一种便于骨结合的氧化锆表面制备生物活性涂层的方法与流程

本发明涉及一种便于骨结合的氧化锆表面制备生物活性涂层的方法，属于种植牙技术领域。

背景技术：

现代口腔医学当中，种植体支持式的冠修复以及全口义齿修复是治疗牙列缺损以及牙列缺失的重要方法。其中，纯钛及钛合金的种植体因其良好的生物相容性、抗腐蚀性、机械性能以及骨整合能力而被广泛应用于口腔种植领域，并且取得了良好的修复效果，但是近些年大量的研究均指出钛及钛合金种植体的缺点，如：钛在人体内应用可能会引起过敏反应，钛在接触唾液后有电流效应，而钛六铝四钒作为应用最广范的钛合金种植体材料则存在铝离子及钒离子析出的问题，影响人体的健康。此外，由于牙龈退缩，基台暴露以及牙龈染色造成的前牙区美观问题一直难以解决。在此背景之下，美观、强度高、生物相容性好的陶瓷类材料被应用于口腔种植领域。

氧化锆(zirconia，zr)是锆的主要氧化物，属于陶瓷的一种，具有较高的抗弯强度(900-1200mpa)，维氏硬度达到1200vickers，并且导热率低、抗腐蚀性好、生物相容性好，此外，氧化钇稳定的四方相氧化锆具有“应力诱导相变增韧(stress-inducedransformationtoughening)”的性能，当力作用于氧化锆材料时，裂纹尖端的四方相氧化锆在应力诱导下向更稳定的单斜相转变，伴随3％-5％的体积膨胀以及1％-7％的剪切应变，这一过程消耗了部分作用于氧化锆材料的力，防止了裂纹的扩张，起到强化增韧的效果，提高了氧化锆材料的强度。良好的生物相容性及机械性能使氧化锆成为制作种植体及种植体涂层的主要材料。

国内外学者做了大量的体内、体外实验评价氧化锆作为种植体材料的可行性，但是结果显示氧化锆材料的成骨性能难以令人满意。因为氧化锆属于生物惰性材料，化学性能稳定，并且表面有机官能团较少、不利于蛋白及成骨细胞的吸附，相比于纯钛种植体而言成骨诱导性欠佳，这极大地限制了氧化锆材料在种植领域的应用。现阶段，如何优化氧化锆材料的性能、有效地提高氧化锆材料的生物活性，持续的促进氧化锆种植体表面成骨过程的发生、发展是亟需解决的问题，也是决定氧化锆种植体能否应用于临床的关键问题。

技术实现要素：

针对现有氧化锆生物活性的不足，本发明提供一种便于骨结合的氧化锆表面制备生物活性涂层的方法。

本发明的技术方案如下：

一种便于骨结合的氧化锆表面制备生物活性涂层的方法，包括步骤如下：

(1)将氧化锆试件清洗后进行镁离子注入，镁离子注入参数为：注入电压为10-20kev，镁离子浓度为2-3×10¹⁵ion/cm²；

(2)在镁离子注入后的氧化锆试件表面进行精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽复合体(rgd)连接。

根据本发明，优选的，步骤(1)中所述的清洗操作为：用蒸馏水冲洗后，置于丙酮中超声冲洗，再置于乙酮中超声冲洗，最后用去离子水冲洗；清洗完成后将试件干燥；

进一步优选的，用蒸馏水冲洗10min，置于丙酮中超声冲洗15min，再置于乙酮中超声冲洗15min，最后用去离子水冲洗两遍，每遍15min；后将试件放于37℃烤箱内干燥。

根据本发明，优选的，步骤(1)中所述的氧化锆试件为直径为15mm、厚度1mm的圆形片状或直径为2-3mm锥状；

优选的，所述的氧化锆为氧化钇稳定型四方纳米氧化锆。

根据本发明，优选的，步骤(1)镁离子注入参数为：注入电压15kev，镁离子浓度为2.3×10¹⁵ion/cm²。

根据本发明，优选的，步骤(2)中rgd连接的方法如下：

将镁离子注入后氧化锆试件表面进行羟基化，然后进行硅烷化，最后浸渍rgd溶液，即完成rgd连接。

进一步优选的，rgd连接的方法如下：

将镁离子注入后氧化锆试件放入的氢氧化钠溶液中，水浴锅中50-70℃过夜，对氧化锆试件进行表面羟基化，将羟基化完成的试件氮气环境内烘干后放入高温高压消毒过的容器中，再将7ml戊烷、1.2ml3-氯丙基三乙氧基硅烷(cptes)以及0.6mln,n-二异丙基乙胺(diea)按顺序加入放有氧化锆试件的容器中，室温下硅烷化1h，将硅烷化的试件在乙醇、异丙醇、去离子水中冲洗2次，每次15min，氮气中干燥，备用；

将rgd按0.5-2mg/ml溶解在5mmol/l的碳酸钠溶液中，并将硅烷化的试件投入其中，氮气环境内过夜即可完成试件表面rgd的连接。将试件去离子水冲洗15min，真空保存。

本发明的有益效果：

1、经过本发明制备了生物活性涂层的氧化锆，没有毒副作用，与普通氧化锆材料相比，表面润湿性更好，并且具有纳米级别表面结构。

2、本发明制备的涂层表面的rgd有利于成骨细胞的黏附、伸展及增殖，而mg²⁺的加入可以促进组织矿化，并且rgd及mg²⁺对于成骨细胞生物学行为的促进具有一定的协同作用。

3、本发明制备工艺简单有效，便于应用。

附图说明

图1本发明实施例1中带有生物活化涂层氧化锆圆片状试件照片。

图2本发明实验例1中各组试件的表面形貌扫描电镜照片。

图3本发明实验例1中各组试件表面粗糙度结果图。

图4本发明实验例1中各组试件可湿性实验结果图。

图5本发明实验例2中rgd连接强度实验震荡前震荡后荧光照片。

图6本发明实验例3中各组试件细胞增殖实验图。

图7本发明实验例3中激光共聚焦显微镜拍摄的各组试件细胞形态及黏着斑照片。

图8本发明实验例3中rt-pcr检测各组试件表面细胞整合素的表达水平图。

图9本发明实验例3中westernblot检测成骨指标alp、ocn的表达图。

图10本发明实验例3中试件表面矿化结节扫描电镜照片。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明做进一步说明，但不限于此。

实施例中所用的rgd，为市购产品，macklin公司有售。氧化锆试件为直径为15mm、厚度1mm的圆形片状。

实施例1

一种便于骨结合的氧化锆表面制备生物活性涂层的方法，包括步骤如下：

(1)将片状氧化锆试件用蒸馏水冲洗10min，置于丙酮中超声冲洗15min，再置于乙酮中超声冲洗15min，最后用去离子水冲洗两遍，每遍15min；后将试件放于37℃烤箱内干燥。清洗后进行镁离子注入，参数:注入电压为15kev，镁离子浓度为2.3×10¹⁵ion/cm²；

(2)将离子注入后氧化锆试件放入5mol/l的氢氧化钠溶液中，水浴锅中60℃过夜，对氧化锆试件进行表面羟基化，将羟基化完成的试件氮气环境内烘干后放入高温高压消毒过的容器中，再将7ml戊烷、1.2mlcptes以及0.6mldiea按顺序加入放有氧化锆试件的容器中，室温下硅烷化1h，将硅烷化的试件在乙醇、异丙醇、去离子水中冲洗2次，每次15min，氮气中干燥，备用。将rgd按0.5mg/ml溶解在5mmol/l的碳酸钠溶液中，并将硅烷化的试件投入其中，氮气环境内过夜即可完成试件表面rgd的连接。将试件去离子水冲洗15min，真空保存。

本实施例制备生物活性涂层的氧化锆圆片如图1所示。

实施例2

一种便于骨结合的氧化锆表面制备生物活性涂层的方法，包括步骤如下：

(1)将片状氧化锆试件用蒸馏水冲洗10min，置于丙酮中超声冲洗15min，再置于乙酮中超声冲洗15min，最后用去离子水冲洗两遍，每遍15min；后将试件放于37℃烤箱内干燥。清洗后进行镁离子注入，参数:注入电压为17kev，镁离子浓度为2.5×10¹⁵ion/cm²；

(2)将离子注入后氧化锆试件放入5mol/l的氢氧化钠溶液中，水浴锅中60℃过夜，对氧化锆试件进行表面羟基化，将羟基化完成的试件氮气环境内烘干后放入高温高压消毒过的容器中，再将7ml戊烷、1.2mlcptes以及0.6mldiea按顺序加入放有氧化锆试件的容器中，室温下硅烷化1h，将硅烷化的试件在乙醇、异丙醇、去离子水中冲洗2次，每次15min，氮气中干燥，备用。将rgd按1mg/ml溶解在5mmol/l的碳酸钠溶液中，并将硅烷化的试件投入其中，氮气环境内过夜即可完成试件表面rgd的连接。将试件去离子水冲洗15min，真空保存。

实施例3

一种便于骨结合的氧化锆表面制备生物活性涂层的方法，包括步骤如下：

(1)将片状氧化锆试件用蒸馏水冲洗10min，置于丙酮中超声冲洗15min，再置于乙酮中超声冲洗15min，最后用去离子水冲洗两遍，每遍15min；后将试件放于37℃烤箱内干燥。清洗后进行镁离子注入，参数:注入电压为20kev，镁离子浓度为3.0×10¹⁵ion/cm²；

(2)将离子注入后氧化锆试件放入5mol/l的氢氧化钠溶液中，水浴锅中60℃过夜，对氧化锆试件进行表面羟基化，将羟基化完成的试件氮气环境内烘干后放入高温高压消毒过的容器中，再将7ml戊烷、1.2mlcptes以及0.6mldiea按顺序加入放有氧化锆试件的容器中，室温下硅烷化1h，将硅烷化的试件在乙醇、异丙醇、去离子水中冲洗2次，每次15min，氮气中干燥，备用。将rgd按2mg/ml溶解在5mmol/l的碳酸钠溶液中，并将硅烷化的试件投入其中，氮气环境内过夜即可完成试件表面rgd的连接。将试件去离子水冲洗15min，真空保存。

实验例1、试件表面性能检测

将实施例1得到的带有生物活化涂层氧化锆圆片状试件，记为试件zmr；纯氧化锆试件记为z，mg²⁺注入氧化锆试件记为zm，rgd修饰的氧化锆试件记为zr；纯钛试件试件记为t；检测表面特征如下：

(1)试件表面形貌观察及元素测定

每组随机抽取1个试件，丙酮、无水乙醇以及去离子水中清洗15min，37℃烤箱内干燥。将干燥的氧化锆试件表面喷金后用jsm-6380la扫描电子显微镜观察钛表面形貌，放大倍数为2k和20k，并采用xps对试件表面元素进行检测。

扫描电镜(图2)观察可见纯钛试件(t)表面较光滑，无明显表面结构。4组氧化锆材料表面均可见微米级别突起及沟纹，表面结构排列不规则，并且可见未完全融化的氧化锆颗粒。放大观察可见，普通氧化锆试件(z)与rgd修饰的氧化锆试件(zr)表面形貌相似，材料表面较粗糙，缺少纳米级别表面结构，而离子注入修饰(zm)和离子注入及rgd修饰的氧化锆试件(zmr)表面结构相似，除微米级别结构外还可见明显的纳米级别颗粒。

(2)表面粗糙度测定

每组随机选取3个试件进行粗糙度的测定，在每个试件表面随机选取3个点，采用tr200手持式粗糙度仪进行表面粗糙度(ra)的检测。测量时，传感探头以0.5mm/s的速度从试件表面滑过，测量长度为2.0mm,屏幕显示的数值即是该点的表面粗糙度值ra，每个点重复测量3次，每组试件取平均值作为该试件的表面粗糙度值，采用spss20.0统计软件进行分析。所有试件粗糙度测试均由同一个人完成，以减小误差。

检测结果如(图3)所示，进行了离子注入的氧化锆材料表面粗糙度为1.76±0.18μm，略高于普通氧化锆材料(1.73±0.15μm，p＞0.05)，而纯钛试件的表面粗糙度最低，为0.57±0.02μm。

(3)表面润湿性检测

每组试件中随机选取3枚试件，采用dsa100型接触角测定仪，通过液滴法检测材料表面的润湿性，将待测的试件放在25℃相对湿度：50％rh的平台上,将8μl人工唾液滴到试件表面,准确测出相应的接触角。每个样品任意选取5个点,最终结果用x±s表示。接触角计算方法为液滴左右两侧的接触角值相加后除以

结果如(图4)所示，表面连接了rgd的氧化锆试件接触角最小，为26.4±1.64°，明显小于普通氧化锆试件(65.3±2.32°，p＜0.05)、单纯进行离子注入的氧化锆试件(62.5±2.16°，p＜0.05)及纯钛试件(32.3±1.69°，p＜0.05)。

实验例2、rgd连接强度检测

为检测rgd与氧化锆材料的连接强度，将氧化锆试件硅烷化后连接带有5-羧基荧光素尸胺的rgd，将试件放入超声振荡器中震荡2小时，通过比较震荡前后试件表面荧光强度来评价rgd与试件间的连接强度。

将图(5)中红框内区域作为震荡前、后参照点，通过比较可以发现震荡2小时后试件表面虽然荧光强度减弱，但是仍有明显绿色荧光，提示经过2小时超声震荡仍有大量rgd通过共价键结合连接在氧化锆试件表面。

实验例3、生物学性能检测

(1)细胞增殖实验

每组随机选取9个试件，随机分成3组，分别放入3个24孔板中，别培养24、48、72h后，激光共聚焦显微镜观察。

通过免疫荧光染色细胞核计数的方法，接种24h后zr、zmr组表面细胞明显多于z组(p＜0.05)，而与t组间无明显差异(p＞0.05)，接种48、72h后，zr、zmr组表面细胞数量明显高于其它3组(p＜0.05)，其中，z组表面细胞增殖活性最差(图6)。

(2)细胞形态及黏着斑观察

每组随机选取3个试件放入24孔板中，进行免疫荧光染色，观察细胞形态及黏着斑。

免疫荧光结果显示(图7)，t组表面细胞伸展最充分，肌动蛋白微丝明显，黏着斑主要集中在细胞核附近，丝状伪足末端黏着斑影像不明显。z、zr组表面细胞形态相似，大部分细胞伸展较差，细胞形态不规则，长梭形细胞多见，但是相比于z组，zr组表面细胞黏着斑表达量高，丝状伪足末端可见明显黏着斑影像。zm、zmr组表面细胞伸展较充分，大部分细胞形态规则，肌动蛋白微丝清晰，zmr组表面细胞丝状伪足末端可见明显黏着斑影像，而zm组表面黏着斑较少。

(3)rt-pcr检测整合素表达量

每组选取3个试件放入24孔板中，进行细胞整合素表达水平的检测。将mc3t3-e1细胞以2×10⁵个/ml接种于24孔板中，每孔0.5ml，每48h更换培养液，培养5天后提取总rna进行rt-pcr检测。

结果显示，itga1及itga2(图8)的表达水平均随着材料表面粗糙度的增加而增加，离子注入氧化锆试件的表达水平明显高于未经离子注入的氧化锆试件(p＜0.05)，纯钛试件表达水平最低，rgd对于itga1及itga2的表达无明显提高作用，rgd修饰的氧化锆试件与普通氧化锆试件间itga1及itga2的表达水平无明显差异(p＞0.05)。itga5的表达水平随着粗糙度的增加而降低，纯钛试件表面itga5的表达水平明显高于普通氧化锆试件及离子注入的氧化锆试件(p＜0.05)，但是rgd修饰的氧化锆试件itga5的表达水平明显高于无rgd修饰的氧化锆试件(p＜0.05)。itgav及itgb1的表达水平均随着rgd的加入而明显提高(p＜0.05)，mg+的加入对于itga1v及itgb1的表达也有明显提高(p＜0.05)。

(4)westernblot检测成骨指标表达水平

每组选取3个试件放入24孔板中，进行细胞成骨标志物alp、ocn表达水平的检测。将mc3t3-e1细胞以2×105个/ml接种于24孔板中，每孔0.5ml，每48h更换新鲜培养液，培养3天后进行成骨诱导，在成骨诱导7、14、21天后分别提取蛋白，用westernblot检测alp、ocn表达量。

westernblot结果中(图9)，7天时，zm及zmr组alp表达高于t、z、zr组，t、z、zr三组alp表达差异不明显，zmr的ocn表达明显高于其它组，t、z、zm、zr组ocn表达低。14天时，t组alp表达水平升高，与zm及zmr组相似，zr组alp表达最低，t、zm、zr组ocn表达升高，其中zr、zmr组ocn表达水平相似，z组ocn表达水平最低。21天时，各组alp表达水平均升高，t、zm、zr、zmr组表达水平相似，z组表达最低，zmr组ocn表达明显高于其他组，t、zm组表达相似，略高于z组，zr组ocn表达最低。

(5)扫描电镜观察矿化结节

每组选取2个试件放入24孔板中，将mc3t3-e1细胞以2×105个/ml接种于24孔板中，每孔0.5ml，每48h更换新鲜培养液，培养3天后进行成骨诱导，在成骨诱导10天后吸出培养液，并pbs冲洗3次，每次3分钟，后用4％多聚甲醛固定2h，使用梯度酒精对其进行脱水，完成后喷金，扫描电镜观察矿化结节。

根据扫描电镜结果(图10)，zmr组表面矿化结节最多，并且可见大量小矿化结节融合而成的较大的矿化结节，t组及zm组表面矿化结节较多，但未见有融合的较大的矿化结节，z组表面矿化结节最少，并且结节较小，矿化效果最差。