一种诱导干细胞成软骨分化的药物组合物及其应用的制作方法

本发明属于医药
技术领域：
，具体涉及一种诱导骨髓间充质干细胞向软骨分化的药物组合及其在治疗骨关节炎中的应用。
背景技术：
：骨关节炎(osteoarthritis，oa)是一种以关节软骨退行性病变和继发性骨质增生为特征的慢性关节疾病。该病多见于中老年人，女性多于男性；多发于负重较大的膝关节、髋关节、腰骶部脊柱关节及第一蹠趾关节等部位。其病理特点为关节软骨退行性改变，组织结构破坏，软骨下骨硬化，关节边缘和软骨下骨反应性增生，骨赘形成。虽然对骨关节炎的研究已非常深入，但传统疗法仅能够在一定程度上改善骨关节炎症状、延缓病情进展，却不能对其有效根治。骨髓间充质干细胞(bonemarrowmesenchymalstemcells,bmscs)是存在于骨髓中的一种非造血功能的干细胞，属于成体干细胞的一种，是由中胚层发育的早期细胞，为骨髓中除造血干细胞以外的另一种干细胞，具有干细胞的共性，具有强大的自我更新能力、多向诱导分化能力，兼具多器官归巢能力及免疫原性低的优势，在组织工程和再生医学领域作为种子细胞具有广阔的应用前景，有望为临床上难以治愈的骨科疾病提供新的治疗策略。bmscs易于体外分离培养，具有强大的扩增能力，且在体外经多次传代依然可以保持基因稳定性，可满足作为组织工程种子细胞的要求；bmscs具有多向分化潜能，不仅可以分化为造血基质细胞，还可以分化为造血以外的组织，如向脂肪细胞、成骨细胞、成软骨细胞、肌腱细胞、内皮细胞、心肌细胞、肝及肺上皮细胞等中胚层细胞分化，向神经元细胞等外胚层细胞分化。近年来兴起的间充质干细胞(mesenchymalstemcells，mscs)移植疗法，为骨关节炎的治疗带来新的希望。mscs具有较强的自我更新能力、增殖能力和多向分化潜能，在特定条件下可分化为软骨细胞。移植mscs到患病关节，可通过多向分化潜能分化为受损的细胞类型，重建软骨组织。中医药研究者也开展了中药诱导mscs向软骨分化的研究，筛选出很多有效的中药复方、提取物和单体。葛根，始载于《本经》，具有解肌退热，生津，透疹，升阳止泻的功效。用于外感发热头痛、项背强痛，口渴，消渴，麻疹不透，热痢，泄泻；高血压颈项强痛。葛根素是葛根的主要有效成分，属于异黄酮苷类化合物，具有提高免疫，增强心肌收缩力，保护心肌细胞，降低血压，抗血小板聚集等作用。葛根素可诱导胚胎干细胞向心肌细胞分化，诱导脐带间充质干细胞向成骨细胞分化，通过刺激分化增强成骨细胞活力。但是，葛根素诱导mscs向软骨分化并未见文献报道。防己，始载于《本经》，具有利水消肿，祛风止痛的功效。用于水肿脚气，小便不利，湿疹疮毒，风湿痹痛，高血压。粉防己碱是从中药防己中提取的一种双苄基异喹啉类生物碱，具有抗炎和免疫抑制作用，可以抑制炎症过程的多个环节，包括抑制炎症细胞功能、抗自由基损伤、抑制炎症介质释放和对抗炎症介质的效应。因此，依据葛根素和粉防己碱的现代药理学研究文献，按照中药“组分配伍”的现代理论，将葛根素和粉防己碱“配伍”使用，共同诱导mscs向软骨分化，用于骨关节炎的治疗。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种药物组合物及其应用，该药物组合物具有能有效诱导骨髓间充质干细胞向软骨分化的能力，达到治疗骨关节炎的目的，而且本发明的药物组合物替代诱导骨髓间充质干细胞成软骨分化的化学物质或细胞因子或激素，共同诱导bmscs向软骨分化，克服了由于价格昂贵和安全性问题而无法广泛应用于临床实践的缺陷，而且葛根素和粉防己碱的抗炎、抗氧化、抗肿瘤活性，可提高干细胞移植的成功率，减少排异反应，降低干细胞向肿瘤分化的风险；并且本发明的药物组合物诱导骨髓间充质干细胞分化成软骨细胞的效果显著，为干细胞移植治疗骨关节炎疾病提供了一种新的bmscs诱导药物来源，为治疗骨关节炎疾病提供了一种新的药物来源。为实现上述目的，本发明提供一种诱导干细胞成软骨分化的药物组合物，其中，所述药物组合物包括葛根素和粉防己碱。其中，所述干细胞选择骨髓间充质干细胞。特别是，所述葛根素与粉防己碱的摩尔配比为1:(5-125)，优选为1:5。本发明另一方面提供上述药物组合物在制备诱导骨髓间充质干细胞分化成软骨细胞的药物或保健品中的应用。其中，所述药物组合物包括葛根素和粉防己碱。特别是，所述葛根素与粉防己碱的摩尔配比为1:(5-125)，优选为1:5。其中，所述药物由葛根素、粉防己碱和药学上可接受的载体组成。特别是，所述药物是通过口服、舌下、经皮、肌肉、皮下、静脉途径给药。本发明再一方面提供上述药物组合物在制备治疗骨关节炎的药物中的应用。本发明又一方面提供一种上述药物组合物在制备干细胞移植治疗骨关节炎的药物中的应用。本发明将葛根素和粉防己碱联合使用，可有效诱导骨髓间充质干细胞分化成软骨细胞，并治疗骨关节炎。本发明具有如下的明显优点：1、本发明发掘了已知化合物葛根素、粉防己碱新的药用价值，将其配伍后用于诱导骨髓间充质干细胞成软骨分化，治疗骨关节炎，并制备成诱导骨髓间充质干细胞分化软骨细胞的药物或保健品，和制备成治疗骨关节炎的药物，为葛根素和粉防己碱的临床应用开拓了新的领域。2、本发明的序列试验表明葛根素、粉防己碱组合物具有显著的诱导和促进骨髓间充质干细胞分化成软骨细胞的效果，葛根素及粉防己碱配伍均能促进bmscs增殖；给药诱导3天葛根素-粉防己碱配伍均可促进bmscs成软骨分化相关基因tgf-β1、aggrecan、sox9、collagenii、collagenx、mmp13mrna表达及相关蛋白sox9、collagenii、collagenx的表达；给药诱导7天葛根素-粉防己碱配伍均可促进软骨分化相关基因aggrecan、sox9、collagenii、collagenx、mmp13mrna表达及相关蛋白sox9、collagenii、collagenx、mmp13的表达；并且诱导具有剂量依赖性。3、本发明的葛根素、粉防己碱组合物的药理作用强，用于预防和治疗骨关节炎具有良好的药用前景；并且本发明的原料葛根素、粉防己碱来源丰富、价廉、临床使用安全，制备工艺简单，可制成各种剂型使用方便，因此易于推广。附图说明图1为葛根素(pue)、粉防己碱(tet)及其组合物给药3天对bmscs成软骨分化sox9蛋白表达的影响的蛋白印迹图；图2为葛根素(pue)、粉防己碱(tet)及其组合物给药3天对bmscs成软骨分化collagenii蛋白表达的影响的蛋白印迹图；图3为葛根素(pue)、粉防己碱(tet)及其组合物给给药3天对bmscs成软骨分化collagenx蛋白表达的影响的蛋白印迹图；图4为葛根素(pue)、粉防己碱(tet)及其组合物给给药3天对bmscs成软骨分化mmp-13蛋白表达的影响的蛋白印迹图；图5为葛根素(pue)、粉防己碱(tet)及其组合物给给药7天对bmscs成软骨分化sox9蛋白表达的影响的蛋白印迹图；图6为葛根素(pue)、粉防己碱(tet)及其组合物给给药7天对bmscs成软骨分化collagenii蛋白表达的影响的蛋白印迹图；图7为葛根素(pue)、粉防己碱(tet)及其组合物给给药7天对bmscs成软骨分化collagenx蛋白表达的影响的蛋白印迹图；图8为葛根素(pue)、粉防己碱(tet)及其组合物给给药7天对bmscs成软骨分化mmp-13蛋白表达的影响的蛋白印迹图。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。但这些实施例仅限于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照厂商所建议的条件。以下通过试验例来进一步阐述本发明所述药物组合物诱导骨髓间充质干细胞向软骨分化的药理作用及其在治疗骨关节炎中的应用，这些试验例包括了本发明药物的药效学试验。葛根素为购自中国食品药品检定研究所的葛根素标准品，hplc标定，含量>95.5％；粉防己碱为购自中国食品药品检定研究所的粉防己碱标准品，hplc标定，含量>99.2％。实施例1配制给药液1、配制葛根素溶液精确称量4.36mg葛根素，溶解于1mldmso中，配制成10-2m葛根素母液，将母液进行分装，保存于-20℃冰箱，使用前经0.22μm孔径一次性无菌针头式滤器过滤，使用时用去离子水作为溶剂依次稀释成浓度为10μm、1μm、0.1μm、0.01μm、0.001μm的5个不同浓度的葛根素给药液。2、配制粉防己碱溶液精确称量6.28mg粉防己碱，溶解于1mldmso中，配制成10-2m粉防己碱母液，将母液进行分装，保存于-20℃冰箱，使用前经0.22μm孔径一次性无菌针头式滤器过滤，使用时用去离子水作为溶剂依次稀释成浓度为10μm、5μm、2.5μm、1.25μm、0.625μm的5个不同浓度的粉防己碱给药液。3、配制葛根素-粉防己碱组合物溶液3-1、高剂量组(h:1μm+5μm)根据步骤1及步骤2所获得葛根素母液及粉防己碱母液，使用细胞培养基(例如：mem-alpha培养基)配制浓度为2μm的葛根素给药液及10μm的粉防己碱给药液，等体积混匀，得到含葛根素浓度为1μm，粉防己碱浓度为5μm的高剂量的葛根素-粉防己碱组合物溶液；3-2、中剂量组(m:0.1μm+2.5μm)根据步骤1及步骤2所获得葛根素母液及粉防己碱母液，使用细胞培养基配制浓度为0.2μm的葛根素给药液及5μm的粉防己碱给药液，等体积混匀，得到含葛根素浓度为0.1μm，粉防己碱浓度为2.5μm的中剂量葛根素-粉防己碱组合物溶液；3-3、低剂量组(l:0.01μm+1.25μm)根据步骤1及步骤2所获得葛根素母液及粉防己碱母液，使用细胞培养基配制浓度为0.02μm的葛根素给药液及2.5μm的粉防己碱给药液，等体积混合后，得到含葛根素浓度为0.01μm，粉防己碱浓度为1.25μm的低剂量的葛根素-粉防己碱组合物溶液；4、配制1000×10ng/mltgf-β1tgf-β1(规格10μg)冻干粉开盖前离心，加入100μl含0.1％bsa的10mm的柠檬酸溶液(ph为3.0)进行溶解，待完全溶解后进行分装，保存于-80℃。实施例2sd大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养及鉴定1、实验动物、试剂健康的spf级spraguedawley(sd)雄性大鼠，4-6周龄，购自北京维通利华实验动物技术有限公司(许可证号：scxk(京)2016-0006)。certifiedfoetalbovineserumqualtifiedforhumanmsc(干细胞培养级胎牛血清)，bioilgicalindustries，美国；mem-alpha培养基，bioilgicalindustries，美国；dmem高糖、低糖无酚红培养基，sigma-aldrich公司，美国；0.25％胰酶消化液(含2.21mm的edta)，corning，美国；cd29(pehamsteranti-ratcd29)、cd45(pe-cytm5mouseanti-ratcd45)、cd54(pemouseanti-ratcd54)、cd90(apcmouseanti-ratcd90/mousecd90.1)、cd11b(fitcmouseanti-ratcd11b)，bdbiosciences公司，美国；recombinanthumanbmp-2、recombinanthumanigf-1、recombinanthumantgf-β3，peprotech公司，美国；mscgotmadipogenicdifferentiationxfmedium，bioilgicalindustries，美国；mscadipo-stainingkit，vivacellbiosciences，英国；alizarinreds，biobasicinc公司，加拿大；2、实验方法2-1、bmscs的分离及培养取4-6周龄sd雄性大鼠1只，10％水合氯醛麻醉，置于75％酒精中浸泡消毒5min，开腹腔，腹主动脉取血，去皮，离断大鼠下肢，置于细胞培养皿中，无菌预冷pbs溶液冲洗2次，将下肢软组织剪去，取出股骨和胫骨，剔净，置于新的装有无菌预冷pbs溶液的细胞培养皿中，放血后的过程在冰盒上操作，细胞培养皿也置于冰盒上；无菌预冷pbs溶液冲洗2次，手术剪剪开骨端，用5ml注射器抽吸mem-alpha培养基于新的细胞培养皿中反复冲洗骨髓腔至发白；将冲洗液置于50ml离心管中，反复吹打为单细胞悬液，经200目细胞筛网过滤后，室温条件下，1000rpm/min离心5min，弃去上清液，以含10％fbs的mem-alpha培养基的完全培养基重悬细胞，接种于3个25cm2细胞培养瓶中，标记为p0，于条件为温度37℃、co2浓度5％、饱和湿度的细胞培养箱中静置培养。全骨髓培养法培养原代细胞48h后首次全量清洗换液，之后每2天换液一次，在倒置相差显微镜下观察细胞生长情况。2-2、bmscs的传代待原代细胞生长至80％-90％融合时，进行传代培养，吸弃培养基，经pbs溶液清洗后，加入0.25％胰酶进行消化，胰酶用量以覆盖整个培养瓶底细胞为准，随后放入温度37℃、co2浓度5％、饱和湿度的细胞培养箱中静置1min，置显微镜下观察，当细胞回缩变圆，细胞间隙变大，轻轻敲打细胞呈流沙状时，加入完全培养基终止消化，轻柔吹打细胞成单细胞悬液，1000rpm/min离心3min，弃去上清液，去除胰酶，加入完全培养基重悬细胞，按1:1的比例传代培养，标记为p1，第2代开始，按1:3比例进行传代，分别记为p2、p3、p4、……。试验例1葛根素及粉防己碱对bmscs增殖的影响(mtt法)1、实验试剂、仪器anti-sox9antibody，anti-col2α1antibody，anti-mmp13antibody，uniq-10columntrizol总rna提取试剂盒，购自生工生物工程(上海)股份有限公司，中国；mem-alpha(1×)minimumessentialmedium，gibco公司，美国；噻唑蓝溴化四唑盐(mtt)，sigma-aldrich公司，美国；recombinanthumantgf-β1，peprotech公司，美国；anti-collagenxantibody，abcam公司，英国；ripa裂解液，sigma-aldrich公司，美国；bca法蛋白检测试剂盒，thermo公司，美国；5×蛋白上样缓冲液，碧云天公司，海门，中国；base，sigma-aldrich公司，美国；temed，biobasicinc公司，加拿大；pvdf膜(0.45μm)，millipore公司，美国；tween20，sigma-aldrich公司，美国；real-timert-pcr试剂盒，sigma-aldrich公司，美国；depc处理水，takara公司，中国；infinitem200型多功能读板机，tecan公司，瑞士；pcr-c1000pcr仪，bio-rad公司，美国；dyy-6c型电泳仪，北京市六一仪器厂，中国；ql-901型涡旋仪，海门市其林贝尔仪器制造有限公司，中国；22-r型高速离心机，beckman公司，美国；victorx5多功能读板机，perkinelmer公司，美国；c1000touch型pcr-c1000仪，thermal(bio-rad)公司，美国；prism7300型荧光定量pcrsystem，appliedbiosystemsinc公司，美国；0.22μm孔径一次性无菌针头式滤器，millipore公司，美国；2、试验方法将bmscs(p3～p6)以1×105个/ml的密度，接种于96孔培养板中，每孔加入100μl细胞悬液，于37℃、co2浓度5％、饱和湿度的细胞培养箱培养；培养24h后，弃去细胞培养液，分别加入新的无酚红培养基及含不同浓度葛根素(10μm、1μm、0.1μm、0.01μm、0.001μm)；不同浓度粉防己碱(10μm、5μm、2.5μm、1.25μm、0.625μm)；不同浓度葛根素及粉防己碱配伍(h：1μm葛根素溶液+5μm粉防己碱溶液、m：0.1μm葛根素溶液+2.5μm粉防己碱溶液、l：0.01μm葛根素溶液+1.25μm粉防己碱溶液)的无酚红细胞培养液，为保持实验的一致性与严谨性，所有的培养基中都加入千分之一的dmso溶液，每组设6个平行孔；其中，不同浓度葛根素及粉防己碱配伍试验中，葛根素与粉防己碱的浓度配比为：高剂量组(h，葛根素的浓度：1μm、粉防己碱的浓度：5μm)、中剂量组(m，葛根素的浓度：0.1μm、粉防己碱的浓度：2.5μm)、低剂量组(l，葛根素的浓度：0.01μm、粉防己碱的浓度：1.25μm)继续培养20h，弃去细胞培养液，每孔加入100μlpbs溶液，再于每孔加入10μl终浓度为5mg/ml的mtt，在细胞培养箱中孵育4h，吸弃上清液，再以每孔100μldmso溶解甲瓒，震荡混匀，使结晶物充分溶解，在波长490nm处测得吸光度值，计算细胞存活率，测定结果如表1-3。细胞成活率(％)＝(添加药物培养后的吸光度值/空白对照组吸光度平均值)×100％即先计算空白对照组吸光度的平均值，之后各个样品的吸光度值除以空白对照组的平均值，最终以百分率表示细胞成活率。为准确计算od值，各个孔od值应减去对应不同浓度药物组的背景吸光度值。本发明中统计学处理采用origin8.0统计软件进行方差分析(one-wayanova)。实验数据均以均数±标准差(mean±sd)表示。以p<0.05表示具有显著性差异。3、试验结果3-1、葛根素单独给药对bmscs增殖的影响如表1，与空白对照组相比，除10μm这个剂量，其他各浓度葛根素组均能不同程度促进bmscs增殖，选取1μm、0.1μm、0.01μm三个浓度用于后续实验；表1不同浓度葛根素对细胞增殖的影响组别细胞成活率(％)空白99.98±0.4710μm98.74±1.211μm111.38±0.54(**)0.1μm111.27±0.65(**)0.01μm110.84±0.75(**)0.001μm105.49±0.83(**)注：**代表与control组比较升高，p<0.013-2、粉防己碱单独给药对bmscs增殖的影响如表2，与空白对照组相比，除10μm这个剂量，其他各浓度粉防己碱组均能不同程度促进bmscs增殖，选取5μm、2.5μm、1.25μm三个浓度用于后续实验；表2不同浓度葛根素对细胞增殖的影响注：##代表与control(空白)组比较降低，p<0.01；**代表与control组比较升高，p<0.013-3、葛根素及粉防己碱配伍(高、中、低剂量组)使用，对bmscs增殖的影响如表3，三个组均能促进bmscs增殖，粉防己碱组和葛根素及粉防己碱配伍组促细胞增殖作用无显著性差异，可用于后续的细胞分子药理学研究。表3葛根素、粉防己碱单独给药及配伍给药对细胞增殖的影响组别细胞成活率(％)组别细胞成活率(％)空白100±0.772.5μm粉防己碱119.62±0.35(**)1μm葛根素109.21±0.69(**)1.25μm粉防己碱109.00±0.96(**)0.1μm葛根素105.26±0.43(**)配伍高剂量125.61±1.01(**)0.01μm葛根素105.14±0.55(**)配伍中剂量118.88±0.98(**)5μm粉防己碱125.61±0.78(**)配伍低剂量109.29±1.55(**)注：**代表与control组比较升高，p<0.01试验例2葛根素及粉防己碱给药3天对bmscs成软骨分化相关基因、蛋白表达的影响1、试验方法1-1、相关基因表达的影响取第4代bmscs，调整细胞密度约为1×105个/ml，接种于6孔板中，每孔3ml，24h后换给药液，阳性对照组(10μg/ltgf-β1)、葛根素单独给药组(1μm、0.1μm、0.01μm)、粉防己碱单独给药组(5μm、2.5μm、1.25μm)、葛根素及粉防己碱配伍给药组(高、中、低剂量)进行给药干预，每组平行4个孔；持续培养3天，用uniq-10trizol离心柱法试剂盒(上海生工公司)提取细胞总rna，逆转录为cdna后以sybrgreen法进行real-timepcr实验，以gapdh为内参对照，测定经药物诱导后bmscs中软骨分化与功能相关基因tgf-β1，aggrecan，sox9，collagenii，collagenx和mmp13的mrna表达水平，引物序列见表4。(rna提取方法及浓度的检测、逆转录合成cdna以及rt-pcr扩增的实验方法及步骤按照商品化试剂盒说明书操作)表4软骨分化相关基因rt-pcr引物序列注：forward为正向引物；reverse为反向引物1-2、相关蛋白表达的影响取第4代bmscs，调整细胞密度约为1×105个/ml，接种于6孔板中，每孔3ml，24h后换给药液阳性对照组(10μg/ltgf-β1)、葛根素单独给药组(1μm、0.1μm、0.01μm)、粉防己碱单独给药组(5μm、2.5μm、1.25μm)、葛根素及粉防己碱配伍给药组((高剂量h:1μm葛根素溶液+5μm粉防己碱溶液)、(中剂量组m:0.1μm葛根素溶液+2.5μm粉防己碱溶液)、(低剂量组l:0.01μm葛根素溶液+1.25μm粉防己碱溶液))进行给药干预，每组平行3个孔；持续培养3天，中间换给药液一次，用哺乳动物细胞蛋白提取试剂盒(上海生工公司)提取细胞总蛋白，提取液中加入蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂，bca法进行蛋白定量测定，以westernblot方法测定经药物诱导后bmscs中与软骨分化与功能相关蛋白(sox9，collagenii，collagenx和mmp13)的表达水平，其中gapdh为内参，目的蛋白及内参蛋白的一抗、二抗稀释比例见表5。(蛋白提取方法、westernblot实验步骤按照通用实验方法操作)westernblotting实验所需各溶液的配制：1)10％过硫酸铵(ap)溶液：精密称取0.1g过硫酸铵溶解于1.0ml超纯水中，溶解后用锡箔纸包裹于4℃保存，可使用一周，一周后需重新配制。2)1.5mol/ltris-hcl溶液：精密称取45.43gtris溶解于200ml超纯水中，用浓盐酸调节ph值至ph＝8.8，超纯水定容至250ml。3)1.0mol/ltris-hcl溶液：精密称取30.29gtris溶解于200ml超纯水中，用浓盐酸调节ph值至ph＝7.5，超纯水定容至250ml。4)0.5mol/ltris-hcl溶液：精密称取15.14gtris溶解于200ml超纯水中，用浓盐酸调节ph值至ph＝6.8，超纯水定容至250ml。5)10％十二烷基硫酸钠(sds)溶液：精密称取10gsds于50℃水浴条件下溶解于100ml超纯水中，溶解完全后室温保存。6)sds-page电泳缓冲液：(2.5mmtris；0.25mol/l甘氨酸；0.1％sds)7)蛋白质转膜缓冲液：(48mmtris；39mm甘氨酸；0.037％sds；20％meoh)8)sds-聚丙烯酰胺凝胶的制备9)tbs溶液的配制表5目的蛋白及内参蛋白的一抗、二抗稀释比例westernblot实验提取总蛋白步骤：1)配制蛋白裂解液，预冷；2)收集细胞或组织，小心轻缓吸出培养基，预冷pbs溶液清洗2次，吸出剩余的pbs，加入适量1×的含有蛋白酶抑制剂及磷酸酶抑制剂的细胞裂解液(组织质量：体积按照mg/ml)，在冰上裂解5-10min，全部用细胞刮刮下，超声破碎，5s/次、超声3次，直到超声完全；3)将超声破碎后的细胞或组织，在摇床上90rpm/min冰浴30min；4)12000rpm，4℃，离心10min，上清即蛋白。样品制备：确保每个蛋白样品的上样量一致，采用bca法测得的样本蛋白浓度，以确定上样中的蛋白量，并将5×sds-pages上样缓冲液与样本体积按照1:4的比例混合，涡旋混合均匀，将样本置于沸水中水浴5min，使蛋白变性，置于4℃保存备用。实验具体步骤：1)制胶：按照1中(9)制胶比例制备分离胶，按顺序依次加入50ml小烧杯中，并逐一混匀，加完temed后立即往制胶器中灌胶，按一面来说，950μl/次，共加7次，加时最好沿玻璃壁缓缓加入，避免产生气泡，若已产生气泡用注射器针头赶走气泡。加1ml无水甲醇封闭，静置，待胶凝固，约10-30min(温度越高，凝胶所需时间越短)。弃去甲醇，用少量的浓缩胶润洗，将配置好的浓缩胶加入制胶器中，尽可能加满，插入梳子，避免气泡的产生，用力要均匀，静置，待胶凝固(约40min)。2)上样：向制胶器内部加满电泳液后拔出梳子，若加样孔不均匀，可用针头调整进样孔(轻轻拨动即可，并且避免针头将胶扎破)。进样孔内加入一定量的蛋白质样品(垂直加入，控制速度)，一般上样为10μl，控制蛋白量在30-50μg，具体的上样体积蛋白定量后决定，并在特定孔内加入5μlmarker。3)电泳：加外部电压，样本在浓缩胶中分离时电压为80v，待样品电泳至浓缩胶与分离胶边缘时(大约30min)，将电压增大至100v，直至电泳至目的蛋白完全分离或者达分离胶底部(大约60-90min)时停止电泳。4)转膜：配制转膜液并于冰浴或冰箱4℃预冷；按marker指示的蛋白质位置切下所需检测的目的蛋白条带，置于转膜缓冲液中，同时将聚偏二氟乙烯(pvdf)膜(0.45μm孔径)用无水甲醇浸泡(5min，活化pvdf膜)后，置转膜液中；准备好厚滤纸，棉芯片，用转膜液浸泡。；制备三明治：黑色夹子对应负极，白色夹子对应正极，凝胶对应负极，膜对应正极。信号由负到正(黑色夹板→浸湿的棉芯→滤纸→凝胶→pvdf膜(剪角，赶气泡)→滤纸→棉芯→白色夹板)，剪角做标记，转膜时间长短根据目的蛋白分子量大小而定(如表5a)。表5a不同蛋白及胶浓度下转膜所需时间(根据要检测的目的蛋白分子量，本次实验选用10％的分离胶)5)封闭：取出pvdf膜，置于0.1％tbst溶液中稍加漂洗，以封闭液封闭即可。封闭液为含5％脱脂奶粉的0.1％tbst溶液，在摇床上慢速(60-70rpm)封闭1.5h。6)一抗孵育：用5％脱脂奶粉配制一定浓度及体积的一抗溶液，并将pvdf膜放置于一抗溶液中，摇床孵育1h后，4℃过夜，孵育时应在水平面上。7)洗膜：用0.5％tbst溶液洗膜，梯度洗4-5次，5min→10min→7min→5min(最后这次用0.1％tween-20的tbst溶液洗膜)。时间和转速依具体情况而定。8)二抗孵育：根据一抗选择二抗，加入一定量稀释成一定比例的二抗溶液，以60r/min的速度摇床孵育1h。9)洗膜：按照7)的洗膜方式洗膜。10)显色：取出pvdf膜吸干水分，ecl显色剂加发光底物(1:1)浸泡膜2-5min。暗室中以x光片进行显影、定影，冲洗胶片。11)数据处理：扫描条带，获得蛋白印迹图像，imagej计算灰度值。2、试验结果药物作用3天软骨分化相关基因tgf-β1、aggrecan、sox9、collagenii、collagenx、mmp13mrna表达及相关蛋白sox9、collagenii、collagenx、mmp13表达情况如表6-15及图1-4所示。2-1、tgf-β1mrna表达葛根素及粉防己碱诱导bmscs成软骨分化3天时，除葛根素高、中剂量组，葛根素及粉防己碱配伍高剂量组外，其他给药各组均能不同程度的促进tgf-β1mrna表达，如表6。表6葛根素及粉防己碱给药3天对bmscs成软骨分化tgf-β1mrna表达的影响注：##表示与control组比较表达降低，p<0.01；**表示与control组比较表达升高，p<0.012-2、aggrecanmrna表达葛根素及粉防己碱诱导bmscs成软骨分化3天时，葛根素中、低剂量，粉防己碱低剂量和葛根素及粉防己碱配伍低剂量可不同程度的促进aggrecanmrna表达，阳性药tgf-β1组相较于其他各组可明显促进aggrecanmrna表达，如表7。表7葛根素及粉防己碱给药3天对bmscs成软骨分化aggrecanrna表达的影响组别变化倍率组别变化倍率空白1.00±0.022.5μm粉防己碱0.93±0.0310ng/mltgf-β13.25±0.11(**)1.25μm粉防己碱1.18±0.07(*)1μm葛根素0.99±0.03配伍高剂量0.52±0.19(#)0.1μm葛根素1.11±0.08配伍中剂量0.83±0.130.01μm葛根素1.4±0.16(*)配伍低剂量1.09±0.125μm粉防己碱0.87±0.01(##)注：##表示与control组比较表达降低，p<0.01；#表示与control组比较表达降低，p<0.05；**表示与control组比较表达升高，p<0.01；*表示与control组比较表达升高，p<0.052-3、sox9mrna，sox9蛋白表达葛根素及粉防己碱诱导bmscs成软骨分化3天时，除葛根素高剂量组、粉防己碱中剂量组外，其他给药各组均能不同程度的促进sox9mrna表达，如表8。葛根素及粉防己碱给药各组均能不同程度促进sox9蛋白表达，且粉防己碱低剂量组效果最佳，如图1及表9所示。表8葛根素及粉防己碱给药3天对bmscs成软骨分化sox9mrna表达的影响注：**表示与control组比较表达升高，p<0.01；*表示与control组比较表达升高，p<0.05表9葛根素及粉防己碱给药3天对bmscs成软骨分化sox9蛋白表达的影响组别变化倍率组别变化倍率空白1.00±0.002.5μm粉防己碱1.34±0.00(**)10ng/mltgf-β11.46±0.01(**)1.25μm粉防己碱1.56±0.00(**)1μm葛根素1.28±0.00(**)配伍高剂量1.34±0.00(**)0.1μm葛根素1.52±0.01(**)配伍中剂量1.14±0.00(**)0.01μm葛根素1.40±0.01(**)配伍低剂量1.08±0.00(**)5μm粉防己碱1.25±0.00(**)注：**表示与control组比较表达升高，p<0.012-4、collageniimrna、collagenii蛋白表达如表10所示，葛根素及粉防己碱诱导bmscs成软骨分化3天时，除粉防己碱中剂量组，葛根素及粉防己碱配伍的高剂量组外，其他给药各组均能不同程度的促进collageniimrna表达。如图2及表11所示，葛根素及粉防己碱给药各组均能不同程度促进collagenii蛋白表达，且葛根素及粉防己碱配伍高剂量组效果最佳。表10葛根素及粉防己碱给药3天对bmscs成软骨分化collageniimrna表达的影响组别变化倍率组别变化倍率空白0.96±0.222.5μm粉防己碱0.73±0.3010ng/mltgf-β12.24±0.30(**)1.25μm粉防己碱1.71±0.321μm葛根素1.09±0.21配伍高剂量0.75±0.260.1μm葛根素1.20±0.24配伍中剂量1.79±0.34(*)0.01μm葛根素1.19±0.20配伍低剂量1.41±0.425μm粉防己碱1.65±0.39注：**表示与control组比较表达升高，p<0.01；*表示与control组比较表达升高，p<0.05表11葛根素及粉防己碱给药3天对bmscs成软骨分化collagenii蛋白表达的影响注：**表示与control(空白)组比较表达升高，p<0.012-5、collagenxmrna，collagenx蛋白表达如表12所示，葛根素及粉防己碱诱导bmscs成软骨分化3天时，粉防己碱高、低剂量组、葛根素及粉防己碱配伍的高中低三组可促进collagenxmrna表达，但没有显著性差异；如图3及表13所示，葛根素及粉防己碱给药各组均能不同程度促进collagenx蛋白表达，且葛根素及粉防己碱配伍高剂量组效果最佳，阳性药tgf-β1组可显著抑制collagenx蛋白表达。表12葛根素及粉防己碱给药3天对bmscs成软骨分化collagenxmrna表达的影响组别变化倍率组别变化倍率空白1.04±0.212.5μm粉防己碱0.75±0.0610ng/mltgf-β11.63±0.021.25μm粉防己碱1.62±0.391μm葛根素1.00±0.13配伍高剂量1.38±0.130.1μm葛根素1.03±0.05配伍中剂量1.61±0.210.01μm葛根素0.92±0.07配伍低剂量1.64±0.235μm粉防己碱1.71±0.17表13葛根素及粉防己碱给药3天对bmscs成软骨分化collagenx蛋白表达的影响组别变化倍率组别变化倍率空白1.00±0.022.5μm粉防己碱1.29±0.03(**)10ng/mltgf-β10.47±0.01(##)1.25μm粉防己碱1.60±0.03(**)1μm葛根素1.27±0.03(**)配伍高剂量1.83±0.03(**)0.1μm葛根素1.33±0.02(**)配伍中剂量1.48±0.03(**)0.01μm葛根素1.36±0.03(**)配伍低剂量1.58±0.03(**)5μm粉防己碱1.38±0.03(**)注：##表示与control组比较表达降低，p<0.01；**表示与control组比较表达升高，p<0.012-6、mmp13mrna，mmp13蛋白表达如表14所示，葛根素及粉防己碱诱导bmscs成软骨分化3天时，除葛根素低剂量组、粉防己碱高剂量组、葛根素及粉防己碱配伍高剂量组，其他给药各组均能不同程度的促进mmp13mrna表达，且具有剂量依赖性，阳性药tgf-β1组可显著抑制mmp13mrna表达；如图4表15所示，葛根素高中低剂量组、葛根素及粉防己碱配伍高剂量组可不同程度促进mmp13蛋白表达，且葛根素高中低剂量组有剂量依赖性，阳性药tgf-β1组可显著促进mmp13蛋白表达。表14葛根素及粉防己碱给药3天对bmscs成软骨分化mmp-13mrna表达的影响组别变化倍率组别变化倍率空白1.01±0.112.5μm粉防己碱1.26±0.0810ng/mltgf-β10.41±0.01(##)1.25μm粉防己碱1.30±0.051μm葛根素1.22±0.01配伍高剂量0.81±0.050.1μm葛根素1.04±0.06配伍中剂量1.36±0.050.01μm葛根素0.74±0.32配伍低剂量1.46±0.03(*)5μm粉防己碱0.89±0.01注：##表示与control组比较表达降低，p<0.01；*表示与control组比较表达升高，p<0.05表15葛根素及粉防己碱给药3天对bmscs成软骨分化mmp-13蛋白表达的影响组别变化倍率组别变化倍率空白1.00±0.002.5μm粉防己碱0.81±0.00(##)10ng/mltgf-β11.09±0.00(**)1.25μm粉防己碱0.94±0.01(##)1μm葛根素1.08±0.00(**)配伍高剂量1.00±0.000.1μm葛根素1.15±0.00(**)配伍中剂量0.86±0.00(##)0.01μm葛根素1.05±0.00(**)配伍低剂量0.84±0.00(##)5μm粉防己碱0.83±0.00(##)注：##表示与control组比较表达降低，p<0.01；**表示与control组比较表达升高，p<0.01试验例3葛根素及粉防己碱给药7天对bmscs成软骨分化相关基因、蛋白表达的影响1、试验方法1-1、相关基因表达的影响除了持续培养7天，没两天换给药液一次之外，其余与试验例2的相关基因表达的影响的方法相同；1-2、相关蛋白表达的影响除了持续培养7天，没两天换给药液一次之外，其余与试验例2的相关蛋白表达的影响的方法相同；2、试验结果药物作用7天软骨分化相关基因tgf-β1、aggrecan、sox9、collagenii、collagenx、mmp13mrna表达及相关蛋白sox9、collagenii、collagenx、mmp13表达情况如图5-8及表16-25所示。2-1、tgf-β1mrna表达如表16所示，葛根素及粉防己碱诱导bmscs成软骨分化7天时，葛根素高、低给药组可促进tgf-β1mrna表达，其他给药各组均不同程度的抑制tgf-β1mrna表达，且具有剂量依赖性。表16葛根素及粉防己碱给药7天对bmscs成软骨分化tgf-β1mrna表达的影响组别变化倍率组别变化倍率空白0.97±0.022.5μm粉防己碱0.73±0.03(##)10ng/mltgf-β10.56±0.01(##)1.25μm粉防己碱0.63±0.04(##)1μm葛根素1.02±0.00配伍高剂量0.66±0.01(##)0.1μm葛根素0.91±0.02配伍中剂量0.66±0.03((##)0.01μm葛根素1.03±0.02配伍低剂量0.73±0.03(##)5μm粉防己碱0.57±0.01(##)注：##表示与control组比较表达降低，p<0.012-2、aggrecanmrna表达如表17所示，葛根素及粉防己碱诱导bmscs成软骨分化7天时，除葛根素高剂量组外，其他给药各组均能不同程度的促进aggrecanmrna表达，且具有剂量依赖性，阳性药tgf-β1组相较于给药3天时，aggrecanmrna表达有所下调，这一结果与bmscs进入成软骨分化中后期相关。表17葛根素及粉防己碱给药7天对bmscs成软骨分化aggrecanmrna表达的影响组别变化倍率组别变化倍率空白1.10±0.092.5μm粉防己碱1.55±0.08(*)10ng/mltgf-β11.42±0.331.25μm粉防己碱1.32±0.081μm葛根素0.67±0.10(#)配伍高剂量2.94±0.13(**)0.1μm葛根素1.38±0.12配伍中剂量2.14±0.14(**)0.01μm葛根素1.21±0.31配伍低剂量1.17±0.155μm粉防己碱2.03±0.27(*)注：#表示与control组比较表达降低，p<0.05；**表示与control组比较表达升高，p<0.01；*表示与control组比较表达升高，p<0.052-3、sox9mrna，sox9蛋白表达如表18所示，葛根素及粉防己碱诱导bmscs成软骨分化7天时，葛根素及粉防己碱各给药组均能不同程度的促进sox9mrna表达，且具有剂量依赖性；如图5及表19所示，葛根素及粉防己碱各给药组均能不同程度的促进sox9蛋白表达，且具有剂量依赖性，其中粉防己碱低剂量组效果最佳。表18葛根素及粉防己碱给药7天对bmscs成软骨分化sox9mrna表达的影响组别变化倍率组别变化倍率空白0.96±0.132.5μm粉防己碱1.42±0.1510ng/mltgf-β11.06±0.051.25μm粉防己碱1.09±0.051μm葛根素1.22±0.01配伍高剂量3.03±0.03(**)0.1μm葛根素1.26±0.04配伍中剂量1.68±0.10(*)0.01μm葛根素1.15±0.19配伍低剂量1.06±0.175μm粉防己碱1.70±0.10(*)注：**表示与control组比较表达升高，p<0.05；*表示与control组比较表达升高，p<0.05表19葛根素及粉防己碱给药7天对bmscs成软骨分化sox9蛋白表达的影响注：**表示与control组比较表达升高，p<0.012-4、collageniimrna、collagenii蛋白表达，如表20所示，葛根素及粉防己碱诱导bmscs成软骨分化7天时，除葛根素低剂量组外，其他给药各组均能不同程度的促进collageniimrna表达，且具有剂量依赖性；如图6及表21所示，葛根素及粉防己碱给药各组均能不同程度的促进collagenii蛋白表达，且具有剂量依赖性，其中葛根素及粉防己碱配伍高剂量组效果最佳。表20葛根素及粉防己碱给药7天对bmscs成软骨分化collageniimrna表达的影响组别变化倍率组别变化倍率空白0.88±0.022.5μm粉防己碱1.52±0.18(*)10ng/mltgf-β11.49±0.431.25μm粉防己碱1.13±0.05(**)1μm葛根素1.05±0.03(**)配伍高剂量1.49±0.02(**)0.1μm葛根素1.40±0.23配伍中剂量1.43±0.17(*)0.01μm葛根素0.82±0.20配伍低剂量0.99±0.105μm粉防己碱1.05±0.07注：**表示与control组比较表达升高，p<0.05；*表示与control组比较表达升高，p<0.05表21葛根素及粉防己碱给药7天对bmscs成软骨分化collagenii蛋白表达的影响组别变化倍率组别变化倍率空白1.00±0.002.5μm粉防己碱6.43±0.01(**)10ng/mltgf-β12.43±0.00(**)1.25μm粉防己碱6.09±0.01(**)1μm葛根素2.83±0.00(**)配伍高剂量10.58±0.02(**)0.1μm葛根素4.85±0.00(**)配伍中剂量8.49±0.02(**)0.01μm葛根素3.29±0.01(**)配伍低剂量4.32±0.00(**)5μm粉防己碱9.80±0.01(**)注：**表示与control组比较表达升高，p<0.012-5、collagenxmrna，collagenx蛋白表达如表22所示，葛根素及粉防己碱诱导bmscs成软骨分化7天时，除葛根素低剂量组外，其他给药各组均能不同程度的促进collagenxmrna表达，且具有剂量依赖性，葛根素及粉防己碱配伍高剂量组效果最佳；如图7及表23所示，葛根素及粉防己碱给药各组均能不同程度的促进collagenx蛋白表达，且具有剂量依赖性，其中葛根素中剂量组效果最佳，阳性药tgf-β1组可显著抑制collagenx蛋白表达。表22葛根素及粉防己碱给药7天对bmscs成软骨分化collagenxmrna表达的影响组别变化倍率组别变化倍率空白1.07±0.152.5μm粉防己碱1.84±0.18(*)10ng/mltgf-β11.55±0.341.25μm粉防己碱1.14±0.021μm葛根素1.11±0.07配伍高剂量3.42±0.18(**)0.1μm葛根素1.35±0.14配伍中剂量2.30±0.30(*)0.01μm葛根素0.92±0.23配伍低剂量1.51±0.235μm粉防己碱1.68±0.14(*)注：**表示与control组比较表达升高，p<0.01；*表示与control组比较表达升高，p<0.05表23葛根素及粉防己碱给药7天对bmscs成软骨分化collagenx蛋白表达的影响组别变化倍率组别变化倍率空白1.00±0.002.5μm粉防己碱1.12±0.00(**)10ng/mltgf-β10.02±0.00(##)1.25μm粉防己碱1.57±0.00(**)1μm葛根素1.49±0.00(**)配伍高剂量1.37±0.00(**)0.1μm葛根素1.76±0.00(**)配伍中剂量1.43±0.00(**)0.01μm葛根素1.60±0.00(**)配伍低剂量1.32±0.00(**)5μm粉防己碱1.15±0.00(**)注：##表示与control组比较表达降低，p<0.01；**表示与control组比较表达升高，p<0.012-6、mmp13mrna、mmp13蛋白表达如表24所示，葛根素及粉防己碱诱导bmscs成软骨分化7天时，除葛根素高、中剂量组，其他给药各组均能不同程度的促进mmp13mrna表达，且具有剂量依赖性；如图8及表25所示，除粉防己碱高剂量组外，其他给药各组均能不同程度的促进mmp13蛋白表达，且具有剂量依赖性，其中葛根素低剂量组效果最佳。表24葛根素及粉防己碱给药7天对bmscs成软骨分化mmp-13mrna表达的影响注：#表示与control组比较表达降低，p<0.05；**表示与control组比较表达升高，p<0.01表25葛根素及粉防己碱给药7天对bmscs成软骨分化mmp-13蛋白表达的影响组别变化倍率组别变化倍率空白1.00±0.002.5μm粉防己碱1.41±0.00(**)10ng/mltgf-β11.46±0.00(**)1.25μm粉防己碱2.42±0.01(**)1μm葛根素1.91±0.00(**)配伍高剂量1.20±0.00(**)0.1μm葛根素2.42±0.00(**)配伍中剂量1.72±0.00(**)0.01μm葛根素2.87±0.00(**)配伍低剂量1.07±0.00(**)5μm粉防己碱0.81±0.00(##)注：##表示与control组比较表达降低，p<0.01；**表示与control组比较表达升高，p<0.01给药3天或7天，不同浓度的葛根素、粉防己碱和葛根素及粉防己碱配伍均可促进bmscs成软骨分化相关基因aggrecan、sox9、collagenii、collagenⅹ、mmp13mrna表达及相关蛋白sox9、collagenii、collagenⅹ、mmp13的表达，且不同浓度的粉防己碱配伍对bmscs成软骨分化中期相关蛋白表达的促进作用优于葛根素，可以将葛根素与粉防己碱的组合物用于骨关节炎的治疗，可以用作干细胞移植治疗骨关节炎的药物。当前第1页12