此可在药学、化妆品及美容等领域中以多种方式应用。

附图说明

图1为确认在不同浓度下护脑素的毛乳头细胞(dpcs)增殖促进效果的图。米诺地尔被用作阳性对照组，并且比较了利用护脑素(0.05μm、0.1μm、0.2μm及0.5μm)处理毛乳头细胞的状态。

图2为分离大鼠的生长期触须毛囊(vibrissafollicle)来确认不同浓度下的护脑素对毛囊的长度生长产生的影响的图。米诺地尔被用作阳性对照组，并且利用护脑素(0.05μm、0.1μm及0.2μm)处理触须毛囊来确认了毛囊的长度生长。

具体实施方式

以下，为了助于理解本发明，例举实施例来进行详细的说明。然而，下述实施例仅为用于例示本发明的内容，本发明的范畴并不由下述实施例而限定。本发明的实施例是为了给本发明所属技术领域中普通技术人员更加完整地说明本发明而提供。

实施例1：材料的准备及方法

1-1：准备护脑素

在本实验中使用了由peptideinstitute，inc(minoh，osaka，日本)生产的护脑素(hng)。该护脑素(hng)是原护脑素(hn)的第14个氨基酸碱基由丝氨酸(serine)被取代为甘氨酸(glycine)的护脑素(hng)。将护脑素(hng)溶解在无菌三级蒸馏水中来制成0.1mm的护脑素(hng)溶液后通过稀释来使用。

1-2：毛乳头细胞的培养

将从白鼠胡须中分离的永生化的毛乳头细胞(ratvibrissaimmortalizeddermalpapillacell：filsellw，etal.，1994)利用包含100units/ml的青霉素(penicillin)-100μg/ml的链霉素(streptomycin)(gibcoinc，纽约，美国)和10％的热灭活胎牛血清(heat-inactivatedfetalbovineserum)(fbs；gibcoinc，纽约，美国)的dmem(hycloneinc，美国)培养基，在37℃的温度、5％的co2恒温仪中进行了培养，并且每3天一次进行了继代培养。

1-3：统计分析方法

所有实验结果以平均±标准偏差或平均±标准误差求值并表示，通过学生t检验(student'st-test)进行统计学显著性检验，当p值(p-value)小于0.05时，判断为结果值具有显著性。统计处理使用了sigmastat统计软件(sigmastatsoftware)(jandelscientificsoftware，美国)。

实施例2：通过四唑盐(mtt)分析确认毛乳头细胞的生长增殖功效

利用四唑盐比色法(mttassay)测量了毛乳头细胞的增殖。将0.5×104cell/ml的毛乳头细胞混合于包含0.5％胎牛血清(fbs)的dmem(hycloneinc，usa)并在96孔板(wellplate)中进行24小时培养之后，处理hng，使其最终浓度达到50nm、100nm、200nm及500nm。作为阳性对照组的米诺地尔硫酸盐(minoxidilsulfate)以1μm的浓度进行了处理。在培养72小时之后，用2mg/ml的mtt溶液(sigma，mo，usa)50μl进行处理，并进行了4小时的反应。在经过4小时之后离心分离，之后去除上清液，并添加200μl的dmso使沉淀物溶解。利用versamaxmicroplatereader(moleculardevices，ca，usa)，在540nm下测量了上述溶解物的吸光度。利用不同浓度的护脑素(hng)处理的毛乳头细胞中求出吸光度的平均值，并与对照组进行比较来确认了增殖程度。

毛乳头细胞作为位于毛囊的基底的中胚层由来成纤维细胞，其通过毛囊的毛基质细胞与位于凸起(bulge)的毛囊干细胞的相互作用，在毛发的生长中起到重要的作用。这种在毛发生长中起到重要作用的毛乳头细胞的增殖对于毛发生长的生长期(anagen)的诱导和维持方面非常重要。

当以50nm、100nm、200nm及500nm浓度处理护脑素(hng)来确认毛乳头细胞增殖的结果，在经过72小时之后，相对于未处理试样的对照组，以50nm、100nm、200nm、500nm浓度处理护脑素(hng)的毛乳头细胞的增殖分别呈现出98.51±9.87％、110.18±5.50％(p<0.01)、117.93±6.43％(p<0.001)、105.25±8.38％(图1)。当以200nm和100nm的浓度处理护脑素(hng)时，确认到毛乳头细胞的增殖比对照组显著增加。

实施例3：确认护脑素诱导毛囊生长

将对出生3个星期的大鼠(rat)的左侧和右侧触须垫(mystacialpads)进行切割，放入e/p缓冲液(e/pbuffer)(1：1vol./vol.solutionofearle'sbalancedsaltssolutionandphosphate-bufferedsalinesupplementedwith100upenicillin/mland100μgstreptomycin/ml)中。利用解剖显微镜观察切出的触须垫(mystacialpad)并使用解剖刀分离出触须毛囊(vibrissafollicle)。将分离的触须毛囊放入e培养基(williamemedium)(williamemediumsupplementedwith2mml-glutamine，10μg/mlinsulin，50nmhydrocortisone，100u/mlpenicillinand100μg/mlstreptomycin)中，分别以50nm、100nm及200nm的浓度处理护脑素(hng)并进行了培养。每3天更换新的e培养基(williamemedium)，并且护脑素(hng)也以50nm、100nm及200nm的浓度进行了处理。

每7天使用显微镜(olympus，日本)对培养中的触须毛囊(vibrissafollicle)进行了拍摄，长度利用图像分析仪(imageanalyzer)(dp控制器；olympus，日本)进行了测量。根据每个毛囊长度变化值来求出平均值，与对照组的毛囊长度变化值的平均值进行比较并检验了显著性(n＝7)。

当在第21天对护脑素(hng)的处理组和对照组之间的毛囊的长度之差(％)进行比较的结果，在分别以50nm、100nm及200nm处理护脑素(hng)的每组分别呈现出159.98±22.15％(p<0.05)、133.80±10.87％、124.94±28.70％的值(图2)。与对照组相比，以50nm处理护脑素(hng)的组中毛囊长度显著增加。

制剂例1：制备片剂

根据片剂的常规制备方法，将上述多种成分以所提出的含量添加并均匀混合后搅拌，之后颗粒化。干燥后使用压片机制备出了每片含有1mg的护脑素作为有效成分的所需的片剂。

制剂例2：制备胶囊剂

根据胶囊剂的常规制备方法，将上述多种成分以所提出的含量添加并均匀混合后，以每个胶囊含有1mg护脑素的方式填充于适当大小的明胶胶囊中，从而制备出了所需的胶囊剂。

制剂例3：皮肤外用剂中的软膏

根据软膏的常规制备方法，通过以所提出的含量添加上述多种成分并均匀混合来制备出了软膏。

制剂例4：制备散剂

根据散剂的常规制备方法，通过混合上述多种成分并填充于气密布来制备出了散剂。

制剂例5：制备液剂

根据液剂的常规制备方法，通过混合上述多种成分来制备出了液剂。

制剂例6：制备生发水

根据生发水的常规制备方法，通过混合上述多种成分来制备生发水。

制剂例7：制备润发乳

根据润发乳的常规制备方法，通过混合上述多种成分来制备润发乳。

制剂例8：柔软化妆水(润肤液)

表1

根据上表1中所记载的组成来以常规方法制备出了柔软化妆水。

制剂例9：营养霜

表2

根据上表2中所记载的组成来以常规方法制备出了营养霜。

制剂例10：面膜

表3

根据上表3中所记载的组成来以常规方法制备出了面膜。