本发明涉及脂质体的制备技术领域，具体涉及一种产氧纳米脂质体的制备方法。
背景技术：
脂质体是指将药物包封于类脂质双分子层形成的薄膜中间所制成的超微型球状药物载体制剂，由于其结构类似生物膜，可包封水溶性和脂溶性药物，具有减少药物剂量，降低毒性，延缓释放，改变药物体内分布，并具有靶向治疗效应，提高药物疗效。
肿瘤治疗是当今的未解难题，是医学界一直面临的一个重大挑战。药物治疗是肿瘤治疗的一个重要手段，传统抗肿瘤药物虽取得一定的疗效，但其造成的过敏反应、骨髓造血系统抑制、脱发等毒副作用，极大限制了其在临床应用，成为临床治疗的难题之一。如何提高肿瘤治疗的疗效是当今医学一个亟待解决的问题。缺氧是实体肿瘤微环境的一个重要特征，在缺氧环境下，肿瘤细胞通过改变代谢方式来促进肿瘤细胞的转移,抑制机体抗肿瘤免疫反应。肿瘤核心中的缺氧环境会引起抵抗，抗癌疗法，通过改善缺氧肿瘤的氧分压或提高其活性氧浓度，有望成为提高恶性实体肿瘤疗效的有效途径。
现有研究制备出的可产氧的纳米脂质体，安全性性能差，稳定性不高，还不能满足提高恶性实体肿瘤疗效的需求，需要进一步提高。
技术实现要素：
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种产氧量高、性能稳定、可实现缓控放氧的产氧纳米脂质体的制备方法。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：一种产氧纳米脂质体的制备方法，包括以下步骤：
（1）在非极性有机溶剂中加入大豆卵磷脂，涡旋，并于超声波下混合4min～6min，得到混和液，每毫升非极性有机溶剂中大豆卵磷脂的加入量为10mg～40mg；
（2）在混和液中加入20mg/ml～30mg/ml的果胶溶液，搅拌35min～45min，并于超声波下混合18min～25min，得到混悬液，所述果胶溶液与步骤（1）中的非极性有机溶剂的体积比为0.8～1.2:100；
（3）在混悬液中加入10mg/ml～20mg/ml的过碳酸钠溶液，涡旋，并于10℃～15℃下超声波混合18min～25min，得到混合搅拌液，所述过碳酸钠溶液与步骤（1）中的非极性有机溶剂的体积比为0.8～1.2:100；
（4）在混合搅拌液中加入1.4mg/ml～1.8mg/ml的氢氧化钙溶液，在10℃～15℃下搅拌8min～12min,并于10℃～15℃下超声波混合18min～25min，得到氢氧化钙溶液混和液，所述氢氧化钙溶液与步骤（1）中的非极性有机溶剂的体积比为9～11:100；
（5）将氢氧化钙溶液混和液于2℃～4℃下，静置1.8h～2.2h，涡旋，并于超声波下混合28min～33min，得到低温混合物；
（6）将低温混合物放入圆底烧瓶内旋转蒸发，以去除非极性有机溶剂，得到旋转蒸发产物；
（7）在旋转蒸发产物中加入超纯水，并于超声波下混合，得到旋转蒸发产物混合液，所述超纯水与步骤（1）中的非极性有机溶剂的体积比为0.8～1.2:1；
（8）将旋转蒸发产物混合液倒入离心管中，加入超纯水，并于超声波下混合18min～25min，再于温度为10℃～15℃、转速为4000r/min～6000r/min的条件下离心8min～12min，取上层清液，即得所述产氧纳米脂质体。
进一步地，所述步骤（1）中的非极性有机溶剂为氯仿、环已烷、乙醚、苯、三氯甲烷、正己烷中的一种或多种。
进一步地，所述步骤（1）中在非极性有机溶剂中加入大豆卵磷脂，涡旋，并于超声波下混合5min，得到混和液，每毫升非极性有机溶剂中大豆卵磷脂的加入量为14mg。
进一步地，所述步骤（2）中在混和液中加入25mg/ml的果胶溶液，搅拌40min，并于超声波下混合20min，得到混悬液，所述果胶溶液与步骤（1）中的非极性有机溶剂的体积比为1:100。
进一步地，所述步骤（3）中在混悬液中加入15mg/ml的过碳酸钠溶液，涡旋，并于12℃下超声波混合20min，得到混合搅拌液，所述过碳酸钠溶液与步骤（1）中的非极性有机溶剂的体积比为1:100。
进一步地，所述步骤（4）中在混合搅拌液中加入1.6mg/ml的氢氧化钙溶液，在12℃下搅拌10min,并于12℃下超声波混合20min，得到氢氧化钙溶液混和液，所述氢氧化钙溶液与步骤（1）中的非极性有机溶剂的体积比为10:100。
进一步地，所述步骤（5）中将氢氧化钙溶液混和液于3℃下，静置2h，涡旋，并于超声波下混合30min，得到低温混合物。
进一步地，所述步骤（7）中在旋转蒸发产物中加入超纯水，并于超声波下混合，得到旋转蒸发产物混合液，所述超纯水与步骤（1）中的非极性有机溶剂的体积比为1:1。
进一步地，所述步骤（8）中将旋转蒸发产物混合液倒入离心管中，加入超纯水，并于超声波下混合20min，再于温度为12℃、转速为5000r/min的条件下离心10min，取上层清液，即得所述产氧纳米脂质体。
本发明还提供一种制备得到的产氧纳米脂质体在实体肿瘤细胞上的应用。
本发明一种产氧纳米脂质体的制备方法，原理为：在非极性有机溶剂中，加入大豆卵磷脂和果胶溶液，利用过碳酸钠溶液与氢氧化钙溶液在低温下反应，生成过氧化物，而氢氧化钙溶液与果胶溶液又可发生交联反应，在过氧化物外包裹一层果胶钙凝胶膜，其通过在卵磷脂-非极性有机溶剂中，涡旋超声混合，反相蒸发后，加水涡旋超声后做成产氧脂质体。
本发明一种产氧纳米脂质体的制备方法的有益效果为：1）制备工艺简单，可重复性高，制备难度小，易于推广应用；2）制备得到的产氧纳米脂质体的产氧量高，在冷冻条件下可长期保存，室温下有效的释放氧的时间高达55h～60h，性能稳定性高；3）使用的原料成分简单无毒，安全性能高。
具体实施方式
本发明一种产氧纳米脂质体的制备方法中的非极性有机溶剂可以是氯仿、环已烷、乙醚、苯、三氯甲烷、正己烷等中的一种或多种。
下面的实施例仅以非极性有机溶剂为其中的几种为例，可以帮助本领域的技术人员更全面地理解本发明，但不可以以任何方式限制本发明。
实施例1
一种产氧纳米脂质体的制备方法，包括以下步骤：
（1）在环己烷中加入大豆卵磷脂，涡旋，并于超声波下混合4min，得到混和液，每毫升有环己烷中大豆卵磷脂的加入量为10mg；
（2）在混和液中加入20mg/ml的果胶溶液，搅拌35min，并于超声波下混合18min得到混悬液，所述果胶溶液与步骤（1）中的环己烷的体积比为0.8:100；
（3）在混悬液中加入10mg/ml的过碳酸钠溶液，涡旋，并于10℃下超声波混合18min，得到混合搅拌液，所述过碳酸钠溶液与步骤（1）中的环己烷的体积比为0.8:100；
（4）在混合搅拌液中加入1.4mg/ml的氢氧化钙溶液，在10℃下搅拌8min,并于10℃下超声波混合18min，得到氢氧化钙溶液混和液，所述氢氧化钙溶液与步骤（1）中的环己烷的体积比为9:100；
（5）将氢氧化钙溶液混和液于2℃下，静置1.8h，涡旋，并于超声波下混合28min，得到低温混合物；
（6）将低温混合物放入圆底烧瓶内旋转蒸发，以去除环己烷，得到旋转蒸发产物；
（7）在旋转蒸发产物中加入超纯水，并于超声波下混合，得到旋转蒸发产物混合液，所述超纯水与步骤（1）中的环己烷的体积比为0.8:1；
（8）将旋转蒸发产物混合液倒入离心管中，加入超纯水，并于超声波下混合18min，再于温度为10℃、转速为4000r/min的条件下离心8min，取上层清液，即得所述产氧纳米脂质体。
实施例2
一种产氧纳米脂质体的制备方法，包括以下步骤：
（1）在氯仿中加入大豆卵磷脂，涡旋，并于超声波下混合6min，得到混和液，每毫升氯仿中大豆卵磷脂的加入量为15mg；
（2）在混和液中加入30mg/ml的果胶溶液，搅拌45min，并于超声波下混合25min，得到混悬液，所述果胶溶液与步骤（1）中的氯仿的体积比为1.2:100；
（3）在混悬液中加入20mg/ml的过碳酸钠溶液，涡旋，并于15℃下超声波混合25min，得到混合搅拌液，所述过碳酸钠溶液与步骤（1）中的氯仿的体积比为1.2:100；
（4）在混合搅拌液中加入1.8mg/ml的氢氧化钙溶液，在15℃下搅拌12min,并于15℃下超声波混合25min，得到氢氧化钙溶液混和液，所述氢氧化钙溶液与步骤（1）中的氯仿的体积比为11:100；
（5）将氢氧化钙溶液混和液于4℃下，静置2.2h，涡旋，并于超声波下混合33min，得到低温混合物；
（6）将低温混合物放入圆底烧瓶内旋转蒸发，以去除氯仿，得到旋转蒸发产物；
（7）在旋转蒸发产物中加入超纯水，并于超声波下混合，得到旋转蒸发产物混合液，所述超纯水与步骤（1）中的氯仿的体积比为1.2:1；
（8）将旋转蒸发产物混合液倒入离心管中，加入超纯水，并于超声波下混合25min，再于温度为15℃、转速为6000r/min的条件下离心12min，取上层清液，即得所述产氧纳米脂质体。
实施例3
一种产氧纳米脂质体的制备方法，包括以下步骤：
（1）在氯仿与环已烷的混合溶剂中加入大豆卵磷脂，涡旋，并于超声波下混合5min，得到混和液，每毫升氯仿与环已烷的混合溶剂中大豆卵磷脂的加入量为25mg，所述氯仿与环已烷的混合溶剂中氯仿与环已烷的体积比为氯仿：环已烷=1:1；
（2）在混和液中加入25mg/ml的果胶溶液，搅拌40min，并于超声波下混合20min，得到混悬液，所述果胶溶液与步骤（1）中的氯仿与环已烷的混合溶剂的体积比为1:100；
（3）在混悬液中加入15mg/ml的过碳酸钠溶液，涡旋，并于12℃下超声波混合20min，得到混合搅拌液，所述过碳酸钠溶液与步骤（1）中的氯仿与环已烷的混合溶剂的体积比为1:100；
（4）在混合搅拌液中加入1.6mg/ml的氢氧化钙溶液，在12下搅拌10min,并于12℃下超声波混合20min，得到氢氧化钙溶液混和液，所述氢氧化钙溶液与步骤（1）中的氯仿与环已烷的混合溶剂的体积比为10:100；
（5）将氢氧化钙溶液混和液于3℃下，静置2h，涡旋，并于超声波下混合30min，得到低温混合物；
（6）将低温混合物放入圆底烧瓶内旋转蒸发，以去除氯仿与环已烷的混合溶剂，得到旋转蒸发产物；
（7）在旋转蒸发产物中加入超纯水，并于超声波下混合，得到旋转蒸发产物混合液，所述超纯水与步骤（1）中的氯仿与环已烷的混合溶剂的体积比为1:1；
（8）将旋转蒸发产物混合液倒入离心管中，加入超纯水，并于超声波下混合20min，再于温度为12℃、转速为5000r/min的条件下离心10min，取上层清液，即得所述产氧纳米脂质体。
实施例4
一种产氧纳米脂质体的制备方法，包括以下步骤：
（1）在乙醚中加入大豆卵磷脂，涡旋，并于超声波下混合5.5min，得到混和液，每毫升乙醚中大豆卵磷脂的加入量为40mg；
（2）在混和液中加入25mg/ml的果胶溶液，搅拌38min，并于超声波下混合19min，得到混悬液，所述果胶溶液与步骤（1）中的乙醚的体积比为1.05:100；
（3）在混悬液中加入15mg/ml的过碳酸钠溶液，涡旋，并于13℃下超声波混合18min，得到混合搅拌液，所述过碳酸钠溶液与步骤（1）中的乙醚的体积比为1.06:100；
（4）在混合搅拌液中加入1.6mg/ml的氢氧化钙溶液，在12℃下搅拌9.5min,并于12℃下超声波混合19.5min，得到氢氧化钙溶液混和液，所述氢氧化钙溶液与步骤（1）中的乙醚的体积比为10.2:100；
（5）将氢氧化钙溶液混和液于3℃下，静置2.2h，涡旋，并于超声波下混合30min，得到低温混合物；
（6）将低温混合物放入圆底烧瓶内旋转蒸发，以去除乙醚，得到旋转蒸发产物；
（7）在旋转蒸发产物中加入超纯水，并于超声波下混合，得到旋转蒸发产物混合液，所述超纯水与步骤（1）中的乙醚的体积比为1.03:1；
（8）将旋转蒸发产物混合液倒入离心管中，加入超纯水，并于超声波下混合20min，再于温度为12.5℃、转速为5400r/min的条件下离心9min，取上层清液，即得所述产氧纳米脂质体。
实施例5
一种产氧纳米脂质体的制备方法，包括以下步骤：
（1）在三氯甲烷中加入大豆卵磷脂，涡旋，并于超声波下混合4.6min，得到混和液，每毫升三氯甲烷的混合溶剂中大豆卵磷脂的加入量为30mg；
（2）在混和液中加入25.5mg/ml的果胶溶液，搅拌42min，并于超声波下混合21min，得到混悬液，所述果胶溶液与步骤（1）中的三氯甲烷的体积比为1.04:100；
（3）在混悬液中加入15mg/ml的过碳酸钠溶液，涡旋，并于12℃下超声波混合20min，得到混合搅拌液，所述过碳酸钠溶液与步骤（1）中的三氯甲烷的体积比为1.09:100；
（4）在混合搅拌液中加入1.6mg/ml的氢氧化钙溶液，在12℃下搅拌10min,并于12℃下超声波混合20min，得到氢氧化钙溶液混和液，所述氢氧化钙溶液与步骤（1）中的三氯甲烷的体积比为10.5:100；
（5）将氢氧化钙溶液混和液于3℃下，静置2.6h，涡旋，并于超声波下混合29min，得到低温混合物；
（6）将低温混合物放入圆底烧瓶内旋转蒸发，以去除三氯甲烷，得到旋转蒸发产物；
（7）在旋转蒸发产物中加入超纯水，并于超声波下混合，得到旋转蒸发产物混合液，所述超纯水与步骤（1）中的三氯甲烷的体积比为1.07:1；
（8）将旋转蒸发产物混合液倒入离心管中，加入超纯水，并于超声波下混合22min，再于温度为12℃、转速为5600r/min的条件下离心8min，取上层清液，即得所述产氧纳米脂质体。
实施例1-实施例5制备得到的产氧纳米脂质体的粒度及电位测试结果如下表1所示：
实施例1-实施例5制备得到的产氧纳米脂质体于室温下的溶氧量随时间变化的测试结果如下表2所示：
表2
由上述性能测试结果可知本发明一种产氧纳米脂质体的制备方法，制备得到的产氧纳米脂质体的产氧量高，在室温下的有效的释放氧的时间高达55h～60h，在冷冻条件下可长期保存，性能稳定性高。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。